洪 翔，朱新雅，賈子樊，黃 晗，譚 旭，范曉光

(1.天津科技大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；3.天士力控股集團有限公司 健保食品開發(fā)中心，天津 300040)

利用重組枯草芽孢桿菌L-氨基酸連接酶合成丙谷二肽

洪 翔1,2，朱新雅1,2，賈子樊1,2，黃 晗2，譚 旭3，范曉光1,2

(1.天津科技大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；3.天士力控股集團有限公司 健保食品開發(fā)中心，天津 300040)

利用大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE 3)克隆并表達來源于枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC 15245的L-氨基酸連接酶(L-amino acid ligase，Lal)基因，采用Ni-NAT親和層析法分離純化得到重組的Lal，并以L-丙氨酸和L-谷氨酰胺為底物制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(丙谷二肽).Lal屬于ATP依賴酶，研究結(jié)果表明其最適反應(yīng)溫度和pH值分別為37 ℃和9.0，連續(xù)催化反應(yīng)14 h可催化等摩爾的底物氨基酸(30 mmol/L)生成22.4 mmol/L的丙谷二肽，最高摩爾轉(zhuǎn)化率可達74.7%.成功克隆表達了枯草芽孢桿菌的L-氨基酸連接酶，并將其應(yīng)用于丙谷二肽的酶法合成，研究結(jié)果可為丙谷二肽的生物制造奠定理論基礎(chǔ).

丙谷二肽；L-氨基酸連接酶；枯草芽孢桿菌；大腸桿菌；酶法合成

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(丙谷二肽)是由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺縮合形成的二肽，屬于氨基酸類的化學(xué)藥劑，也是國際公認的L-谷氨酰胺的最適載體.丙谷二肽的水溶性可以達到586 g/L，在體內(nèi)能夠迅速地分解為L-谷氨酰胺和L-丙氨酸，并能夠被有效地吸收和利用，因此常作為術(shù)后病人的必須營養(yǎng)注射液使用[1-2].目前，工業(yè)生產(chǎn)丙谷二肽的方法主要為化學(xué)法，但化學(xué)法反應(yīng)步驟繁瑣，路線較長且需要使用有毒的化學(xué)試劑[3-4].近年來，已有報道采用氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶催化L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺生成丙谷二肽，但由于底物L(fēng)-丙氨酸甲酯鹽酸鹽亦需要使用化學(xué)合成法進行制備，且反應(yīng)過程中會生成L-丙氨酰-丙氨酰-丙氨酸、L-丙氨酰-丙氨酸等副產(chǎn)物，導(dǎo)致該方法生產(chǎn)分離過程復(fù)雜，不利于工業(yè)化放大[5-7].2005年，日本科學(xué)家基于細菌中D-丙氨酰-D丙氨酸連接酶的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)，通過計算機模擬最終從枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC 15245中發(fā)現(xiàn)了一種L-氨基酸連接酶，該酶具有以無保護的氨基酸為底物合成二肽的能力[8].因此，筆者利用大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE 3)克隆并表達來源于枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC 15245的L-氨基酸連接酶基因，通過Ni-NAT親和層析法分離純化，將其應(yīng)用于丙谷二肽的酶法合成中，并對反應(yīng)條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，以期為丙谷二肽的生物制造奠定理論基礎(chǔ)，同時為其他二肽的生產(chǎn)技術(shù)改進提供借鑒.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliDH5α、大腸桿菌E.coliBL21(DE 3)以及質(zhì)粒pET-His (Ampr)均由本實驗室保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min.

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物回收及質(zhì)粒提取試劑盒購于北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(丙谷二肽)和L-丙氨酰-L-丙氨酸標(biāo)品購于美國Sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 質(zhì)粒pETHis-Lal的構(gòu)建

根據(jù)Genbank上B.subtilisATCC 15245的氨基酸連接酶編碼基因序列，用大腸桿菌中常用的密碼子軟件對其進行密碼子優(yōu)化，使其可以在大腸桿菌中高效轉(zhuǎn)錄.將優(yōu)化后的序列送到金唯智公司進行合成，得到帶有氨基酸連接酶編碼基因的重組質(zhì)粒pUC57-Lal.

利用引物(上游引物：CGGGATCCGAGCGCAAAACAGTTCTGGTTA和下游引物：CCCAAGCTTTTACACCGGCAGAACATATTTG)以及ExTaq PCR試劑盒擴增氨基酸連接酶編碼基因.PCR條件為95 ℃ 5 min 1 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min 1 個循環(huán).反應(yīng)體系為50 μL，PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1.5%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收.

目的產(chǎn)物回收后經(jīng)HindIII和BamHI酶切、電泳和切膠回收后連接至經(jīng)相同酶切的表達載體pETHis并化學(xué)轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中.LB培養(yǎng)基活化后涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上.過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落利用引物進行PCR驗證，陽性菌株接入含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒進行酶切驗證.將驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pETHis-Lal.

1.3E.coliBL21-Lal的構(gòu)建

取適宜濃度的質(zhì)粒pETHis-Lal化學(xué)轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，在Super optimal broth with catabolite repression (SOC)中活化后涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h.挑取單菌落活化后提取質(zhì)粒并分別利用引物進行酶切驗證.將驗證正確的重組菌株命名為E.coliBL21-Lal，保存至甘油管中備用.

1.4 菌體培養(yǎng)

將E.coliBL21-Lal以0.1%(體積分數(shù))接種量接種至100 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，再按1%(體積分數(shù))接種量轉(zhuǎn)接至400 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.7時添加終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h.結(jié)束后7 000 r/min 離心10 min去上清，生理鹽水洗滌菌體2 次，-80 ℃凍存.

1.5 氨基酸連接酶Lal的純化

1.5.1 菌體處理

1) 離心收集50 mL發(fā)酵液中的菌體，用8 mL的平衡緩沖液重懸并加入適量的苯甲基黃酰氟(PMSF)或其他對鎳柱性能沒有影響的蛋白酶抑制劑.

2) 高強度的超聲破碎1 s/3 s，180 次循環(huán)

3) 可選步驟，如果裂解液太稠，加入RNaseA (10 μg/mL)和DNase I (5 μg/mL)，冰上孵育10～15 min.

4) 裂解液10 000 g/min離心15 min獲得蛋白上清液.

1.5.2 鎳柱預(yù)處理

1) 輕輕地把瓶子顛倒幾次，使樹脂完全懸浮.

2) 用移液管將鎳樹脂漿轉(zhuǎn)移至適當(dāng)體積的柱子中，讓樹脂沉淀并將儲存緩沖液從柱中排出.

3) 用4倍柱床體積的平衡緩沖液使樹脂平衡，或直到A280穩(wěn)定.

1.5.3 上樣及洗脫

1) 將蛋白上清液以0.5～1 mL/min的流速通過鎳柱用于吸附帶His標(biāo)簽的蛋白，定時收集并保存流出液用于分析.

2) 上樣結(jié)束后以1 mL/min流速加入8倍柱床體積的清洗緩沖液，直到A280穩(wěn)定.

3) 以1 mL/min流速用5～10倍體積的洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液，根據(jù)蛋白的特性，用10 mmol/L pH為8的Tris-HCl或pH為7.4的PBS緩沖液透析.

1.6 酶催化反應(yīng)體系

10 mL催化反應(yīng)體系如下：丙氨酸(Ala)30 mmol/L，谷氨酰胺(Gln)30 mmol /L，Mg2+30 mmol/L，ATP 30 mmol/L，不同pH值的Tris-Hcl緩沖液100 mmol/L以及純化后的L-氨基酸連接酶0.2 mg/mL.

1.7 丙谷二肽的檢測

采用氨基酸分析儀檢測反應(yīng)液中丙谷二肽的含量，其保留時間為24.2 min.

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pETHis-Lal的構(gòu)建

根據(jù)Genbank上B.subtilisATCC 15245的氨基酸連接酶編碼基因序列，用大腸桿菌中常用的密碼子軟件對其進行密碼子優(yōu)化.合成獲得目的片段經(jīng)切膠回收并利用Hind III和BamHI酶切后連接至經(jīng)相同酶切的表達載體pET-His上，獲得重組質(zhì)粒pETHis-Lal，然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中獲得重組菌株E.coliBL21-Lal.提取重組質(zhì)粒，利用Hind III和BamHI雙酶切驗證.結(jié)果如圖1所示，經(jīng)Hind III和BamHI雙酶切獲得分子量約為2 900 bp及1 400 bp的片段，與pETHis和目的基因的片段分子量接近，證明目的基因已成功連接到表達載體上.

M—Marker；1—目的基因片段；2—pETHis使用Hind III單酶切；3—pETHis-Lal使用Hind III單酶切；4—pETHis-Lal使用Hind III/BamH I雙酶切圖1 重組質(zhì)粒pETHis-Lal的酶切驗證圖譜Fig.1 Identification of recombinant plasmids pETHis-Lal digested by restricted endonuclease

2.2 L-氨基酸連接酶的表達及純化

將構(gòu)建菌株E.coliBL21-Lal接種于400 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=0.7時添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h后收集部分菌體并超聲破碎后進行SDS-PAGE.經(jīng)考馬斯亮藍染色后結(jié)果如圖2中1，2泳道所示.E.coliBL21-Lal菌體破碎液及上清液中均出現(xiàn)一條分子量約53 kD的條帶，與文獻報道的攜帶六個組氨酸標(biāo)簽的L-氨基酸連接酶分子量(53 kD)一致[8]，表明來自于枯草芽孢桿菌的目的蛋白可以在大腸桿菌中可溶性表達且表達量較高.

M—Marker；1—對照組E. coli BL21菌體破碎上清液;2—E. coli BL21-Lal菌體破碎上清液；3—E. coli BL21-Lal菌體破碎上清液通過鎳柱后的流出液；4,5,6—洗脫的目的蛋白圖2 重組L-氨基酸連接酶的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant L-amino acid ligase

將剩余菌體破碎液離心后去上清液并采用Ni-NTA親和層析方法分離純化重組的L-氨基酸連接酶，經(jīng)透析、濃縮、SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色后出現(xiàn)分子量約為53 kD的單一條帶，如圖2中6泳道所示，經(jīng)測定其質(zhì)量濃度為4 mg/mL，表明該蛋白純化效果理想，可以用于后續(xù)酶催化實驗.

2.3 重組L-氨基酸連接酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物分析

采用氨基酸分析儀對丙谷二肽標(biāo)準(zhǔn)品以及重組L-氨基酸連接酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物進行分析，結(jié)果如圖3所示.標(biāo)準(zhǔn)品和重組L-氨基酸連接酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物均出現(xiàn)保留時間為23.1 min的色譜峰.但圖3(b)中還出現(xiàn)保留時間為10.1，17.8，28.3 min的色譜峰，分別對應(yīng)的物質(zhì)為L-谷氨酰胺、L-丙氨酸和L-丙氨酰-丙氨酸.因此說明L-氨基酸連接酶可以催化L-丙氨酸和L-谷氨酰胺形成丙谷二肽，但同時會有少量副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酰-L-丙氨酸的生成.

(a) 丙谷二肽標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

(b) 酶催化產(chǎn)物色譜圖圖3 丙谷二肽標(biāo)準(zhǔn)品及重組L-氨基酸連接酶的反應(yīng)產(chǎn)物的色譜圖Fig.3 Chromatography of L-Ala-L-Gln standard and product catalyzed by L-amino acid ligase

2.4 重組L-氨基酸連接酶催化反應(yīng)條件的優(yōu)化

將純化的L-氨基酸連接酶Lal加入含有30 mmol/L的L-丙氨酸，30 mmol/L的L-谷氨酰胺，30 mmol/L的ATP及30 mmol/L的MgSO4的反應(yīng)體系中，在 pH 9.0，不同溫度條件下進行酶催化反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知：Lal的活性隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達到37 ℃時其活性最高，產(chǎn)物丙谷二肽的濃度也達到最大值；溫度超過37 ℃時，Lal的活性迅速降低，產(chǎn)物丙谷二肽的濃度也隨之減少.

圖4 溫度對酶催化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of temperature on enzymatic reaction

在最優(yōu)的反應(yīng)溫度(37 ℃)下，考察不同pH值對酶催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示.由圖5可知：pH為9.0時，Lal的活性最高，產(chǎn)物丙谷二肽的濃度也達到最大值；當(dāng)pH高于或低于7.0時，隨著pH的偏離，Lal的活性急劇下降，產(chǎn)物丙谷二肽的濃度也隨之減少.

圖5 pH對酶催化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of pH on enzymatic reaction

在最優(yōu)的反應(yīng)溫度(37 ℃)和反應(yīng)pH值(9.0)下，考察不同底物濃度對酶催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如表1所示.當(dāng)反應(yīng)體系中不添加ATP時，無丙谷二肽生成，說明Lal屬于ATP依賴酶，且隨著反應(yīng)體系中ATP濃度的增加，丙谷二肽的產(chǎn)量呈現(xiàn)上升趨勢.從反應(yīng)機理上來看，Lal屬于羧酸鹽-胺/硫醇連接酶超家族，反應(yīng)時需使用ATP上的高能磷酸鍵形成活性中間體?；?磷酸鹽[9-10].過量的L-丙氨酸或L-谷氨酰胺均不利于丙谷二肽的合成，過量的L-丙氨酸會形成L-丙氨酰-L丙氨酸(丙丙二肽)，而過量的L-谷氨酰胺由于自身性質(zhì)不穩(wěn)定，在堿性環(huán)境中會緩慢降解成谷氨酸，因此選擇等摩爾的底物進行反應(yīng)有利于丙谷二肽的生成.從表1中還可以看出：在固定的酶添加量(0.2 mg/mL)條件下，隨著底物濃度的增加，丙谷二肽的摩爾轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，說明Lal對不同氨基酸的催化能力不同，高濃度的底物氨基酸會競爭性地與Lal結(jié)合，從而影響目標(biāo)產(chǎn)物丙谷二肽的生成.

表1 不同底物濃度對酶催化反應(yīng)的影響Table 1 Effect of different substrates concentrations on enzymatic reaction mmol/L

3 結(jié) 論

L-丙氨酸-L-谷氨酰胺(丙谷二肽)是市場應(yīng)用前景廣闊的二肽類物質(zhì)，已被多個國家批準(zhǔn)作為藥物使用，然而目前的生產(chǎn)技術(shù)存在生產(chǎn)過程復(fù)雜、原料成本高和有毒試劑使用等不足.L-氨基酸連接酶的發(fā)現(xiàn)使得丙谷二肽的生物合成成為可能.筆者以常用表達系統(tǒng)pETHis和E.coliBL21(DE 3)過表達來自枯草芽孢桿菌B.subtilisATCC 15245中的L-氨基酸連接酶基因，并通過對密碼子優(yōu)化實現(xiàn)了重組酶的大量可溶性表達.在最優(yōu)的酶催化反應(yīng)條件即溫度為37℃，pH為9.0時，使用0.2 mg/mL純化后的L-氨基酸連接酶可以催化30 mmol/L的L-丙氨酸和30 mmol/L的L-谷氨酰胺生成22.4 mmol/L的丙谷二肽，最高摩爾轉(zhuǎn)化率可達74.7%.雖然丙谷二肽實現(xiàn)了生物合成，但其轉(zhuǎn)化效率仍有大幅度提高的空間.增加丙谷二肽的積累一方面取決于L-氨基酸連接酶的活性，今后可嘗試采用定點突變的方法，獲得對底物L(fēng)-谷氨酰胺親和力更高的突變體；另一方面取決于副產(chǎn)物丙丙二肽的積累量，今后可嘗試采用流加的方式進行酶催化反應(yīng)，通過控制流加濃度和流加速率減少副產(chǎn)物的積累.在上述研究的基礎(chǔ)上，最終獲得適用于丙谷二肽生物合成的酶制劑及酶催化方式.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Enzymatic synthesis of L-alanyl-L-glutamine by L-amino acid ligase fromBacillussubtilis

HONG Xiang1,2, ZHU Xinya1,2, JIA Zifan1,2, HUANG Han2, TAN Xu3, FAN Xiaoguang1,2

(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457, China; 3. Nutraceutical Research Division, Tasly Holding Group Co., Ltd., Tianjin 300040, China)

L-amino acid ligase (Lal) gene fromBacillussubtilisATCC 15245 was cloned and expressed inEscherichiacoliBL21(DE 3). The recombinant Lal was purified by Ni-NAT. L-alanyl-L-glutamine was synthesized by purified Lal using L-alanine and L-glutamine as the substrate. Lal is an ATP-dependent enzyme, the results showed that the optimal reaction temperature and pH value of Lal was 37 ℃ and 9.0, respectively. 30 mmol/L amino acids substrate was converted into 22.4 mmol/L L-alanyl-L-glutamine by 14 h continuous catalytic reaction, the maximum molar yield reached 74.7%. In this study, Lal fromBacillussubtilisATCC 15245 was successfully expressed and applied to L-alanyl-L-glutamine production. The results can lay theoretical foundation for the bio-manufacturing of L-alanyl-L-glutamine.

L-alanyl-L-glutamine; L-amino acid ligase;Bacillussubtilis;Escherichiacoli; enzymatic synthesis

2017-05-03

工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室(天津科技大學(xué))開放基金資助項目(2016IM101)

洪 翔(1991—)，男，江西九江人，碩士研究生，研究方向為酶法合成丙谷二肽，E-mail：kdhongxiang@163.com.

Q78

A

1674-2214(2017)02-0083-05