蘇 鳳，孫子晴，肖欽欽，梁現(xiàn)蕊

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

ESI-Q-TOF-MS/MS用于碳青霉烯類抗生素及其中間體質(zhì)譜裂解機(jī)理研究

蘇 鳳1,2，孫子晴1,2，肖欽欽1,2，梁現(xiàn)蕊1,2

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

采用電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS/MS)，在正離子模式下，對(duì)美羅培南等碳青霉烯類抗生素及其合成中間體共8種化合物的裂解規(guī)律進(jìn)行了探討.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示碳青霉烯類抗生素在該質(zhì)譜條件下易形成[M+H]+離子，其合成中間體則易觀察到[M+Na]+離子.該8種化合物裂解途徑相似，主要為分子內(nèi)脫羧基反應(yīng)、四元內(nèi)酰胺環(huán)裂解反應(yīng)及側(cè)鏈結(jié)構(gòu)中C—S鍵的裂解反應(yīng).

碳青霉烯類抗生素；電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS/MS)；裂解規(guī)律

1976年，默克公司的科學(xué)家在篩選能作用于細(xì)胞壁生物合成的抑制劑過程中，從卡特利鏈霉菌(Streptomycescattleya)發(fā)酵液中分離得到一種具有廣譜、強(qiáng)力抗菌活性的碳青霉烯類抗生素硫霉素(thienamycin)，在隨后的幾十年里，人們通過對(duì)硫霉素的結(jié)構(gòu)改造，陸續(xù)開發(fā)出一系列碳青霉烯類抗生素，它是治療危重感染的常用抗菌藥物之一[1].近年來，運(yùn)用膠束毛細(xì)管電泳色譜法[2]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法[3]和高效液相色譜法[4-7]等對(duì)碳青霉烯類抗生素厄他培南、美羅培南等及其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了廣泛的研究.質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS，GC-MS等)技術(shù)已成為快速、準(zhǔn)確鑒定藥物中雜質(zhì)的較佳方法[8-14]，在藥物定性鑒別、雜質(zhì)研究、體內(nèi)代謝物研究和中藥復(fù)雜組分分析等領(lǐng)域都發(fā)揮著越來越重要的作用.目前常用的質(zhì)譜技術(shù)主要有高分辨率質(zhì)譜(HRMS)和多級(jí)質(zhì)譜(MSn).對(duì)于HRMS，以飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜為例，因其可以提供精確到小數(shù)點(diǎn)后4～6位的相對(duì)分子質(zhì)量，使得儀器分辨率和相對(duì)分子質(zhì)量的精確度得到提高，同時(shí)也可以獲得相應(yīng)碎片離子的元素組成及分子式.由于高分辨質(zhì)譜的精確性，使得其在化合物結(jié)構(gòu)鑒定方面有著較廣泛的應(yīng)用[15-19].MSn可以提供豐富的碎片離子信息以及裂解信息，利用得到的數(shù)據(jù)可以推測(cè)出藥物及其雜質(zhì)的裂解模式，進(jìn)而結(jié)合已有的知識(shí)鑒定出未知化合物的結(jié)構(gòu)，在雜質(zhì)分析和控制方面具有重要作用.

目前已有關(guān)于碳青霉烯類抗生素美羅培南、厄他培南雜質(zhì)譜裂解機(jī)理的報(bào)道[20-23]，但未見對(duì)該類抗生素及其相關(guān)合成中間體質(zhì)譜裂解規(guī)律的系統(tǒng)總結(jié).對(duì)厄他培南、美羅培南、比阿培南和多尼培南及其4種合成中間體(保護(hù)美羅培南、MAP、4AA水解物和4AA氧化物)進(jìn)行ESI-ITMSn，ESI-QTOF-MS/MS分析和研究，發(fā)現(xiàn)了該類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，為碳青霉烯類抗生素及其有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析和定量分析提供科學(xué)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

Micro TOF QⅡ質(zhì)譜儀，德國Bruker公司：配有電噴霧(ESI)離子源，Compass數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣器.

乙腈(HPLC純)，德國Merck公司；質(zhì)譜校正液(CF3COONa)，阿拉丁試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水，自制超純水；樣品溶液配制，分別取少量厄他培南、美羅培南、比阿培南、多尼培南、MAP、保護(hù)美羅培南、4AA水解物和4AA氧化物用一定比例的水-乙腈-10%甲酸的混合溶液溶解樣品后進(jìn)樣.碳青霉烯類抗生素結(jié)構(gòu)式為8種碳青霉烯類抗生素及其合成中間體化合物均由浙江海翔制藥有限公司提供，純度99%以上，其結(jié)構(gòu)式如表1所示.

表1 碳青霉烯類抗生素及其合成中間體的結(jié)構(gòu)Table 1 The structures of carbapenems antibiotics and its synthetic intermediates

1.2 質(zhì)譜分析條件

電噴霧(ESI)離子源；ESI源電壓500 V；毛細(xì)管電壓4 500 V；霧化氣體液氮；霧化氣壓力0.4 Bar；氮?dú)鉁囟?80 ℃；氮?dú)饬魉?.0 L/min；碰撞氣體氬氣；進(jìn)樣速度180 μL/h；在正離子模式下先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，m/z為50～1 500，再將得到的待測(cè)物的準(zhǔn)分子離子[M+H]+或[M+Na]+作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，以用于化合物裂解規(guī)律的研究.

2 結(jié)果與討論

2.1 8種化合物的一級(jí)全掃描質(zhì)譜

采用電噴霧離子源，在正離子檢測(cè)模式下，對(duì)8種化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，檢測(cè)結(jié)果列于表2.其中4種碳青霉烯類抗生素易觀察到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，而4種碳青霉烯類抗生素的合成中間體不易形成[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰，而易得到[M+Na]+準(zhǔn)分子離子峰.

表2 8種化合物的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)

Table 2 The MS data of carbapenems antibiotics and its synthetic intermediates

化合物編號(hào)測(cè)量值m/z元素組成理論值m/z誤差/10-61476．1485C22H26N3O7S476．14860．32384．1621C17H26N3O5S384．1588-8．73351．1135C15H19N4O4S351．1122-3．94421．1230C15H25N4O6S2421．1210-4．85720．1958C32H35N5NaO11S720．1946-1．76617．1290C29H27N2NaO10P617．12960．87402．1714C19H29NNaO5Si402．1707-1．88416．1878C20H31NNaO5Si416．1864-3．5

2.2 化合物1～6的MS/MS分析及裂解規(guī)律研究

對(duì)化合物1～6的準(zhǔn)分子離子進(jìn)行MS/MS分析，所得到的主要產(chǎn)物離子的精確質(zhì)量數(shù)如表3所示，該6種化合物因結(jié)構(gòu)中都具有碳青霉烯類抗生素的母環(huán)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出了相似的裂解途徑.

表3 化合物1～6的[M+H]+離子在ESI-Q-TOF-MS/MS譜圖中的主要產(chǎn)物離子Table 3 Major product [M+H]+ions from ESI-Q-TOF-MS/MS spectrum of compounds 1～6

注：1) [M+Na]+ion；2) [M+Na—CO2]+ion；3) [M+Na—C4H6O2]+ion；4) [M+Na—R2+H]+ion；5) [R2—H+Na]+ion；6) [HXR2+Na]+ion.

厄他培南[M+H]+準(zhǔn)分子離子(m/z=476)在正離子模式下，所得到的MS/MS掃描圖可看到4種主要碎片離子：m/z為432，390，346和233，同時(shí)還可以看到一些相對(duì)豐度較低的碎片離子m/z為267，200，181和114.準(zhǔn)分子離子m/z=432與準(zhǔn)分子離子m/z=476相比減少了44 u，該子離子可能是由母核上的羧基發(fā)生脫羧反應(yīng)失去一分子CO2所得到.離子m/z=390與準(zhǔn)分子離子m/z=476相比減少了86 u，該碎片離子的形成可能是因四元內(nèi)酰胺環(huán)發(fā)生[2,2]逆Diels-Alder反應(yīng)而產(chǎn)生的，包含酰胺鍵斷裂和C5—C6單鍵的斷裂.離子m/z=346可能是由離子m/z=390再發(fā)生脫羧反應(yīng)失去一分子CO2得到，該中間體側(cè)鏈R2基團(tuán)如果發(fā)生酰胺鍵斷裂脫去一分子對(duì)氨基苯甲酸后，再脫去一分子CO即生成離子m/z=181.離子m/z=114的形成可分a，b和c三種途徑：途徑a為[M+H]+(m/z=476)準(zhǔn)分子離子先脫去一分子CO2，再脫去側(cè)鏈，最后失去86 u形成；途徑b為[M+H]+(m/z=476)準(zhǔn)分子離子先失去一分子C4H6O2(相對(duì)分子質(zhì)量86 u)，再脫去一分子CO2(相對(duì)分子質(zhì)量44 u)，最后脫去側(cè)鏈形成；途徑c為[M+H]+準(zhǔn)分子離子發(fā)生母核與側(cè)鏈之間的斷裂，形成側(cè)鏈互補(bǔ)離子對(duì)m/z=233和m/z=244，而離子m/z=244易再脫去一分子CO2形成較穩(wěn)定的m/z=200離子峰.離子m/z=200再失去一分子C4H6O2得到離子m/z=114.對(duì)于子離子m/z=267，其并未得到一個(gè)確定的分子組成，說明該信號(hào)可能是由(Ⅰ)，(Ⅱ)元素組成不同的兩種離子混合而成的.美羅培南因側(cè)鏈結(jié)構(gòu)與厄他培南相差較小，其[M+H]+的裂解途徑與厄他培南相似，不同的是其m/z=267離子有確定的元素組成(Ⅰ)，化合物1，2 [M+H]+的可能的裂解途徑為

比阿培南和多尼培南[M+H]+的裂解途徑稍有不同，主要區(qū)別在于比阿培南側(cè)鏈結(jié)構(gòu)中的氮雜雙環(huán)結(jié)構(gòu)易發(fā)生C—N鍵斷裂脫去一個(gè)三氮五元雜環(huán)，其[M+H]+可能的裂解途徑為

保護(hù)美羅培南[M+Na]+準(zhǔn)分子離子(m/z=720)二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子主要有m/z為342，634，203，481，247和136.子離子m/z=634與相對(duì)豐度較低的子離子m/z=676的斷裂與厄他培南相似，分別由準(zhǔn)分子離子m/z=720失去一分子CO2和C4H6O2得到.離子m/z=634再發(fā)生酯基C—O單鍵斷裂脫去一分子對(duì)硝基苯甲醇生成離子m/z=481.[M+Na]+準(zhǔn)分子離子再經(jīng)厄他培南途徑c發(fā)生母核與側(cè)鏈之間的斷裂，形成側(cè)鏈互補(bǔ)離子對(duì)m/z=342和m/z=401.離子m/z=247是由離子m/z=342先脫去一分子NH(CH3)2后，再脫去一分子CO后所得，在這個(gè)過程中同時(shí)發(fā)生了Na-H交換.離子m/z=247失去一分子CO2得到離子m/z=203，然后再丟掉氮雜環(huán)后形成離子m/z=136.

MAP[M+Na]+準(zhǔn)分子離子(m/z=720)二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子主要有m/z=531，m/z=356和一些相對(duì)豐度較低的碎片離子.離子m/z=378可能是由MAP[M+Na]+準(zhǔn)分子離子先失掉C4H6O2生成離子m/z=531，該中間體再發(fā)生酯基C—O單鍵斷裂脫去一分子對(duì)硝基苯甲醇所得.離子m/z=573可能是由準(zhǔn)分子離子m/z=720脫去一分子CO2而得到，該中間體可再連續(xù)脫去一分子NO2、一分子苯酚和苯正離子后得到離子m/z=356，該離子再丟失一分子CO后生成離子m/z=328.另一方面，離子m/z=573也可先脫去一分子對(duì)硝基甲苯形成離子m/z=436，再脫去一分子CO2后形成m/z=408.而m/z=215離子的形成可分三種途徑，都為失去一分子CO2，一分子C4H6O2和碎片離子m/z=273，同時(shí)也發(fā)生了Na-H交換反應(yīng)，只是裂解順序不同而已.MAP[M+Na]+可能的裂解途徑為

2.3 化合物7,8的[M+Na]+MS/MS分析及裂解規(guī)律研究

對(duì)4AA氧化物[M+Na]+準(zhǔn)分子離子(m/z=416)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，也得到豐富的碎片離子峰.[M+Na]+準(zhǔn)分子離子四元內(nèi)酰胺環(huán)上C-4位乙酰氧基可能產(chǎn)生Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ四種斷裂方式.途徑Ⅰ為四元內(nèi)酰胺環(huán)上C-4位發(fā)生脫乙酰氧基反應(yīng)，若O與鄰位H結(jié)合，則丟掉一分子乙酸形成離子m/z=356，若與Na結(jié)合，則丟掉一分子乙酸鈉形成離子m/z=334，而m/z=334碎片離子由于C-3位基團(tuán)上雜原子O的強(qiáng)電負(fù)性易使分子內(nèi)發(fā)生電子重排反應(yīng)生成離子m/z=159.途徑Ⅱ?yàn)樵谒脑獌?nèi)酰胺環(huán)上C-4位乙酰氧基上發(fā)生甲基重排脫去一分子CO，再發(fā)生H重排脫去一分子HCHO后，再脫去1-叔丁基-二甲基-硅醇，四元內(nèi)酰胺環(huán)內(nèi)發(fā)生脫羰基反應(yīng)，最后生成離子m/z=198.途徑Ⅲ為在四元內(nèi)酰胺環(huán)上C-4位乙酰氧基上發(fā)生酯基C—O鍵斷裂失去一分子CH2=C=O，脫去1-叔丁基-二甲基-硅醇，脫去苯甲基醚等連續(xù)斷裂反應(yīng)形成離子m/z=134.途徑Ⅳ為C-4位乙酰氧基發(fā)生分子內(nèi)重排后脫去一分子CO2，該中間體四元內(nèi)酰胺環(huán)的支鏈乙基再發(fā)生C—O鍵斷裂后，若O與鄰位H結(jié)合，則丟掉1-叔丁基-二甲基-硅醇后生成離子m/z=240，若與Na結(jié)合，則丟掉1-叔丁基-二甲基-硅醇鈉形成m/z=218.4AA氧化物[M+Na]+可能裂解途徑為

4AA水解物[M+Na]+的裂解方式與4AA氧化物相似，不同的是4AA水解物可發(fā)生四元內(nèi)酰胺環(huán)C2—N1和C3—C4鍵斷裂而開環(huán)形成碎片離子m/z=202.4AA水解物和4AA氧化物[M+Na]+MS/MS產(chǎn)生的主要碎片離子的分子式、精確質(zhì)量數(shù)和誤差如表4所示.

表4 化合物7,8的[M+Na]+離子在ESI-Q-TOF-MS/MS譜圖中的主要產(chǎn)物離子Table 4 Major product [M+Na]+ ions from ESI-Q-TOF-MS/MS spectrum of compounds 7, 8

3 結(jié) 論

筆者應(yīng)用電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS/MS)技術(shù)，研究了幾種典型的碳青霉烯類抗生素及其合成中間體的裂解途徑.發(fā)現(xiàn)該類抗生素在正離子檢測(cè)模式下，主要以[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰形式存在，而其合成中間體主要以[M+Na]+準(zhǔn)分子離子峰形式存在.二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：無論該類化合物以何種準(zhǔn)分子離子形式存在，其二級(jí)質(zhì)譜裂解方式都具有相似的裂解途徑或模式，主要為分子內(nèi)脫羧基反應(yīng)(途徑C)、四元內(nèi)酰胺環(huán)裂解反應(yīng)(途徑A)及側(cè)鏈結(jié)構(gòu)中C—S鍵的裂解(途徑B)反應(yīng).

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Fragmentation pathways of carbapenems antibiotics and their intermediates using electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry

SU Feng1,2, SUN Ziqing1,2, XIAO Qinqin1,2, LIANG Xianrui1,2

(1. Collaborative Innovation Center of Green Pharmaceuticals, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；2. College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

The fragmentation pathways of carbapenem antibiotics and their intermediates were investigated by electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (ESI-Q-TOF-MS/MS) in positive mode. The experimental results showed that carbapenem antibiotics gave the prominent [M+H]+ions, while the intermediates yielded prominent [M+Na]+ions. All the eight compounds shared similar cleavage pathways, which involved the decarboxylation reaction, [2,2]-trans-Diels-Alder cleavage within the quaternary lactam ring, and the carbon-sulphur bond cleavage reaction.

carbapenems antibiotics; electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry (ESI-Q-TOF MS/MS); fragmentation pathways

2017-03-23

蘇 鳳(1983—)，女，浙江臨安人，研究實(shí)習(xí)員，研究方向?yàn)樗幬锝Y(jié)構(gòu)鑒定以及雜質(zhì)分離分析，E-mail：sufeng@zjut.edu.cn.

R248.1

A

1674-2214(2017)02-0070-07