李 靜 王學富

(安徽醫(yī)科大學，合肥230032)

肝臟靶向表達趨化因子CXCL10抑制ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷①

李 靜 王學富

(安徽醫(yī)科大學，合肥230032)

目的：本研究探索趨化因子CXCL10在免疫介導(dǎo)的肝臟損傷方面的作用及其作用機制。方法：尾靜脈高壓注射CXCL10表達載體72 h后檢測肝臟中CXCL10的表達水平；再尾靜脈注射刀豆蛋白(Concanavalin A，ConA)誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的肝臟損傷；檢測并比較CXCL10表達組和對照組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)水平、組織損傷水平、IFN-γ水平、TNF-α水平及調(diào)節(jié)性T細胞比例和數(shù)量的差異。結(jié)果：CXCL10表達載體注射72 h后，肝臟中CXCL10的表達水平顯著升高；CXCL10表達質(zhì)粒預(yù)處理可以有效減輕ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷，CXCL10表達組小鼠血清中的ALT水平顯著低于對照組， CXCL10表達組小鼠血清中IFN-γ和TNF-α的水平明顯低于對照組，CXCL10表達組小鼠肝臟中調(diào)節(jié)性T細胞比例和數(shù)量高于對照組。結(jié)論：趨化因子CXCL10表達載體預(yù)處理可減少炎性細胞因子并減輕ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷，對治療免疫介導(dǎo)的肝炎具有重要意義。

刀豆蛋白A；肝臟損傷；CXCL10；炎性細胞因子

趨化因子是介導(dǎo)免疫細胞定向遷移和歸巢的重要分子。不同的免疫反應(yīng)會產(chǎn)生特定的趨化因子，同時各種免疫細胞亞群表達特定的趨化因子受體，因此，應(yīng)答部位通過產(chǎn)生特異性的趨化因子招募特異性的免疫細胞介導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答。CXCL10屬于CXC趨化因子亞家族，由包括IFN-γ在內(nèi)的多種致炎性分子刺激內(nèi)皮細胞、肝實質(zhì)細胞、免疫細胞等產(chǎn)生[1]。CXCL10受體CXCR3主要表達在CD4+T細胞、CD8+T細胞、NKT細胞和NK細胞等細胞上[2]。 CXCL10在抗病毒和抗腫瘤中發(fā)揮著重要作用[3]，但目前對CXCL10在抗炎癥方面的功能尚未有太多報道。本課題通過構(gòu)建并高壓注射CXCL10表達載體使其在肝臟中靶向表達，同時觀察此預(yù)處理對免疫介導(dǎo)的肝臟損傷的影響，研究CXCL10在抗炎方面的作用，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1小鼠 6～8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠，體重19～21 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級動物房， 室溫為18～23℃，濕度為40%～60%，每籠5只，可自由飲水攝食。實驗亦在SPF級動物實驗室進行。

1.1.2試劑 刀豆蛋白A Ⅳ型(ConA)、Percoll(美國Sigma 公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；FITC-CD25、PE-CD4、Percp-CY5.5-NK1.1、APC-Foxp3等抗體(美國eBioscience公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司)；IFN-γ和TNF-α酶聯(lián)檢測試劑盒(深圳達科為公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)；SYBR GreenⅠmix (TaKaRa公司)；實時熒光定量PCR引物由上海生工合成，CXCL10 P1：CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC，P2：GGCTCGCAGGGATGATTTCAA；GAPDH P1：CAACTGGTCGTGGACAACCAT，P2：GCACGGACACTCACAATGTTC；其他試劑均為國藥集團市售分析純。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒高壓注射 將20只C57BL/6小鼠分為CXCL10表達質(zhì)粒注射組和空質(zhì)粒注射組，每組各10只。將CXCL10表達質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別溶于無菌生理鹽水中，按照每只鼠10 μg/2 ml的劑量分別經(jīng)尾靜脈高壓注射。注射之后，觀察小鼠的狀態(tài)，等待其恢復(fù)正常之后放回飼養(yǎng)籠內(nèi)。高壓注射72 h后取肝臟組織，檢測肝臟組織中CXCL10的表達量，比較兩者的差異。

1.2.2實驗?zāi)Ｐ徒?將60只C57BL/6小鼠分為CXCL10表達質(zhì)粒注射組和空質(zhì)粒注射組，每組各30只。注射72 h后，60只小鼠經(jīng)尾靜脈按照10 mg/kg(體重)的劑量注射ConA，6、12和24 h后，收集小鼠血清和肝組織[4]。血清用于檢測ALT、IFN-γ、TNF-α的水平，肝組織用于免疫細胞亞群檢測和組織病理的觀察。

1.2.3實時熒光定量PCR CXCL10高壓注射 72 h 后，取肝臟組織，用Trizol提取法提取 RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR分析。PCR反應(yīng)體系為20 μl： 10 μl Sybergre-en Mix(2×) +2 μl cDNA+1 μl primers mix+7 μl ddH2O。PCR程序為兩步法：94℃ 5 min，(94℃ 15 s+58℃ 20 s，共35個循環(huán))。實驗完成后進行相對定量分析。

1.2.4ALT檢測 按照試劑盒說明書進行操作。將血清進行稀釋后加入96孔板中，加入基質(zhì)液混勻，同時制作標準曲線；37℃孵育30 min后加入2,4二硝基苯肼混勻；37℃孵育20 min后加入0.4 mol/L NaOH終止反應(yīng)，通過酶標儀檢測吸光值。

1.2.5酶聯(lián)免疫檢測 按照試劑盒說明書進行操作。將血清和標準品分別加入反應(yīng)孔中，37℃孵育2 h后洗板；加入一抗，37℃孵育1 h后洗板；再加入二抗，37℃孵育1 h后洗板；加入反應(yīng)底物，根據(jù)顏色變化適時終止顯色，通過酶標儀檢測吸光值。

1.2.6組織病理分析 ConA處理12 h后收集的肝組織固定于福爾馬林中，再流水沖洗過夜，經(jīng)過脫水包埋，制成石蠟組織塊，再進行組織切片、脫蠟水化、染色，最后進行脫水、透明、封片、拍照。通過HE染色觀察肝組織的損傷情況。

1.2.7免疫細胞亞群分析 ConA處理12 h后收集的肝組織，過200目篩網(wǎng)進行研磨，冰上沉降10 min 后，吸取上清至50 ml離心管，2 000 r/min離心10 min，去上清收集沉淀，40% Percoll重懸沉淀加于70%Percoll上，2 400 r/min離心30 min，取中間層的細胞，PBS洗2次后計數(shù)。取適量細胞大鼠血清封閉，標記FITC-CD4、PE-NK1.1、Percp-CY5.5-CD8、APC-CD3用于檢測肝臟淋巴細胞亞群，標記FITC-CD25、PE-CD4、Percp-CY5.5-NK1.1外標抗體，再標記APC-Foxp3內(nèi)標抗體用于檢測調(diào)節(jié)性T細胞，最后進行流式檢測和分析。

2 結(jié)果

2.1高壓注射CXCL10表達載體對肝臟CXCL10表達的影響 為研究CXCL10對肝臟損傷的作用，我們制備了CXCL10表達載體pcDNA3.0-CXCL10，空載體pcDNA3.0-Null作為對照質(zhì)粒。我們通過高壓注射將質(zhì)粒導(dǎo)入到肝細胞中，用熒光定量PCR的方法檢測了肝組織中CXCL10的表達水平，發(fā)現(xiàn)pcDNA-CXCL10質(zhì)粒處理組小鼠肝組織中CXCL10的水平顯著高于對照組(P<0.005)，見圖1。此結(jié)果說明高壓注射pcDNA-CXCL10質(zhì)?？梢杂行г黾痈闻K局部CXCL10的表達水平，達到靶向肝臟的應(yīng)用效果，因此可以用來研究CXCL10對肝臟損傷的影響。

圖1 肝臟中CXCL10的表達量Fig.1 Expression of CXCL10 in liverNote:Real-time PCR assay.***.P<0.005,compare with Null group.

2.2高壓注射CXCL10表達質(zhì)粒對血清ALT的影響 為研究CXCL10對ConA誘導(dǎo)肝臟損傷的影響，我們提前3 d高壓注射CXCL10表達質(zhì)粒，再尾靜脈注射ConA誘導(dǎo)肝臟損傷，分別在ConA注射后的0、6、12和24 h檢測血清中ALT水平。結(jié)果顯示，在ConA處理后的不同時間點，CXCL10表達質(zhì)粒處理組小鼠血清中ALT水平顯著低于對照組(P<0.01)，見圖2。此結(jié)果說明高壓注射CXCL10表達質(zhì)粒可以顯著抑制ConA導(dǎo)致的ALT水平升高，減輕ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷。

2.3高壓注射CXCL10表達質(zhì)粒對肝臟病理損傷的影響 為觀察肝組織中的病理損傷，我們進行了病理切片和HE染色檢測。結(jié)果顯示，對照組小鼠在其肝臟門靜脈周圍有大量的壞死，且肝小葉的結(jié)構(gòu)被破壞。而CXCL10表達質(zhì)粒處理組小鼠肝臟中壞死區(qū)域明顯減小，肝小葉破壞減少，見圖3。此結(jié)果說明高壓注射CXCL10表達質(zhì)?？梢杂行У匾种艭onA誘導(dǎo)的肝臟組織病理損傷。

2.4高壓注射CXCL10表達質(zhì)粒對血清IFN-γ的影響 IFN-γ是介導(dǎo)ConA誘導(dǎo)肝臟損傷的主要炎性介質(zhì)[5]。為觀察CXCL10表達質(zhì)粒對IFN-γ的影響，我們檢測了ConA處理后6、12和24 h小鼠血清中IFN-γ的水平。結(jié)果顯示，在ConA處理后的不同時間點，CXCL10表達質(zhì)粒處理組小鼠血清中的IFN-γ水平顯著低于空質(zhì)粒處理的對照組小鼠，見圖4。此結(jié)果說明預(yù)先高壓注射CXCL10表達質(zhì)粒會降低ConA誘導(dǎo)的IFN-γ水平。

2.5高壓注射CXCL10表達質(zhì)粒對血清TNF-α的影響 TNF-α也是介導(dǎo)ConA誘導(dǎo)肝臟損傷的炎性介質(zhì)之一[6]。為觀察CXCL10表達質(zhì)粒對TNF-α的影響，我們檢測了ConA處理12 h后小鼠血清中TNF-α的水平。結(jié)果顯示，CXCL10表達質(zhì)粒處理組小鼠血清中的TNF-α水平顯著低于空質(zhì)粒處理的對照組小鼠(P<0.05)，見圖5。此結(jié)果說明預(yù)先高壓注射CXCL10表達質(zhì)粒也會降低ConA誘導(dǎo)的TNF-α的水平。

圖2 血清ALT水平Fig.2 ALT levels in seraNote:ALT assay.Compared with Null group，**.P<0.01.

2.6高壓注射CXCL10表達質(zhì)粒對肝臟中調(diào)節(jié)性T細胞的影響 調(diào)節(jié)性T細胞是機體主要的抑制炎癥反應(yīng)的免疫細胞[7]。為研究CXCL10表達質(zhì)粒對ConA誘導(dǎo)肝臟損傷過程中調(diào)節(jié)性T細胞的影響，我們檢測了ConA處理12 h后肝臟單個核細胞的數(shù)量、各免疫細胞亞群(包括CD3+T細胞、CD4+T細胞、NKT細胞、CD8+T細胞、NK細胞)的比例及調(diào)節(jié)性T細胞的比例和數(shù)量。結(jié)果顯示，CXCL10表達質(zhì)粒處理組小鼠肝臟中的單個核細胞的數(shù)量高于空質(zhì)粒處理組小鼠(P<0.05)，見圖6A。 而CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NKT細胞、NK細胞的比例在兩組間無顯著差異，見圖6B。但CXCL10表達質(zhì)粒處理組小鼠肝臟中調(diào)節(jié)性T細胞的比例顯著高于空質(zhì)粒處理組小鼠(P<0.01)，而且調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量也顯著高于對照組小鼠(P<0.01)，見圖6C。此結(jié)果說明高壓注射CXCL10表達質(zhì)粒會增加調(diào)節(jié)性T細胞的比例和數(shù)量，從而抑制ConA誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答，減輕ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷。

圖3 肝臟病理損傷觀察 (HE,×100)Fig.3 Pathological examination in liver(HE,×100)

圖4 血清IFN-γ水平Fig.4 IFN-γ levels in seraNote:ELISA assay.Compared with Null group，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 血清TNF-α水平Fig.5 TNF-α levels in seraNote:ELISA assay.Compared with Null group.*.P<0.05.

圖6 肝臟中免疫細胞的比例與數(shù)量Fig.6 Percentages and numbers of immune cells in liverNote:A.Number of hepatic mononuclear cells;B.Percentage of immune cells in the liver;C.Percentage and number of regulatory T cells.FACS assay，compared with Null group，**.P<0.01.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先高壓注射CXCL10表達質(zhì)?？梢燥@著抑制ConA誘導(dǎo)的ALT水平升高，減少肝臟損傷面積，降低炎性細胞因子濃度，增加調(diào)節(jié)性T細胞，對免疫介導(dǎo)的肝臟損傷具有明顯的保護作用。

包括病毒感染在內(nèi)的多種原因?qū)е碌母闻K損傷都是由活化的免疫細胞通過直接殺傷肝細胞或釋放炎性因子誘導(dǎo)肝細胞死亡的方式來介導(dǎo)的。ConA可以直接活化肝臟中的T細胞介導(dǎo)肝臟損傷[4]。因此，ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷可以很好地模擬多種免疫介導(dǎo)的肝臟疾病，所以得到了廣泛的應(yīng)用。

CXCL10又稱IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10，主要由IFN-γ刺激單核細胞、內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生[1]。IFN-γ可以促進CXCL10的分泌，推動免疫細胞向感染部位或炎癥部位聚集，發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤、促炎癥等作用。其受體CXCR3屬于G蛋白偶聯(lián)超家族，主要表達在T細胞、B細胞、NK細胞等免疫細胞上，也表達在血管內(nèi)皮細胞及某些腫瘤細胞上[3]。研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10-CXCR3與肝臟疾病密切相關(guān)。CXCR3參與缺血再灌注導(dǎo)致的肝臟損傷[8]。HBX會誘導(dǎo)CXCL10表達從而招募免疫細胞進入肝臟[9，10]。CXCR3會促進脂肪性肝炎[11]。因此，CXCL10-CXCR3介導(dǎo)的免疫過程對多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展都有重要的作用。

被CXCL10招募的免疫細胞從功能上分析，既有免疫促進細胞，也有免疫負調(diào)細胞。因此，最終結(jié)果取決于多種免疫細胞的綜合效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)CXCL10可以顯著地抑制ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷和炎癥應(yīng)答。在T細胞中存在具有免疫負調(diào)功能的細胞亞群，即調(diào)節(jié)性T細胞，其在體內(nèi)通過多種免疫抑制功能發(fā)揮維持機體免疫耐受的作用[7]。有文獻報道調(diào)節(jié)性T細胞會抑制炎癥反應(yīng)減輕ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷且調(diào)節(jié)性T細胞的表面也表達CXCR3[12，13]。腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細胞通過分泌CXCL10招募調(diào)節(jié)性T細胞進入腫瘤局部，抑制免疫細胞對腫瘤的殺傷功能[14]。因此，我們推測在小鼠肝臟中過表達CXCL10會招募更多的調(diào)節(jié)性T細胞進入肝臟組織，通過其免疫抑制功能減輕了ConA誘導(dǎo)的肝臟炎癥和肝臟損傷，起到顯著的保護作用。通過分析肝臟中調(diào)節(jié)性T細胞的比例和數(shù)量我們發(fā)現(xiàn)，CXCL10可以招募調(diào)節(jié)性T細胞進入炎癥部位，從而發(fā)揮抑制作用，減輕炎癥。除調(diào)節(jié)性T細胞外，體內(nèi)還有MDSC等其他免疫負調(diào)細胞[15]，這些細胞是否會被CXCL10招募進入肝臟發(fā)揮抑制炎癥的作用還有待研究。除招募免疫細胞外，CXCL10是否可通過其他機制發(fā)揮抑制炎癥的作用也有待深入研究。

本研究證實肝內(nèi)預(yù)先過表達趨化因子CXCL10可以減輕ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷，為自身免疫性肝炎在內(nèi)的免疫性肝臟疾病的預(yù)防和治療提供新思路和新方法，為通過免疫調(diào)控的方式治療肝臟疾病提供新依據(jù)。

[1] Basset L,Chevalier S,Danger Y,etal.Interleukin-27 and IFNgamma regulate the expression of CXCL9,CXCL10,and CXCL11 in hepatitis[J].J Mol Med (Berl)，2015，93(12):1355-1367.

[2] Lacotte S,Brun S,Muller S,etal.CXCR3,inflammation,and autoimmune diseases[J].Ann N Y Acad Sci，2009，1173:310-317.

[3] Van Raemdonck K,Van den Steen PE,Liekens S,etal.CXCR3 ligands in disease and therapy[J].Cytokine Growth Factor Rev，2015，26:311-327.

[4] Chen J,Wei Y,He J,etal.Natural killer T cells play a necessary role in modulating of immune-mediated liver injury by gut microbiota[J].Sci Rep，2014，4:7259.

[5] Abe H,Kimura A,Tsuruta S,etal.Aryl hydrocarbon receptor plays protective roles in ConA-induced hepatic injury by both suppressing IFN-expression and inducing IL-22[J].Intern Immunol，2014，26:129-137.

[6] Li X,Liu HC,Yao QY,etal.Quercetin protects mice from ConA-induced hepatitis by inhibiting HMGB1-TLR expression and down-regulating the nuclear factor Kappa B pathway[J].Inflammation，2015，39(1)：96-106.

[7] Campbell DJ.Control of regulatory T cell migration,function,and homeostasis[J].J Immunol，2015，195:2507-2513.

[8] Zhai Y,Shen XD,Hancock WW,etal.CXCR3+CD4+T cells mediate innate immune function in the pathophysiology of liver ischemia/reperfusion injury[J].J Immunol,2006,176:6313-6322.

[9] Zhou Y,Wang S,Ma JW,etal.Hepatitis B virus protein X-induced expression of the CXC chemokine IP-10 is mediated through activation of NF-kappa B and increases migration of leukocytes[J].J Biol Chem,2010,285:12159-12168.

[10] Fabiani S.Hepatitis B virus infection and interferon-inducible protein-10[J].Clin Ter,2015,166:e188-196.

[11] Zhang X,Chu ES,Li X,etal.Cxc chemokine receptor 3 promotes steatohepatitis in mice through mediating inflammatory cytokines,macrophage,and autophagy[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2015,13:1382-1383.

[12] Paust HJ,Riedel JH,Krebs CF,etal.CXCR3+regulatory T cells control TH1 responses in crescentic GN[J].J Am Soc Nephrol,2015,27(7):1933-1942.

[13] Hoerning A,Koss K,Datta D,etal.Subsets of human CD4(+) regulatory T cells express the peripheral homing receptor CXCR3[J].Eur J Immunol,2011,41:2291-2302.

[14] Redjimi N,Raffin C,Raimbaud I,etal.CXCR3+T regulatory cells selectively accumulate in human ovarian carcinomas to limit type I immunity[J].Cancer Res,2012,72:4351-4360.

[15] Viola A,Sarukhan A,Bronte V,etal.The pros and cons of chemokines in tumor immunology[J].Trends Immunol,2012,33:496-504.

[收稿2016-09-07 修回2016-12-21]

(編輯 倪 鵬)

Liver-targetedexpressionofchemokineCXCL10inhibitsConA-inducedliverinjury

LIJing,WANGXue-Fu.AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

Objective:To explore the effect and mechanism of CXCL10 on immune-mediated liver injury.Methods:The CXCL10 expression vector was injected into mice by hydrodynamic injection. The levels of CXCL10 in the liver were measured 72 hours after injection.Concanavalin A (ConA) was injected into mice to induce immune-mediated liver injury.The levels of alanine a minotransferase (ALT),tissue damage,IFN-γ,TNF-α and percentages and numbers of regulatory T cells were tested and compared between CXCL10 expression group and control group.Results:The levels of CXCL10 in the liver were significantly increased at 72 hours after CXCL10 expression vector was injected.The pretreatment of CXCL10 expression vector markedly reduced ConA-induced ALT levels,IFN-γ levels and TNF-α levels.Additionally,the pretreatment of CXCL10 expression vector increased the percentages and numbers of regulatory T cells in the liver.Conclusion:The pretreatment of CXCL10 expression vector decreases the levels of inflammatory cytokines and attenuates ConA-induced liver injury,which might be beneficial for the treatment for immune-mediated liver injury.

Concanavalin A；Liver injury；CXCL10；Inflammatory cytokine

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.005

①本文為國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81302863)。

李 靜(1985年-)，女，博士，講師，主要從事病原微生物與分子免疫學方面研究，E-mail:lijing1812@ahmu.edu.cn。

及指導(dǎo)教師:王學富(1985年-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫學方面的研究，E-mail:wangxuefu@ahmu.edu.cn。

R392

A

1000-484X(2017)06-0828-05