吳小凡 馬 斌 侯訓堯 洪 艷 申 超 劉雪平

(山東大學附屬省立醫(yī)院老年神經(jīng)科，濟南250021)

柿葉提取物對HEK293-APPswe轉(zhuǎn)基因細胞模型的抗氧化作用及對Nrf2/HO-1途徑的影響①

吳小凡 馬 斌②侯訓堯 洪 艷 申 超 劉雪平

(山東大學附屬省立醫(yī)院老年神經(jīng)科，濟南250021)

目的：觀察柿葉提取物(PLE)對阿爾茨海默病細胞模型HEK293-APPswe(20E2)的抗氧化應激的影響，并從核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)信號通路研究其作用機制。方法：Western blot檢測APP蛋白表達水平，ELISA檢測各組細胞上清Aβ1-40的量，確定細胞模型是否建立成功。用CCK-8檢測不同濃度的柿葉提取物對細胞活性的影響，選定干預最佳濃度。設分組：SH-SY5Y為空白對照組(NC組)，20E2為模型組(20E2組)，用柿葉提取物干預為加藥組(20E2+PLE組)。DCFH-DA熒光探針檢測各組細胞內(nèi)ROS的變化，ELISA檢測各組細胞上清Aβ1-42的量，Western blot檢測胞核、胞漿Nrf2和全細胞HO-1蛋白的表達水平變化。結(jié)果：與模型組相比，加藥組ROS表達減少，細胞外Aβ1-42濃度降低，細胞核內(nèi)Nrf2表達增多， HO-1蛋白含量增加。結(jié)論：柿葉提取物能有效降低模型組氧化應激的水平，可能是通過降低Aβ1-42的聚集，激活Nrf2/HO-1信號途徑，促進Nrf2合成和核轉(zhuǎn)位，從而促進下游抗氧化蛋白HO-1的表達來減弱氧化應激的損傷。

柿葉；氧化應激；神經(jīng)保護；Nrf2/HO-1

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是以進行性認知功能障礙和行為損害為主的中樞神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是β 淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積[1,2]。β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)先后經(jīng)α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶降解，但是APP基因突變使得APP蛋白更易于被β-分泌酶、γ-分泌酶降解，從而產(chǎn)生更多的Aβ[3]。20E2細胞株是攜帶瑞典突變APP基因的HEK293細胞，相比正常神經(jīng)細胞可產(chǎn)生更多的Aβ1-40和Aβ1-42，被用作AD的轉(zhuǎn)基因細胞模型[4]。SH-SY5Y是人神經(jīng)母細胞瘤細胞株，作為正常的神經(jīng)細胞對照。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激和自由基損害與阿爾茨海默病發(fā)病極其密切，抗氧化治療也受到越來越多的關(guān)注。近來發(fā)現(xiàn)，柿葉具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗菌、止血等藥效[5]。柿葉提取物可能通過調(diào)節(jié)JNK/caspase-3信號通路來減緩Aβ1-42導致的神經(jīng)元凋亡[6]。臨床發(fā)現(xiàn)，柿葉提取物在改善后循環(huán)缺血的療效上優(yōu)于銀杏葉提取物[7]。柿葉提取物腦心清片可保護缺血再灌注引起的腦損傷，防止神經(jīng)元興奮性毒性作用。對H2O2誘導的NG108-15細胞損傷有顯著的抗氧化作用[8,9]。柿葉提取物已廣泛應用于臨床防治多種腦血管疾病，然而其對神經(jīng)退行性疾病的作用機制尚不明確。本文研究柿葉提取物對AD抗氧化作用的影響，觀察對細胞外Aβ濃度的變化，對細胞內(nèi)ROS的影響，從核轉(zhuǎn)錄因子 E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-erythroid 2related factor2,Nrf2)/血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)途徑研究其可能的作用機制，旨在為今后AD藥物研發(fā)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗細胞 SH-SY5Y (神經(jīng)母細胞瘤細胞)購自上海細胞庫，20E2(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP的HEK293細胞)由山東大學齊魯醫(yī)院孫秀蓮教授贈予。

1.1.2主要藥品和試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國HyClone)、胎牛血清FBS、遺傳霉素G418(美國Gibco)；Aβ1-40、Aβ1-42ELISA試劑盒、蛋白分子量Marker(美國Invitrogen公司)；無水乙醇(國產(chǎn)分析純)；CCK-8細胞毒性檢測試劑盒(dojindo)；BCA蛋白定量分析試劑盒、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒(碧云天)；兔源APP(Anti-Amyloid Precursor Protein)多克隆抗體、兔源Nrf2抗體、兔源HO-1抗體、小鼠抗人 β-actin 抗體(美國Abcam)；DCHF-DA試劑盒(美國 Sigma公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；柿葉提取物(PLE)來自山東大學藥學院分析測定中心實驗室。

1.2實驗方法

1.2.1藥物配置 柿葉提取物為柿葉經(jīng)乙醇回流提取，水沉淀除雜后正丁醇萃取，回收正丁醇，經(jīng)干燥而得。主要成分為原兒茶酸6.26%、蘆丁7.80%、金絲桃苷10.70%、山奈酚-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷3.27%、山奈酚-3-O-β-D吡喃半乳糖苷9.55%、楊梅素1.06%、槲皮素10.2%、柚皮素0.18%和山奈酚4.3%。柿葉提取物用無水乙醇溶解，配制成為1 g/L的母液，-20℃保存，使用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋成終濃度為3 μg/ml。

1.2.2細胞培養(yǎng)、分組及藥物處理 SH-SY5Y，20E2細胞在37℃，5%CO2條件下，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，每2～3天傳一代，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。將兩種細胞分為以下3組：SH-SY5Y為空白對照組(NC組)，換入無血清培養(yǎng)基；模型組：20E2，換入無血清培養(yǎng)基(20E2組)；給藥組：加入終濃度為3 μg/ml的柿葉提取物的DMEM無血清培養(yǎng)基(20E2+PLE組)，培養(yǎng)24 h后使用。

1.2.3細胞活性檢測 將SH-SY5Y、20E2細胞種到96孔板中，長至80%后，換用含不同濃度梯度(0～24 μg/ml)柿葉提取物的DMEM培養(yǎng)基，每組設6個復孔，24 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入含10%CCK-8工作液的DMEM 100 μl，37℃孵育2 h，酶標儀檢測在470 nm處的吸光度。

1.2.4細胞核蛋白，細胞漿蛋白分離 各組細胞處理24 h后，棄細胞培養(yǎng)培養(yǎng)液，PBS沖洗細胞1次，用細胞刮將細胞刮下，離心，棄上清，按試劑盒說明步驟分別加入細胞核細胞漿抽提試劑，渦旋振蕩，離心后得到細胞核蛋白和細胞漿蛋白。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達 各組細胞處理24 h后，按說明書分別進行全細胞、胞核和胞漿蛋白的提取，以BCA蛋白質(zhì)定量法檢測蛋白濃度，加上樣緩沖液，100℃變性5 min。制膠(12%分離膠，5%濃縮膠)，上樣30 μg，SDS-PAGE電泳將蛋白分離，然后100 mA恒流將目的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，用(10%)的BSA溶液室溫封閉30 min，再分別與兔抗人APP抗體(1∶2 000)，兔抗人Nrf2抗體(1∶500)，兔抗人HO-1抗體(1∶1 000)，β-actin抗體(1∶1 000)，TBP(1∶1 000)于搖床上4℃過夜，TBST溶液洗膜3次，包被二抗，以β-actin、TBP為內(nèi)參，掃膜。以目的條帶的IOD值與β-actin、TBP條帶的IOD值的比值作為該蛋白的相對表達量。

1.2.6活性氧ROS(Reactive oxygen species)水平檢測 各組細胞處理24 h后吸棄培養(yǎng)基，用PBS沖洗1次，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，于37℃孵育30 min，孵育結(jié)束后PBS洗二次，在熒光顯微鏡下選激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長538 nm觀察細胞并拍照。

1.2.7ELISA法檢測細胞上清Aβ1-42水平 相同數(shù)量級的各組細胞分別處理24 h后，取培養(yǎng)液上清離心后，按ELISA試劑盒說明書檢測Aβ1-42，通過酶標儀檢測樣品吸光度，根據(jù)標準曲線計算Aβ1-42的量。

2 結(jié)果

2.1Western blot與ELISA法檢測APP、Aβ1-40蛋白表達 20E2細胞較對照組APP表達量明顯增加，Aβ1-40的量明顯增加，NC組(47.28±5.36)pg/ml， 20E2組細胞Aβ1-40含量(2 105.84±70.69)pg/ml，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1)。表明20E2符合阿爾茨海默病病理細胞模型。

2.2CCK-8檢測不同濃度的PLE對細胞活性的影響 結(jié)果顯示PLE在3～6 μg/ml可增加細胞活性(P<0.05)，超過6 μg/ml后有抑制細胞活性的作用，為了減少藥物毒性作用，最終選用有效濃度范圍內(nèi)的低濃度的3 μg/ml為干預濃度。

圖1 Western blot與ELISA法檢測APP、Aβ1-40蛋白表達Fig.1 Expression of APP，Aβ1-40 detected by Western blot and ELISANote:*.P<0.01 vs NC group.

圖2 不同濃度的PLE對細胞活性的影響Fig.2 Cell viability in different concentrations of PLE was assayed by CCK-8 methodNote:*.P<0.05 vs NC group；#.P<0.05 vs 20E2 group.

2.3PLE對20E2細胞內(nèi)ROS變化的影響 采用DCFH-DA熒光探針檢測各組細胞ROS的表達，與NC組相比，20E2細胞內(nèi)ROS熒光信號明顯增強，氧化損傷明顯，PLE干預后，ROS熒光信號減弱(圖3)。

2.4PLE對細胞外Aβ1-42濃度的影響 用ELISA檢測相同數(shù)量級的各組細胞處理24 h后細胞外Aβ1-42濃度，與NC組相比，模型組細胞外Aβ1-42明顯增多，PLE干預后，加藥組較模型組細胞外 Aβ1-42明顯減少(圖4)。

2.5Western blot檢測Nrf2，HO-1蛋白表達 分別檢測胞漿Nrf2和胞核Nrf2，用PLE干預后，加藥組較模型組胞核Nrf2表達增加，全細胞蛋白HO-1表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義(圖5)。

圖3 PLE對20E2內(nèi)ROS變化的影響(×100)Fig.3 Effect of PLE to ROS in HEK293-APPswe(×100)Note: A.NC group;B.20E2 group;C.20E2+PLE group.*.P<0.05 vs NC group.

圖4 PLE對細胞外Aβ1-42濃度的影響Fig.4 Effect of PLE to extracellular level of Aβ1-42Note:A.NC group;B.20E2 group;C.20E2+PLE group;*.P<0.05 vs NC group.

圖5 Western blot檢測Nrf2，HO-1蛋白表達Fig.5 Expression of Nrf2 and HO-1 protein detected by Western blotNote:1.NC group；2.20E2 group；3.20E2+PLE group.*.P<0.05 vs NC group；#.P<0.05 vs 20E2 group.

3 討論

研究表明，在AD的發(fā)生機制中，氧化應激起重要作用，Aβ已被證實是引起氧化應激的重要原因[10,11]。氧化應激可能主導 AD 的發(fā)生發(fā)展[12]，促進 Aβ聚集和微管相關(guān)蛋白 tau的磷酸化，加重 AD大腦中的氧化還原反應的失衡，而過多的 Aβ 沉積及 tau蛋白的高度磷酸化則加速疾病進程[13]。Aβ既是氧化應激的來源又是結(jié)果，這種具有高度氧化還原活性的肽，能產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，ROS會引起細胞膜損傷，并最終導致細胞死亡[14]。而ROS的攻擊是促進Aβ惡性循環(huán)及腦內(nèi)擴步的物質(zhì)之一，能加速AD的進展[15]。所以，抗氧化應激損傷治療在AD的治療中起重要作用[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，AD細胞模型中的ROS熒光強度比正常神經(jīng)細胞明顯增強，可能是由于Aβ聚集引發(fā)的細胞內(nèi)ROS增多。用柿葉提取物干預后能明顯降低AD細胞內(nèi)ROS的表達，細胞外Aβ1-42的濃度也有明顯下降，說明柿葉提取物可能是Aβ和ROS 的共同清除劑，可有效降低Aβ的聚集，減輕由Aβ帶來的氧化應激損傷，減輕細胞毒性。

Nrf2/HO-1被認為是機體最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路[17]。氧化應激情況下， Nrf2由細胞漿轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與抗氧化反應原件結(jié)合[18]，參與下游II相代謝酶基因的轉(zhuǎn)錄，其中就包含血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)[19]。HO-1具有抗氧化損傷和保護神經(jīng)元的作用[20]，HO-1蛋白量在AD患者腦內(nèi)含量明顯升高，與神經(jīng)元纖維纏結(jié)共同存在。并且，HO-1表達增加并不促進Aβ的生成[21]。因此，我們認為上調(diào)HO-1對AD有保護作用。本實驗中，AD模型20E2過量表達Aβ1-40，胞核中的Nrf2蛋白含量增加， HO-1蛋白表達增強，表明AD細胞模型氧化應激增強，激活Nrf2/HO-1途徑，這是機體的保護反應。本實驗發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，柿葉提取物能使AD模型細胞中胞漿Nrf2蛋白含量降低而胞核Nrf2蛋白含量升高，可能是由于柿葉提取物促進了Nrf2核轉(zhuǎn)位率，從而使HO-1表達增加，增加細胞抗氧化的能力。

綜上所述，柿葉提取物能降低細胞外Aβ的濃度，減弱ROS對細胞的損傷，減緩氧化應激在AD中的作用，其機制可能是通過上調(diào)Nrf2/HO-1通路活性來發(fā)揮抗氧化作用，來減緩AD的進程，而柿葉提取物是否還通過其他路徑來發(fā)揮作用，有待進一步實驗驗證。

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[收稿2016-11-22]

(編輯 張曉舟)

AntioxidanteffectofpersimmonleafextracttoHEK293-APPswetransgeniccellsandeffecttoNrf2/HO-1pathway

WUXiao-Fan,MABin，HOUXun-Yao，HONGYan，SHENChao，LIUXue-Ping.DepartmentofSenileNeurology,ShandongProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Ji′nan250021,China

Objective:To investigate the effect of persimmon leaf extract (PLE) on HEK293-APPswe transgenic cells(20E2).Methods:To determine whether the 20E2 cells model was successfully established,the level of Aβ1-40in SH-SY5Y was detected and 20E2 cells(HEK293 cells stably expressing Swedish mutant APP)cultured in vivo by ELISA kit,and the expression of APP protein level was detected by Western blot.Cell viability was assayed by CCK-8 method and then selected the best concentration.Set groups:SH-SY5Y as normal control group (NC group),20E2 as model group (20E2 group),treating with PLE as treating group (20E2+PLE group).Reactive oxygen species (ROS) levels of each group were detected with DCFH-DA fluorescent probe.The extracellular level of Aβ1-42were detected by ELISA kit.Cytoplasmic Nrf2,Nuclear Nrf2,Whole-cell HO-1 were detected by Western blot.Results:Compared with model group,the expressions of ROS,Aβ1-42were down-regulated and the Nuclear Nrf2 and Whole-cell HO-1 were up-regulated in 20E2+PLE group.Conclusion:PLE can reduce the level of oxidative stress of model group effectively,it possibly reduce the aggregation of Aβ1-42and prevent oxidizing via activating Nrf2/HO-1 pathway .

Persimmon leaf extract(PLE);Oxidative stress;Neuroprotection;Nrf2/HO-1

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.010

①本文受國家自然科學基金(81371225)和山東省科技發(fā)展計劃(2014GSF118056)項目資助。

②山東大學藥學院，濟南250012。

吳小凡(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事神經(jīng)退行性變方面研究，E-mail:wuxiaofan123@126.com。

及指導教師：劉雪平(1962年-),女，博士，教授，博士生導師，主要從事神經(jīng)退行性變研究，E-mail:lxp6203@163.com。

R741.05

A

1000-484X(2017)06-0854-05