周慶卿 張赟愷 陳 祥 劉星光

(第二軍醫(yī)大學免疫學研究所暨醫(yī)學免疫學國家重點實驗室,上海200433)

磷酸酶PP2CB抑制RNA病毒VSV或SeV介導的天然免疫應答①

周慶卿 張赟愷②陳 祥 劉星光

(第二軍醫(yī)大學免疫學研究所暨醫(yī)學免疫學國家重點實驗室,上海200433)

目的：研究蛋白磷酸酶PP2CB在抗RNA病毒天然免疫應答中的調(diào)控作用及其機制。方法：在小鼠腹腔巨噬細胞中轉(zhuǎn)染PP2CB的特異siRNA，干擾其表達后通過Q-PCR和ELISA觀察RNA病毒誘導的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生變化、病毒在細胞內(nèi)的復制變化，Western blot檢測TBK1和IRF3的磷酸化水平的改變。結果：VSV感染誘導巨噬細胞中PP2CB的表達發(fā)生顯著改變。過表達PP2CB抑制HEK293細胞中IFN-β的轉(zhuǎn)錄活化。干擾PP2CB表達顯著升高RNA病毒VSV或SeV誘導的Ⅰ型干擾素的mRNA和蛋白表達水平，并抑制VSV復制。此外，RNA病毒誘導PP2CB和TBK1結合。干擾PP2CB的表達能夠增強TBK1和IRF3的磷酸化。結論：RNA病毒VSV或SeV使蛋白磷酸酶PP2CB能夠結合TBK1并抑制其磷酸化，下調(diào)Ⅰ型干擾素信號通路的活化，從而負向調(diào)控RNA病毒VSV或SeV誘導的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。

蛋白磷酸酶PP2CB；天然免疫；Ⅰ型干擾素；巨噬細胞

當病毒等病原體入侵機體時，天然免疫應答是機體免疫系統(tǒng)識別和清除病原體的一系列生理性防御機制中最早出現(xiàn)的。天然免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)特異性識別相應病原體相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)觸發(fā)天然免疫應答[1]。受到病毒感染后，PRRs特異性識別病毒表面特定的分子結構，使下游信號通路活化，誘導巨噬細胞等天然免疫細胞產(chǎn)生大量的炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素(Interferon,IFN)，從而啟動抗病毒天然免疫應答[2,3]。維甲酸誘導的基因Ⅰ樣受體[Retinoid acid-inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-like receptors,RLRs]是一類能夠識別胞漿內(nèi)病毒RNA的重要PRRs，包括RIG-Ⅰ(Retinoid acid-inducible geneⅠ)和MDA5(Melanoma differentiation-associated gene5)。其中，RIG-Ⅰ主要識別短鏈dsRNA和5′ppp RNA，例如水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)和仙臺病毒(Sendai virus,SeV)等；MDA5則主要識別長鏈dsRNA[4,5]。RIG-Ⅰ或MDA5識別相應病毒RNA后，招募接頭分子IPS-1(Interferon-β promoter stimulator 1)，繼而激活TBK1(TANK-binding kinase 1)，使IRF3(Interfe-ron regulatory factor 3)或IRF7磷酸化并促進其核轉(zhuǎn)位，最終誘導IFN-α和IFN-β大量產(chǎn)生，發(fā)揮抗病毒作用[6,7]。Ⅰ型IFN具有干擾病毒感染和復制的功能[8]。它能夠激活大量干擾素刺激基因(Interferon stimulated genes,ISGs)，誘導其轉(zhuǎn)錄表達，共同發(fā)揮對病毒復制的抑制作用，增強細胞抵抗病毒感染的能力，誘導受病毒感染的細胞凋亡，刺激造血系統(tǒng)中各種細胞的更新與增殖以及激活適應性免疫[9]。然而，天然免疫系統(tǒng)的過度激活會產(chǎn)生過量的干擾素，對機體組織、細胞造成損傷，甚至導致自身免疫疾病等嚴重不良后果[10]。而Ⅰ型IFN的產(chǎn)生不足則無法成功干擾病毒的感染與復制。因此，天然免疫系統(tǒng)在各個層面上對Ⅰ型IFN的產(chǎn)生進行精密的調(diào)控，包括PRRs對病原體的特異性識別過程、下游信號途徑上的接頭分子以及有關的酶和轉(zhuǎn)錄因子的活化等不同調(diào)控層面[11]。

目前研究發(fā)現(xiàn)多種信號蛋白參與抗病毒天然免疫應答的調(diào)控。近年來，蛋白磷酸酶通過調(diào)節(jié)免疫信號通路中關鍵蛋白的磷酸化水平進而調(diào)控其免疫應答的新功能受到廣泛關注。不少研究已經(jīng)證實蛋白磷酸酶在造血細胞分化、髓系細胞和淋巴細胞發(fā)育增殖以及細胞因子受體信號、B細胞受體(B cell receptor,BCR)、T細胞受體(T cell receptor,TCR)和Fc受體(Fc receptor,FCR)信號活化過程中發(fā)揮重要作用[12,13]。在抗病毒反應中，蛋白磷酸酶通過改變其中關鍵信號分子的磷酸化水平對該蛋白的活性和功能進行調(diào)控，使其發(fā)生去磷酸化而失活，參與調(diào)控天然免疫應答，在抵抗病原體感染過程中扮演重要角色。目前已報道部分蛋白磷酸酶通過不同機制，在抗病毒天然免疫應答中發(fā)揮調(diào)控作用。PPM1B(Protein phosphatase Mg2+/Mn2+-dependent 1B)直接結合TBK1，并去磷酸化TBK1的Ser172，進而抑制TBK1的激活[14]。酪氨酸磷酸酶SHIP-1能夠抑制TBK1的磷酸化，最終抑制TLR3介導的IFN-β的產(chǎn)生[15]。然而，蛋白磷酸酶PP2家族在抗病毒天然免疫應答中的調(diào)控作用及機制仍有待研究。蛋白磷酸酶PP2CB(Protein phosphatase 2,catalytic subunit,beta isoform)屬于絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，包括一個包含15個HEAT(Huntingtin-elongation-A subunit-TOR)重復序列組成的馬蹄狀的PP2支架亞基、一個相對保守的催化亞基和多個調(diào)節(jié)亞基。以前的研究證實PP2CB能夠通過使細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(Cyclin-dependent protein kinases,CDKs)去磷酸化，調(diào)節(jié)細胞周期。它還能調(diào)節(jié)Sp1和NF-κB等重要轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化水平從而控制其轉(zhuǎn)錄活性，與DNA結合能力和細胞內(nèi)定位。此外，PP2CB還參與TOR信號、Wnt信號及MAP信號通路，發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16]。然而PP2CB在抗病毒免疫應答中的作用尚不清楚。

本實驗在小鼠腹腔巨噬細胞中轉(zhuǎn)染PP2CB的特異siRNA，研究干擾其蛋白表達對RNA病毒VSV或SeV誘導的IFN-β和IFN-α產(chǎn)生的影響，并探索其調(diào)控的分子機制。本研究豐富了機體對Ⅰ型IFN表達的內(nèi)源性調(diào)控機制，同時也為發(fā)現(xiàn)新的抗病毒藥物靶點及新型治療策略提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HEK293細胞來自ATCC，用含10%胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。小鼠腹腔巨噬細胞取自于C57BL/6J小鼠。

1.1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自PAA Laboratories公司；JetPEI轉(zhuǎn)染試劑和INTERFERin轉(zhuǎn)染試劑購自Polyplus公司；細胞總RNA抽提試劑Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTraAce購自ToYoBo公司；IFN-α和IFN-β ELISA試劑盒購自PBL公司；IFN-β報告基因質(zhì)粒由本實驗室自行構建并保存；VSV病毒由第二軍醫(yī)大學微生物教研室潘衛(wèi)教授惠贈；SeV由中國科學院上海生命科學研究院孫兵教授惠贈。

1.2方法

1.2.1小鼠腹腔巨噬細胞的分離和培養(yǎng) 取制備的3%無菌脫水硫羥乙酸培養(yǎng)基2 ml，注射入6周以上C57小鼠腹腔，3 d后將其頸椎脫臼處死，于75%乙醇中浸泡消毒，后剪開小鼠下腹部皮膚充分暴露腹膜。將不含血清的培養(yǎng)基注射入腹腔并反復沖洗，后離心5 min。棄去離心管中液體，加入10 ml的含10% FCS的DMEM完全培養(yǎng)基，吹打重懸細胞沉淀50次左右，使細胞充分分散混勻后計數(shù)鋪板。鋪板后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后更換含血清培養(yǎng)基，得到腹腔巨噬細胞。

1.2.2RNA干擾 分離小鼠腹腔巨噬細胞的第2天將培養(yǎng)基換成預熱過的含10% FCS的DMEM完全培養(yǎng)基。將PP2CB siRNA按最適濃度加入至Opti-MEM培養(yǎng)基中，渦旋震蕩10 s，再將INTERFERin按比例加入該混合液體中，同樣渦旋震蕩10 s，靜置10～15 min將混合的轉(zhuǎn)染試劑豎直平均滴加在培養(yǎng)基中。置于37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中于6 h后用預熱的含血清的DMEM培養(yǎng)基換液，干擾時間48 h后進行后續(xù)實驗操作。靶向PP2CB基因的siRNA的序列是5′-GAGAAGGCUAAGGAAAUUU-3′(siRNA)。對照siRNA的序列是5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′(Ctrl)。

1.2.3Western blot 在6孔板中加入冰冷PBS洗細胞2次，吸干液體后加入一定量含蛋白酶抑制劑Cocktail的細胞裂解液，于冰盒上裂解5 min后即可收集蛋白。之后在運用BCA法測定上清中蛋白濃度，隨后處理蛋白樣品。將蛋白樣品進行電泳、轉(zhuǎn)膜，之后將其置于5% BSA中封閉，時間為1 h。加入抗待測蛋白的抗體置于4℃冰箱中孵育過夜。第2天于TBST搖床上洗3次膜，加入相應鼠或兔的HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，同樣的方法洗3次膜后即可用ECL法顯影。

1.2.4ELISA 使用特異性siRNA干擾小鼠腹腔巨噬細胞中PP2CB表達48 h后，使用VSV或SeV感染細胞24 h，收集培養(yǎng)上清，離心后即可按照不同說明書使用ELISA試劑盒檢測巨噬細胞上清中IFN-β和IFN-α的蛋白水平。

1.2.5RNA提取和實時熒光定量PCR 按照說明書使用細胞總RNA抽提試劑Trizol，根據(jù)步驟提取腹腔巨噬細胞total RNA。測定RNA濃度后取1 μg細胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，即可用于實時熒光定量PCR。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix，使用熒光定量儀lightCycler2.0進行實時熒光定量PCR擴增。定量PCR引物序列如下：Pp2cb:Forward：5′-GTCCGCTGTCCTGTACCG-3′；Reverse：5′-GCTTTCGTGATTTCCTCCTCGCAATA-3′。Ifnb1:Forward：5′-ATGAGTGGTGGTTGCAGGC-3′；Reverse：5′-TGACCTTTCAAATGCAGTAGATTCA-3′。Ifna4:Forward：5′-TACTCAGCAGACCTTGAACCT-3′；Reverse：5′-CAGTCTTGGCAGCAAGTTGAC-3′。VSVL：Forward：5′-TCAAACCATCCGAGCCATTC-3′；Rev-erse：5′-TTGGCAAGTATGCTAAGTCA-3′。β-actin：Forward：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′；Reve-rse：5′-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3′。

1.2.6熒光素酶報告基因 將HEK293細胞鋪于96孔板，細胞密度為(1～2)×104/孔，置于37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12 h后使用JetPEI轉(zhuǎn)染試劑將目的基因質(zhì)粒、接頭分子質(zhì)粒、IFN-β-Luciferase熒光素酶報告基因質(zhì)粒、TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)進HEK293細胞中，轉(zhuǎn)染24 h。之后在每孔中加入40 μl的PLB裂解液后置于搖床上約30 min，吸取25 μl的細胞裂解液，將其轉(zhuǎn)移至96孔的報告基因檢測板中，使用雙熒光報告基因檢測儀Synergy2檢測HEK293細胞中熒光素酶活性并計算IFN-β的相對轉(zhuǎn)錄活性。

1.2.7免疫沉淀 在小鼠腹腔巨噬細胞中感染VSV病毒6 h后用細胞裂解液裂解收取蛋白，加入一定比例的抗PP2CB抗體和IgG抗體后置于4℃震蕩過夜，第2天加入A/G珠子再次4℃震蕩4 h。隨后用IP buffer洗滌4次，加入蛋白loading buffer后，在沸水中煮8 min，再進行Western blot檢測。

1.3統(tǒng)計學處理 兩組數(shù)據(jù)間的比較，采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1PP2CB的表達在病毒活化的巨噬細胞中發(fā)生顯著改變 RNA病毒VSV感染巨噬細胞0、4、8、12、24 h，PP2CB表達先升高后降低，提示PP2CB可能參與抗病毒天然免疫應答(圖1)。

2.2PP2CB劑量依賴性抑制SeV誘導的IFN-β的轉(zhuǎn)錄活化 在HEK293細胞中轉(zhuǎn)染50、100、150 ng的PP2CB表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染PP2CB質(zhì)粒能顯著抑制IFN-β的轉(zhuǎn)錄活性，并且隨PP2CB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量的升高，其轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，表明PP2CB劑量依賴性地抑制SeV誘導的IFN-β的轉(zhuǎn)錄活化(圖2)。

2.3干擾PP2CB的表達能促進RNA病毒誘導的Ⅰ型IFN產(chǎn)生 設計并合成了多對靶向PP2CB的siRNA，并通過實驗篩選出能顯著沉默小鼠腹腔巨噬細胞中PP2CB表達的一對特異性siRNA，與對照siRNA(Ctrl)相比，其干擾效率達到70%以上(圖3)。干擾PP2CB的表達可以顯著升高VSV和SeV誘導的IFN-α和IFN-β mRNA的表達水平。而且，干擾PP2CB的表達也能顯著促進VSV和SeV誘導的IFN-β和IFN-α蛋白的產(chǎn)生(圖4)。

2.4干擾PP2CB的表達抑制巨噬細胞中VSV的復制 在小鼠腹腔巨噬細胞中轉(zhuǎn)染PP2CB特異性siRNA，干擾其表達后，發(fā)現(xiàn)VSV的復制率較對照組有顯著降低，表明PP2CB通過抑制RNA病毒誘導的Ⅰ型IFN的產(chǎn)生從而促進巨噬細胞中RNA病毒的復制(圖5)。

圖1 VSV病毒感染可以誘導巨噬細胞中PP2CB 表達發(fā)生顯著改變Fig.1 Expression change of PP2CB in macrophages infected with VSV

2.5PP2CB能夠結合TBK1而調(diào)控TBK1依賴的Ⅰ型IFN產(chǎn)生 使用抗PP2CB的抗體進行免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔巨噬細胞中蛋白磷酸酶PP2CB能與TBK1相結合，而當RNA病毒VSV感染后其結合增強(圖6)。

2.6干擾PP2CB的表達能促進Ⅰ型IFN信號通路的活化 利用特異性siRNA干擾PP2CB的表達能夠上調(diào)VSV感染誘導的關鍵信號分子TBK1和IRF3的磷酸化水平，表明干擾PP2CB的表達能促進Ⅰ型IFN信號通路的活化(圖7)。

圖2 PP2CB劑量依賴性抑制HEK293細胞中SeV誘導的IFN-β轉(zhuǎn)錄活化Fig.2 Overexpression of PP2CB dose-dependently inhib-its activation of IFN-β reporter gene induced by SeVNote:Data are the ±s of six samples in one experiment representative of similar results in three independently experiments，**.P<0.01.

圖3 靶向PP2CB特異性siRNA顯著降低小鼠腹腔巨噬細胞中PP2CB的表達Fig.3 PP2CB silencing effectively down-regulates expres-sion level of PP2CB in macrophagesNote:Data are the ±s of six samples in one experiment representative of similar results in three independently experiments，**.P<0.01.

圖4 干擾PP2CB表達促進VSV和SeV感染誘導的巨噬細胞中IFN-β和IFN-α的產(chǎn)生Fig.4 PP2CB silencing significantly promotes production of IFN-α/β in macrophages infected with VSV and SeVNote:Data are shown as ±s of three independently experiments，**.P<0.01.

圖5 干擾PP2CB表達可以抑制VSV病毒的復制Fig.5 PP2CB silencing inhibits VSV replication in macrophagesNote:Data are shown as ±s of three independently experiments，**.P<0.01.

圖6 PP2CB可以結合TBK1Fig.6 PP2CB binds TBK1

圖7 干擾PP2CB表達上調(diào)TBK1和IRF3的磷酸化水平Fig.7 PP2CB silencing up-regulates phosphorylation levels of TBK1 and IRF3 in macrophages infected with VSV

3 討論

病毒觸發(fā)的天然免疫細胞通過產(chǎn)生Ⅰ型IFN，抑制病毒復制并清除受病毒感染的細胞，防御病毒的播散[17]。近年來，部分蛋白磷酸酶已被發(fā)現(xiàn)參與抗病毒天然免疫應答的調(diào)控，其中有4個磷酸酶通過作用于TBK1調(diào)控Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，包括SHP-2、SHIP-1、PPM1B及PP4。它們均通過不同的機制直接或間接與TBK1發(fā)生作用，從而負向調(diào)控抗病毒反應。酪氨酸磷酸酶SHP-2雖然不與TBK1發(fā)生直接作用，但通過發(fā)揮其酪氨酸磷酸酶活性，抑制TRIF依賴的Ⅰ型IFN和炎性細胞因子的產(chǎn)生[18]；脂類磷酸酶SHIP-1促進TLR3信號通路復合體上TBK1和內(nèi)涵體的分離進而抑制其磷酸化；只有PP2C家族成員PPM1B和絲/蘇氨酸磷酸酶PP4能夠與 TBK1發(fā)生直接作用使TBK1的Ser172發(fā)生去磷酸化，抑制TBK1的激活，隨后抑制IRF3的活化，最終下調(diào)Ⅰ型IFN和ISGs的表達。然而其他磷酸酶包括蛋白磷酸酶PP2A家族成員PP2CB在抗病毒天然免疫應答中的作用仍不清楚。

本實驗的研究結果證實了蛋白磷酸酶PP2CB參與抗RNA病毒天然免疫應答的調(diào)控。PP2CB能通過結合關鍵信號激酶TBK1并下調(diào)其磷酸化水平從而抑制TBK1和IRF3通路的活化，抑制Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，從而導致細胞內(nèi)RNA病毒復制的增加，對機體的抗RNA病毒天然免疫應答反應起抑制性調(diào)控作用。TBK1 的Ser172磷酸化對其活化非常關鍵，考慮到PP2CB具有絲/蘇氨酸磷酸酶活性，PP2CB可能作用于TBK1的Ser172并使其去磷酸化，從而抑制TBK1激酶的活化及下游IRF3的活化。另外，在病毒入侵機體的過程中，PP2CB和以上幾個磷酸酶是否全部發(fā)揮負向調(diào)控抗病毒天然免疫應答的功能，以及彼此之間是否存在競爭或協(xié)同的關系，也需要進一步研究。

在機體抵抗病毒入侵、啟動抗病毒反應的過程中，病毒也針對免疫應答的不同環(huán)節(jié)，試圖逃逸免疫應答確保自身的存活。病毒可以通過阻斷模式識別受體的識別、阻止宿主基因表達、抑制Ⅰ型IFN信號通路的活化、減少Ⅰ型IFN和ISGs的產(chǎn)生等方法限制和逃逸免疫系統(tǒng)的攻擊[19,20]。既然我們的研究證明PP2CB能抑制病毒誘導的Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，且PP2CB的表達在RNA病毒感染后先升高后降低，那么病毒便能夠利用細胞內(nèi)PP2CB從而拮抗細胞中Ⅰ型IFN產(chǎn)生信號通路的活化，抑制Ⅰ型IFN和ISGs的表達，幫助病毒逃逸天然免疫應答。我們的研究為病毒免疫逃逸增添了新的假說，也為發(fā)現(xiàn)新型重要的抗病毒藥物靶點提供新思路。此外，過量的Ⅰ型IFN會對組織細胞造成病理性損傷，以及在某些自身免疫性疾病如類風濕性關節(jié)炎的發(fā)病中起重要致病作用，既然內(nèi)源性RNA也能被胞內(nèi)相應受體所識別從而產(chǎn)生Ⅰ型IFN，所以機體便可以利用PP2CB對Ⅰ型IFN信號通路的抑制作用，避免機體產(chǎn)生過量的Ⅰ型IFN，從而在自身免疫性疾病的發(fā)病中起抑制性調(diào)控作用。因此PP2CB調(diào)節(jié)Ⅰ型IFN產(chǎn)生的免疫學功能有助于為慢性炎癥或自身免疫性疾病提供新的潛在藥物開發(fā)和治療靶點。

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[收稿2016-09-28 修回2016-11-08]

(編輯 張曉舟)

PhosphatasePP2CBinhibitsinnateimmuneresponsetriggeredbyRNAvirusVSVorSeV

ZHOUQing-Qing,ZHANGYun-Kai,CHENXiang,LIUXing-Guang.NationalKeyLaboratoryofMedicalImmunology&InstituteofImmunology,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433，China

Objective:To investigate the role of phosphatase PP2CB in the innate immunity against RNA virus and the underlying mechanism.Methods:PP2CB expression in macrophages was silenced with the specific siRNA.The mRNA and protein expression level of type Ⅰ interferon was detected by Q-PCR and ELISA respectively.The phosphorylation level of TBK1 and IRF3 was analyzed by Western blot.Results:RNA virus VSV infection led to the expression change of PP2CB.Overexpression of PP2CB dose-dependently inhibited the activation of IFN-β reporter gene.PP2CB silencing by PP2CB siRNA significantly promoted the production of typeⅠ interferon triggered by RNA virus VSV or SeV,and inhibited the replication of VSV in macrophages.Furthermore,PP2CB bound TBK1 upon RNA virus infection.PP2CB silencing up-regulated the phosphorylation level of TBK1 and IRF3.Conclusion:Upon RNA virus VSV or SeV infection,phosphatase PP2CB binds TBK1 and inhibits its phosphorylation to negatively regulate the activation of the antiviral innate immune signal pathway,which consequently suppresses the production of type Ⅰ interferon triggered by RNA virus VSV or SeV.

Phosphatase PP2CB;Innate immunity;Type Ⅰ interferon;Macrophage

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.003

①本文受國家自然科學基金優(yōu)秀青年科學基金(81422021)資助。

②共同第一作者。

周慶卿(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事天然免疫應答調(diào)控研究，E-mail:pp123zqq@163.com。

及指導教師：劉星光(1980年-)，男，博士，副教授，主要從事天然免疫應答調(diào)控研究，E-mail：liuxg80@163.com。

R392.12

A

1000-484X(2017)06-0818-06