賴河青

雷公藤紅素聯(lián)合順鉑對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞作用機(jī)制的研究

賴河青

目的探討雷公藤紅素聯(lián)合順鉑對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞作用機(jī)制。方法將Tca8113細(xì)胞分為對(duì)照組（0μmol/L順鉑和0μg/mL雷公藤紅素）、順鉑組（15μmol/L順鉑）、雷公藤紅素組（50μg/mL雷公藤紅素）以及聯(lián)合組（15μmol/L順鉑和50μg/mL雷公藤紅素），MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（VEGF-C）、抗凋亡蛋白（Bcl-2）、凋亡蛋白（Bax）水平。結(jié)果順鉑組、雷公藤紅素組以及聯(lián)合組Tca8113細(xì)胞存活率分別為：（0.61±0.12）%、（0.59±0.12）%、（0.27±0.11）%，順鉑組、雷公藤紅素組Tca8113細(xì)胞存活率低于對(duì)照組的（1.00±0.00）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合組Tca8113細(xì)胞存活率低于對(duì)照組、順鉑組與雷公藤紅素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），雷公藤紅素組Tca8113細(xì)胞存活率低于順鉑組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；順鉑組、雷公藤紅素組Tca8113細(xì)胞VEGF、VEGF-C、Bcl-2水平低于對(duì)照組[VEGF：（39.14±1.78）μmol/L、（41.11±1.45）μmol/L比（61.45±2.73）μmol/L，P＜0.05；VEGF-C：（43.11±1.37）μmol/L、（43.13±1.65）μmol/L比（61.33±2.16）μmol/L，P＜0.05；Bcl-2：（52.47±0.98）μmol/L、（53.47±1.03）μmol/L比（78.47±1.33）μmol/L，P＜0.05]，Bax水平高于對(duì)照組[（45.14±0.89）μmol/L、（44.14±1.12）μmol/L比（43.14±1.36）μmol/L，P＜0.05）]；聯(lián)合組VEGF、VEGFC、Bcl-2水平顯著低于對(duì)照組、順鉑組與雷公藤紅素組[VEGF：（23.1±2.13）μmol/L分別與（61.45± 2.73）μmol/L、（39.14±1.78）μmol/L和（41.11±1.45）μmol/L比較，P＜0.05；VEGF-C：（21.45±1.47）μmol/ L分別與（61.33±2.16）μmol/L、（43.11±1.37）μmol/L和（43.13±1.65）μmol/L比較，P＜0.05；Bcl-2：（36.47±1.25）μmol/L分別與（78.47±1.33）μmol/L、（52.47±0.98）μmol/L和（53.47±1.03）μmol/L比較，P＜0.05]；Bax水平高于對(duì)照組、順鉑組與雷公藤紅素組（79.14±1.45）μmol/L分別與（43.14±1.36）μmol/L、（45.14±0.89）μmol/L和（44.14±1.12）μmol/L比較，P＜0.05]；雷公藤紅素組VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平與順鉑組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論雷公藤紅素聯(lián)合順鉑對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞作用優(yōu)于順鉑和雷公藤紅素單獨(dú)作用，作用機(jī)制可能與其抑制VEGF、VEGFC、Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax表達(dá)相關(guān)。

舌鱗狀細(xì)胞癌；Tca8113細(xì)胞；雷公藤紅素；順鉑

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamouscell carcinoma，OSCC）是常見的口腔頜面部惡性腫瘤，約占80%以上，以舌癌發(fā)病率最高，舌癌多數(shù)為鱗狀細(xì)胞癌[1]。舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞能分泌放許多細(xì)胞促瘤因子,包括VEGF、VEGF-C等，其中VEGF、VEGF-C在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡方面起著至關(guān)重要的作用[2-3]。雷公藤紅素具有抗癌和抑制癌細(xì)胞增生的功能，與抑制腫瘤細(xì)胞VEGF、VEGF-C水平[4]，改變Bcl-2、Bax含量有關(guān),而Bcl-2和Bax是對(duì)細(xì)胞凋亡起重要作用的調(diào)控蛋白[5]。順鉑廣泛用于各種頭頸部惡性腫瘤的治療，對(duì)口腔鱗癌的中度以上敏感率達(dá)到89%，其抗癌機(jī)制與Bcl-2、Bax相關(guān)[6]。近年來，越來越多的藥物被聯(lián)合使用來治療舌鱗狀細(xì)胞癌[7]。本研究擬觀察雷公藤紅素聯(lián)合順鉑對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞的影響，初步探討其抗癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象人舌鱗狀癌細(xì)胞：Tca8113細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，批號(hào)YY-XB-A00688）。

1.2 主要試劑及儀器雷公藤紅素（99.9%，CAS No：34157-83-0，Sigma公司）；順鉑（99.9%，國(guó)藥準(zhǔn)字H37021358，齊魯制藥有限公司）；VEGF、VEGFC、Bcl-2、Bax Elisa試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)KHG0111、RAB0513-1KT、RAB0757-1KT、CSB-E17114m）；RPMI-1640培養(yǎng)液（Thermo Scientific Forma公司，批號(hào)12633-012）；PBS液（武漢博士德公司）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司，批號(hào)0219605580）；0.25%含EDTA胰酶/胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)SV30087.02）。倒置熒光顯微鏡EclipseE600（Nikon公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱Thermo311（Thermo Scientific Forma公司）；恒溫培養(yǎng)箱grp-9080（通用公司）；超凈工作臺(tái)ECO 1.5（通用公司）；酶標(biāo)儀HBS-1096A（通用公司）。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制配制雷公藤紅素：2%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液溶解雷公藤紅素母液，調(diào)整濃度為50μg/mL，NaHCO3及HCL調(diào)整pH至6.6，-20℃冰箱中進(jìn)行保存。順鉑溶液常規(guī)配制。

1.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇將裝有Tca8113細(xì)胞株的凍存管從液氮中取出，37℃水浴箱迅速解凍，無菌吸管吸取菌液至5mL EPP無菌管中，1500r/min，離心5min，上清液吸棄，加進(jìn)pH值為7.2含10%胎牛血清、鏈霉素100μg/mL、青霉素100μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，直至5mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)傳代。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組預(yù)試驗(yàn)順鉑組設(shè)2.4、6、15、37.5μmol/L 4個(gè)濃度梯度（1.5倍間距），時(shí)間梯度為24、48、72、96h；雷公藤紅素組設(shè)31.89、40、50、62.5μg/mL 4個(gè)濃度梯度（2.5倍間距），時(shí)間梯度為24、48、72、96h，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定正式試驗(yàn)濃度（見表1）。正式試驗(yàn)對(duì)照組設(shè)Tca8113細(xì)胞組（0μmol/L順鉑和0μg/mL雷公藤紅素）、順鉑組（15μmol/L順鉑）、雷公藤紅素組（50μg/mL雷公藤紅素）以及聯(lián)合組（15μmol/L順鉑和50μg/mL雷公藤紅素），各組細(xì)胞濃度分別為1×106個(gè)/mL。以上各組每孔設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)72h。

1.3.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力在染毒結(jié)束以后，每孔加MTT溶液（5mg/ml）10μL，37℃繼續(xù)孵育4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。在每孔中加150μL的DMSO,經(jīng)振蕩15min后結(jié)晶物充分溶解，利用酶標(biāo)儀在490nm處波長(zhǎng)測(cè)定吸光度（A）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）（/對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。

1.3 ．5VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax測(cè)定染毒結(jié)束后，離心培養(yǎng)板收集其上清液，加入PBS制成細(xì)胞懸液后，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定培養(yǎng)液VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法Excell 2010、SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、統(tǒng)計(jì)分析。VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax的含量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示，分析前進(jìn)行方差齊性及正態(tài)檢驗(yàn)，若滿足正態(tài)及方差齊性，采用LSD兩兩方差分析，若不滿足正態(tài)及方差齊性，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行LSD兩兩方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度順鉑、雷公藤紅素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Tca8113細(xì)胞存活率的影響當(dāng)順鉑濃度為15μmol/ L，作用時(shí)間為72h時(shí)，Tca8113細(xì)胞OD值最低；當(dāng)雷公藤紅素濃度為50μg/mL，作用時(shí)間為72h時(shí)，Tca8113細(xì)胞OD值最低；當(dāng)順鉑、雷公藤紅素濃度繼續(xù)增加，Tca8113細(xì)胞OD繼續(xù)降低。見表1。

表1 不同濃度順鉑、雷公藤紅素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Tca8113細(xì)胞存活率的影響（x±s）

2.2 順鉑、雷公藤紅素對(duì)Tca8113細(xì)胞存活率的影響聯(lián)合組、順鉑組、雷公藤紅素組Tca8113細(xì)胞的存活率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組存活率低于順鉑組與雷公藤紅素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；雷公藤紅素組存活率低于順鉑組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 順鉑、雷公藤紅素對(duì)Tca8113細(xì)胞存活率的影響（x±s）

2.3 順鉑、雷公藤紅素對(duì)VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平的影響聯(lián)合組、順鉑組、雷公藤紅素組Tca8113細(xì)胞VEGF、VEGF-C、Bcl-2水平低于對(duì)照組（P均＜0.05），Bax水平高于對(duì)照組（P均＜0.05）；聯(lián)合組VEGF、VEGF-C、Bcl-2低于順鉑組與雷公藤紅素組（P均＜0.05），Bax高于順鉑組與雷公藤紅素組（P均＜0.05）；雷公藤紅素組VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平與順鉑組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3 討論

OSCC往往引起組織或器官的殘缺，對(duì)正常的生理功能及外形產(chǎn)生了非常嚴(yán)重地影響，危及患者生命[8]。因此，對(duì)OSCC的研究具有特別重要的意義。研究[9]表明，在多種致瘤因素的共同影響下，正常的組織細(xì)胞出現(xiàn)了異常增生，從而形成腫瘤，腫瘤的增殖需要依靠腫瘤外間質(zhì)組織的支持。許多研究[10]表明，在腫瘤生長(zhǎng)過程中，會(huì)“激活”其周圍的間質(zhì)，由此就出現(xiàn)了腫瘤的相關(guān)間質(zhì)，反過來它又促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。Tca8113細(xì)胞能分泌VEGF-C因子和VEGF因子，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及腫瘤血管和淋巴管形成，從而促進(jìn)口腔癌的的發(fā)展[11]。

研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，Bcl-2家族蛋白在程序性細(xì)胞死亡中起重要作用，Bcl-2基因抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞的生存而參與腫瘤的發(fā)生。Bcl-2蛋白主要分布在線粒體外膜、核膜等處，存在于造血細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞中。在Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠[14]（Transgenic Mice）可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡（Apoptosis）減少，免疫細(xì)胞存活延長(zhǎng)從而增加患膿毒癥時(shí)的生存率。體外實(shí)驗(yàn)[15-18]均表明，Bcl-2基因可抑制多種刺激下多種細(xì)胞的凋亡。Bcl-2的過度表達(dá)可防止射線、糖皮質(zhì)激素等引起的造血細(xì)胞凋亡（Apoptosis），同時(shí)也可防止病毒感染后的神經(jīng)元凋亡。目前認(rèn)為Bcl-2抗凋亡的機(jī)制主要有：（1）阻止細(xì)胞色素C激活Caspase；（2）抑制促凋亡蛋白質(zhì)細(xì)胞色素C自線粒體釋放到胞質(zhì)內(nèi)；（3）對(duì)抗促凋亡基因Bax；（4）有抗氧化等作用[17]。

編碼的Bax蛋白能與Bcl-2組成異二聚體，對(duì)Bcl-2產(chǎn)生抑制作用[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Bax表達(dá)量較高的時(shí)候，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2表達(dá)量較高則抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤凋亡的發(fā)生有重要意義。所以，Bax是非常重要的促細(xì)胞凋亡（Apoptosis）基因之一。

表3 順鉑、雷公藤紅素對(duì)VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平的影響（μmol/L，x±s）

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的順鉑組和雷公藤紅素組對(duì)Tca8113細(xì)胞的作用機(jī)制相似，均是抑制VEGF、VEGF-C、Bcl-2的表達(dá)，并促進(jìn)Bax的表達(dá)。而在聯(lián)合組，順鉑和雷公藤紅素發(fā)生了協(xié)同作用，各指標(biāo)的表達(dá)水平均要優(yōu)于順鉑和雷公藤紅素單獨(dú)作用。

綜上所述，雷公藤紅素聯(lián)合順鉑對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞的作用優(yōu)于順鉑和雷公藤紅素單獨(dú)作用，作用機(jī)制可能與其抑制VEGF、VEGF-C、Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax的表達(dá)相關(guān)。

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（收稿：2016-12-16修回：2017-01-20）

Effect of Combination of Tripterine and Cisplatin on Oral Squamous Cell Carcinoma Tca8113 Cells

LAI Heqing.
VIP Ward,Hangzhou Dental Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of combination of tripterine and cisplatin on oral squamous cell carcinoma.MethodsTca8113 cells were divided into four groups:control group（0μmol/L cisplatin and 0μg/mL tripterine）,cisplatin group（15μmol/L cisplatin）,tripterine group（50μg/mL tripterine）and combined group（15μmol/L cisplatin and 50μg/mL tripterine）.MTT assay was used to assess cell activity,then ELISA assay was used to detect the protein level of vascular endothelial growth factor（VEGF）,VEGF-C,Bcl-2 and Bax.ResultsThe survival rates of cisplatin group,tripterine group and combination group were 0.61±0.12,0.59±0.12,and 0.27±0.11;the viability of Tca8113 cells in cisplatin group,tripterine group and combined group was significantly lower than that of control group（1.00±0.00,P＜0.05）;the viability in combined group was lower than those in cisplatin group andtripterine group,with a statistical difference（P＜0.05）;no significant difference was found between tripterine group and cisplatin group（P＞0.05）.VEGF,VEGF-C and Bcl-2 protein levels on Tca8113 cells in cisplatin group（39.14±1.78μmol/L,43.11±1.37μmol/L,52.47±0.98μmol/L）,tripterine group（41.11±1.45μmol/L,43.13±1.65μmol/L, 53.47±1.03μmol/L）,and combined group（23.1±2.13μmol/L,21.45±1.47μmol/L,36.47±1.25μmol/L）were lower than those in control group（61.45±2.73μmol/L,61.33±2.16μmol/L,78.47±1.33μmol/L）,but the Bax level in cisplatin group（45.14±0.89μmol/L）,tripterine group（44.14±1.12μmol/L）,and combined group（79.14±1.45）was higher than that in control group（43.14±1.36μmol/L）,with significant differences（P＜0.05）;significant differences were noted between combined group and cisplatin and tripterine groups;but the levels of VEGF,VEGF-C,Bcl-2 and Bax were similar between cisplatin group and tripterine group（P＞0.05）.ConclusionThe combination of tripterine and cisplatin has better curative effects on oral squamous cell carcinoma Tca8113 cells than using these two separately. The underlying mechanism of action may inhibit the expression of VEGF,VEGF-C and Bcl-2,meanwhile promote Bax.

oral squamous cell carcinoma;Tca8113 cell;tripterine;cisplatin

杭州口腔醫(yī)院總院17樓特需科（杭州310006）