錢 祥 甄宏德 李永峰 張愛琴，3

莪術(shù)石油醚提取物對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)移相關(guān)基因影響的體外研究

錢 祥1甄宏德2李永峰1張愛琴1，3

目的觀察莪術(shù)石油醚提取物（PECZ）對三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞趨化因子及黏附因子的影響，觀察其對三陰性乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的甲基化作用。方法以三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231作為研究對象，采用CCK-8法檢測藥物對細(xì)胞株的增殖抑制作用，RT-PCR法檢測藥物對黏附因子E-cadherin、E-selectin和趨化因子SDF-1、CXCR4 mRNA表達量的影響，MSHRM法檢測藥物對黏附因子E-cadherin的啟動子甲基化水平的影響。結(jié)果（1）與空白對照組零抑制率比較，不同濃度的表阿霉素組（抑制率為47.2%～68.8%）及PECZ組（抑制率為23.8%～80.2%）對細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。（2）與空白對照組趨化因子和黏附因子的（1±0）表達量比較，300μg/mL濃度的PECZ干預(yù)細(xì)胞24h后，細(xì)胞趨化因子CXCR4 mRNA（0.63±0.07）的表達降低，趨化因子SDF-1 mRNA（1.13±0.21）和細(xì)胞黏附因子E-selectin mRNA（2.73±1.92）表達提高，并顯著提高細(xì)胞黏附因子E-cadherin mRNA（13.35±3.43）的表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。（3）與空白對照組、低劑量PECZ組100%甲基化率比較，高劑量PECZ組甲基化率為80%～90%，明顯降低乳腺癌細(xì)胞黏附因子E-cadherin啟動子的甲基化水平（P＜0.05）。結(jié)論莪術(shù)石油醚提取物對乳腺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，其對細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的抑制作用可能是通過上調(diào)細(xì)胞黏附因子E-cadherin mRNA的表達實現(xiàn)。高濃度莪術(shù)石油醚提取物對乳腺癌細(xì)胞黏附因子E-cadherin抑癌基因的啟動子具有一定的去甲基化作用。

三陰性乳腺癌細(xì)胞；莪術(shù)石油醚提取物；甲基化；細(xì)胞轉(zhuǎn)移

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，其每年發(fā)病率和死亡率居我國女性惡性腫瘤的首位[1]。乳腺癌是一種生物學(xué)特征高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和HER-2表達在免疫組化上均不表達者，稱之為三陰性乳腺癌（TNBC）。TNBC較非TNBC者，具有組織學(xué)分級高、惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、總生存期短等特點。對于乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，中醫(yī)多從毒、從痰、從瘀論治，祛痰化瘀散結(jié)解毒中藥對抑制乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有較好效果[2]。因此，臨床治療乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，較多選擇具有祛痰化瘀解毒的抗癌中藥，如蛇六谷、莪術(shù)、制南星、山海螺等。莪術(shù)屬姜科類植物，為溫郁金的干燥根莖，其主要的功效為活血化瘀、行氣止痛、破血消癥，常被應(yīng)用到乳腺癌的治療[3]。從提取的工藝來分類，莪術(shù)提取物包括莪術(shù)石油醚提取物（PECZ）、莪術(shù)乙酸乙酯提取物（EACZ）、莪術(shù)正丁醇提取物（NBCZ）以及莪術(shù)水提取物。已有研究[4]顯示，不同莪術(shù)提取物對乳腺癌均有一定的抑制作用，其中PECZ抑制作用最強。國內(nèi)動物實驗結(jié)果顯示，莪術(shù)抗癌作用的機制與影響細(xì)胞增殖[5]、促進腫瘤細(xì)胞凋亡[6]、調(diào)控端粒酶酶活性[7]和抑制血管生成[8]等有關(guān)。本實驗通過觀察莪術(shù)石油醚提取物對三陰性乳腺癌細(xì)胞E—cadherin基因啟動子的甲基化作用，進一步探討莪術(shù)抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用機制。

1 實驗材料

1.1 試劑與藥品RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)含15%的小牛血清和10μg/mL人胰島素；消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA按1：1混合）；碘化丙啶溶液、二甲基亞砜（DMSO）為SIGMA公司產(chǎn)品；PBS液；MS-HRM檢測試劑SsoFast Eva Green Supermix（飽和染料qPCR試劑）購自Bio-Rad公司；甲基化標(biāo)準(zhǔn)品EpiTect PCR Control DNA Set（100）Cat.No-59695；SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶及其緩沖液（GibcoBRL）；TaqDNA聚合酶及其緩沖液（Roche）；dNTP（Roche）；莪術(shù)由浙江省腫瘤醫(yī)院中藥房提供（華東醫(yī)藥有限公司）；表阿霉素10mg（浙江海正藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 實驗器材電熱恒溫水槽（DKB-8A型，上海精密實驗設(shè)備有限公司）、離心機（LDZ5-2型）、CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，B5660-EK）、顯微鏡（OLMPUS）、吸管、超凈臺、35mL培養(yǎng)瓶、CCK-8 Kit（細(xì)胞計數(shù)CCK8試劑盒）為日本DOJINDO公司產(chǎn)品；細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒：GK0221，上海捷瑞生物科技有限公司；RNA/DNA核酸定量儀（Pharmacia-Biotech USA）；實時熒光PCR儀器LightCycler（Roche）及配套軟件；OD值測量儀器（高精度分光光度計）為Merinton SMA4000；定量PCR儀為CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析軟件為Precision Melt Analysis（用于HRM分析）；相關(guān)耗材（Tip頭、EP管等）。

1.3 實驗細(xì)胞人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231由浙江省腫瘤研究所惠贈。用15%胎牛血清和100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞用含15%小牛血清（LOT批號1418110）、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素和10μg/ mL胰蛋白酶-EDTA消化液（LOT批號20150414）的RPMI-1640培養(yǎng)基于35mL的培養(yǎng)瓶中進行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，90%相對濕度。

2.2 細(xì)胞收集將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞按常規(guī)方法消化收集細(xì)胞，1000r/min下離心5min，棄上清液，加入PBS液洗一遍，細(xì)胞株制成1×106/mL的細(xì)胞懸液。

2.3 莪術(shù)石油醚提取物及表阿霉素的制備與配制精密稱取干燥的莪術(shù)飲片40g，粉碎成粗顆粒，70%乙醇浸泡過夜后熱回流提取2次。2次提取液合并減壓濃縮，回收乙醇至無醇后以石油醚萃取，回收萃取物。提取成分過濾除菌，濃縮至浸膏，按極性得到莪術(shù)石油醚提取物。精密稱取提取物5mg，溶解于500μL二甲基亞砜中，旋渦震蕩，待全部溶解后，0.22μm過濾器過濾，少量分裝后－20℃保存，其濃度均為10mg/mL。臨用前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。表阿霉素（10mg每支）溶于5mL注射用滅菌用水，其終濃度為2mg/mL，臨用前配制，4℃保存。

2.4 CCK－8法檢測莪術(shù)石油醚提取物對細(xì)胞增殖作用的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞，以RPMI－1640培養(yǎng)液稀釋至濃度約1×104/mL，接種于96孔板，200μL/孔。常規(guī)培養(yǎng)24h后，分別加入100、200、300和400μg/mL莪術(shù)石油醚提取物，同時設(shè)空白對照組和表阿霉素陽性對照組，表阿霉素濃度分別為0.25、0.5、1和2μg/mL。每濃度設(shè)3個復(fù)孔，于37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入CCK8 10μL（5mg/mL），繼續(xù)孵育2～4h。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測其吸光度值（OD值）。細(xì)胞生長抑制率=（空白組平均值-藥物組平均吸光度值）/（空白組平均值-培養(yǎng)液組平均吸光度值）×100%。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測莪術(shù)石油醚提取物對細(xì)胞趨化因子及黏附因子的影響收集對數(shù)生長期MDAMB-231細(xì)胞，分4份等量傳代于10mL培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)24h后，換用單純RPMI-1640培養(yǎng)，將配置好的莪術(shù)石油醚提取物加入其終濃度為300μg/mL，并設(shè)生理鹽水作為陰性對照，設(shè)表阿霉素為陽性對照組，濃度為0.25μg/mL，常規(guī)培養(yǎng)24h。在藥物作用24h后直接用TRIzoI收集細(xì)胞備用。采用TRIzol—步法提取total RNA。

PCR擴增，擴增引物如下：

2.6 甲基化實驗流程收集對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞，分別分3份等量傳代于10mL培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)24h后，換用單純RPMI-1640培養(yǎng)，將配置好的莪術(shù)石油醚提取物加入其終濃度為300μg/mL（高劑量組）、100μg/mL（低劑量組），并設(shè)生理鹽水作為陰性對照，常規(guī)培養(yǎng)24h，在藥物作用24h后直接用TRIzoI收集細(xì)胞備用。通過引物預(yù)實驗，篩選最佳序列；確定（CDKN2A_296F+CDKN2A_296R）引物對檢測p16啟動子甲基化水平。

PCR擴增反應(yīng)體系：SsoFast Eva Green Supermix 10μL，F(xiàn)orward primer，10μM 1μL，Reverse primer，10μM 1μL，ddH2O 6μL，Template 1μL。

qPCR實驗參數(shù)：98.0°C for 2:00；98.0°C for 0: 02；57.0°C for 0:05 Plate Read；GOTO 2,35 more times；Melt Curve 65°C to 95°C:Increment 0.2°C for 0:05Plate Read

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)輸入計算機，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析處理，每組OD值以（x±s） 表示，多個樣本單因素方差分析（q檢驗）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 莪術(shù)石油醚提取物對細(xì)胞體外增殖的影響與空白對照組比較，表阿霉素組、莪術(shù)石油醚提取物各濃度組對MDA-MB-231細(xì)胞生長均有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1，圖1～4（插頁）。

表1 各組MDA-MB-231細(xì)胞體外增殖抑制率比較（x±s）

3.2 莪術(shù)石油醚提取物對細(xì)胞趨化因子及黏附因子的影響RT-PCR實驗結(jié)果表明，與空白對照組比較，300μg/mL濃度的莪術(shù)石油醚提取物作用24h后細(xì)胞，其可降低細(xì)胞趨化因子CXCR4 mRNA表達（P＜0.05），提高趨化因子SDF-1 mRNA和細(xì)胞黏附因子E-selectin mRNA表達（P＜0.05），并顯著提高細(xì)胞黏附因子E-cadherin mRNA表達（P＜0.01）。與表阿霉素組比較，莪術(shù)石油醚提取物組E-cadherin mRNA顯著上調(diào)（P＜0.05），說明莪術(shù)石油醚提取物組對MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的抑制作用可能源于對E-cadherin mRNA的調(diào)控。見表2，圖5（插頁）。

表2 各組細(xì)胞趨化因子SDF-1、CXCR4和黏附因子E-cadherin、E-selectin mRNA表達比較（x±s）

3.3 莪術(shù)石油醚提取物對細(xì)胞黏附因子E-cadherin基因啟動子的甲基化作用空白對照組和低劑量藥物組樣本的CDH1啟動子（E-cadherin基因）甲基化程度為100%，即E-cadherin基因啟動子完全不表達；高劑量藥物組的3個樣本CDH1啟動子甲基化程度80%～90%，即E-cadherin基因啟動子出現(xiàn)去甲基化現(xiàn)象。見圖6～8（插頁）。

4 討論

TNBC侵襲性強，易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，是預(yù)后最差的一種特殊乳腺癌類型。因此，降低乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是治療的重中之重。Gould Rothberg等[9]研究表明，乳腺癌中上皮型鈣黏素（E-cadherin）的表達下降與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。

腫瘤屬中醫(yī)“癥瘕”、“積聚”范疇，莪術(shù)具有活血化瘀、破血消癥的功效。本實驗結(jié)果表明，PECZ能顯著提高細(xì)胞黏附因子E-cadherin mRNA表達，其對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的抑制作用可能源于其對E-cadherin mRNA的調(diào)控作用。

腫瘤DNA異常甲基化包括抑癌基因啟動子區(qū)的高甲基化及某些癌基因啟動子區(qū)的低甲基化，前者占甲基化異常的大多數(shù)，指基因啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化致使許多抑癌基因沉默而失活。研究表明，抑癌基因啟動子異常甲基化在人類多種腫瘤包括鼻咽癌、肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、乳腺癌等的發(fā)病過程中起到重要作用。多種抑癌基因包括P16、E-cadherin、RASSF1A和BRCA1等已被證實由啟動子高甲基化致其沉默，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種生物學(xué)過程，如DNA修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡和血管生成。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞一細(xì)胞間黏附分子，E-cad表達降低的腫瘤更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究表明，細(xì)胞黏附因子E-cadherin基因（CDHl啟動子）5’區(qū)CpG島甲基化可出現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中，且這種甲基化在一定條件下是可逆的[10]。本實驗通過甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析空白對照組、低劑量藥物組、高劑量藥物組中乳腺癌細(xì)胞E-cadherin基因（CDHl啟動子）甲基化的差異，結(jié)果顯示空白對照組和低劑量藥物組樣本的CDH1啟動子甲基化程度為100%，即E-cadherin基因啟動子完全不表達；而高劑量藥物組CDH1啟動子甲基化程度低于100%，即E-cadherin基因啟動子出現(xiàn)去甲基化現(xiàn)象。我們進一步推測莪術(shù)石油醚提取物作用于三陰性乳腺癌細(xì)胞后，E-cadherin基因啟動子出現(xiàn)去甲基化作用，E-cadherin mRNA部分表達，抑制細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，莪術(shù)石油醚提取物對細(xì)胞中CDH1啟動子具有一定的去甲基化作用，但此結(jié)果僅僅是其抗腫瘤機制中的冰山一角，啟動子異常甲基化可使腫瘤細(xì)胞中多種信號通路紊亂。例如上皮黏附因子E-cadherin可與β-catenin結(jié)合，抑制其聚集在核內(nèi)而影響β-catenin影響細(xì)胞內(nèi)定位，致Wnt/β-catnin信號通路異?；罨?。對于多條信號通路以及相關(guān)信號因子的傳遞仍有待進一步探索。

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（收稿：2016-10-27修回：2017-01-19）

Effect of Petroleum Ether Extracts of Curcuma Zedoaria on Metastasis-associated Genes of Triple Negative Breast Cancer Cells in vitro

QIAN Xiang1,ZHEN Hongde2,LI Yongfeng1,ZHANG Aiqin1,3
1 Department of Chinese Medicine Medical Center,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022)；2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053);3 Zhejiang Integrative Oncology Key Laboratory,Hangzhou(310022)

ObjectiveTo investigate the effect of petroleum ether extract of Curcuma zedoaria（PECZ）on proliferation,chemokines,and adhesion factors in triple negative breast cancer cell MDA-MB-231.MethodsMDAMB-231 cells were treated with various concentrations of PECZ;cellular viability was detected with CCK-8 method, the mRNA expressions of E-cadherin,E-selectin and SDF-1,CXCR4 with RT-PCR,and the methylation of E-cadherin promoter with MS-HRM analyses.ResultsCompared with the blank control group,MDA-MB-231 cells were inhibited by PECZ（the inhibitory rate were from 23.8%-80.2%）and epirubicin（the inhibitory rate were from 47.2%-68.8%）,with P＜0.05;the CXCR4 mRNA expression level was decreased at 24h after treated with PECZ at the concentration of 300μg/mL and the mRNA expressions of E-cadherin,E-selectin and SDF-1 were increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with the blank control group and low-dose group（100μg/mL）,high-dose（300μg/ mL）PECZ reduced the level of methylation on E-cadherin promoter to 80%-90%（P＜0.05）.ConclusionPECZ can inhibit the proliferation,metastasis and invasion of breast cancer cells possibly by upregulating the expression of E-cadherin mRNA.In methylation level,PECZ has some demethylation function on E-cadherin promoter.

triple negative breast cancer cell;petroleum ether extracts of curcuma zedoaria;methylation;cellmetastasis

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2016ZA034、2016ZB023）

1浙江省腫瘤醫(yī)院名中醫(yī)館（杭州310022）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州310053）；3浙江省中西醫(yī)結(jié)合腫瘤重點實驗室（杭州310022）

張愛琴，Tel：0571-88122245；E-mail：zhanghaojianbb@163.com