楊少玲，朱旅云，胡麗葉，劉 洋，武 珊

創(chuàng)面負(fù)壓治療對糖尿病足不同缺血創(chuàng)面肉芽組織EDA+FN的影響

楊少玲，朱旅云，胡麗葉，劉 洋，武 珊

目的 探討創(chuàng)面負(fù)壓治療(negative pressure wound therapy， NPWT)對糖尿病足不同缺血創(chuàng)面肉芽組織EDA+FN的影響。方法 選取我院2014年1月—2016年1月符合入組標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病足30例，依據(jù)踝肱比值(ABI)，分為0.5≤ABI<0.7組和0.7≤ABI≤0.9組，每組各15例。兩組均予NPWT，并于治療前及治療第14天取創(chuàng)面肉芽組織，觀察EDA+FN的變化。結(jié)果 與本組治療前比較，兩組治療后EDA+FN面密度值、EDA+FN相對蛋白表達(dá)量及EDA+FN相對mRNA表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療后0.7≤ABI≤0.9組EDA+FN面密度值、EDA+FN相對蛋白表達(dá)量及EDA+FN相對mRNA表達(dá)量較0.5≤ABI<0.7組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 NPWT對糖尿病足不同缺血創(chuàng)面EDA+FN的影響不同，隨著缺血程度的加重，創(chuàng)面肉芽組織EDA+FN的表達(dá)下降。

糖尿病足；創(chuàng)面負(fù)壓治療；肉芽組織

糖尿病足是糖尿病嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，致殘率高、花費(fèi)高、病程長，給患者、家庭、甚至社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)[1-4]。糖尿病足創(chuàng)面是由周圍血管及神經(jīng)病變、感染等因素引起，常表現(xiàn)為慢性創(chuàng)面，遷延不愈，故如何促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面的愈合是臨床急需解決的問題。創(chuàng)面負(fù)壓治療(negative pressure wound therapy， NPWT)是近年開展的一種新型治療方法。有研究顯示，NPWT可促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面的愈合[5-6]。然而，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)NPWT對不同缺血創(chuàng)面的治療效果有所不同，其對輕中度缺血創(chuàng)面的治療效果較好，對重度缺血創(chuàng)面則效果欠佳，相關(guān)作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

纖維連接蛋白(FN)分為血漿型纖維連接蛋白(pFN)和細(xì)胞型纖維連接蛋白(cFN)，其中cFN是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成之一，而EDA+FN(spliced extra domain A fibronectin)為cFN，其較pFN在創(chuàng)面愈合過程中起著更為重要的作用，其可促進(jìn)細(xì)胞黏附和遷移，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的重要因素之一[7-8]。為探討NPWT對糖尿病足不同缺血創(chuàng)面EDA+FN的影響，本研究以糖尿病足為研究對象，觀察NPWT對不同踝肱比值(ABI)糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織EDA+FN的影響,探討NPWT對不同缺血糖尿病足創(chuàng)面產(chǎn)生不同治療效果的影響因素，為NPWT在糖尿病足創(chuàng)面的治療選擇上提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取 2014年1月—2016年1月在我院住院的糖尿病足30例，按照ABI將其分為0.7≤ABI≤0.9組和0.5≤ABI<0.7組，每組各15例。納入標(biāo)準(zhǔn)[9]：①有1個月以上的難以愈合的慢性糖尿病足潰瘍；②年齡50～70歲；③ABI為0.5～0.9；④Wagner分級2～4級；⑤創(chuàng)面局部感染得到有效控制；⑥無明顯的壞死組織及膿性分泌物。排除標(biāo)準(zhǔn)[10]：①未經(jīng)治療的蜂窩織炎、有明顯大塊壞死組織或嚴(yán)重的骨髓炎；②惡性創(chuàng)面；③于研究前30 d內(nèi)或研究期間接受生長因子或高壓氧治療；④合并嚴(yán)重肝腎功能損害、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤和自身免疫系統(tǒng)疾病者。所有患者均采用VAC裝置行NPWT。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，且患者均同意且簽署知情同意書。

1.2 NPWT方法及標(biāo)本采集 所有患者均行創(chuàng)面準(zhǔn)備(常規(guī)清除壞死組織)，時間為1周。NPWT的具體操作如下[11]：①創(chuàng)面常規(guī)消毒，清理壞死組織，保證創(chuàng)面及創(chuàng)腔無膿液和大塊壞死組織殘留；②根據(jù)創(chuàng)面大小設(shè)計(jì)、修剪敷料，敷料以稍大于創(chuàng)面為宜；③覆蓋半透明性粘貼薄膜，使創(chuàng)面處于封閉狀態(tài)；④將負(fù)壓裝置連接吸引管，此時的半透明薄膜和敷料因負(fù)壓吸引而凹陷，若漏氣則需重新封閉創(chuàng)面，其負(fù)壓設(shè)置為-125 mmHg，療程14 d；⑤治療過程中密切注意有無漏氣、出血、引流管堵塞等情況發(fā)生，如發(fā)現(xiàn)異常及時處理。每位患者于治療前及治療第14天，分別于創(chuàng)面中心取直徑8 mm、厚度3 mm的肉芽組織[11]兩份。一份置于4%多聚甲醛溶液中,固定后行免疫組織化學(xué)染色(免疫組化)，一份放于-80℃冰箱中保存。標(biāo)本收齊后，采取Western blot和Real-time PCR分析EDA+FN蛋白及基因表達(dá)情況。

1.3 免疫組化分析EDA+FN表達(dá)情況 創(chuàng)面肉芽組織樣本經(jīng)切片機(jī)切成5 μm的薄片，經(jīng)脫蠟、水化，再加入3%過氧化氫以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加入EDA+FN第一抗體(ab6328, abcam)，并置于4℃環(huán)境下過夜，后在室溫下加入第二抗體，并于37℃環(huán)境下放置20 min，再加入親和素-生物素復(fù)合物(ABC)試劑顯色，最后于顯微鏡下觀察。每個切片隨機(jī)選取10個視野進(jìn)行拍照，應(yīng)用圖像分析軟件(數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)Motic Medical 6.0)測量糖尿病足患者肉芽組織切片每個區(qū)域的EDA+FN面密度值，計(jì)算平均值，用平均面密度值表示每張切片EDA+FN含量，并對其進(jìn)行半定量分析。

1.4 Western blot法分析EDA+FN表達(dá)情況 創(chuàng)面肉芽組織加入1 ml RIPA組織裂解液中冰浴勻漿，裂解20 min，8000 r/min 離心10 min后取上清液，應(yīng)用BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海生工生物工程有限公司)測定上清液蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品，加入5倍的蛋白上樣緩沖液混合后煮沸5 min使其變性，經(jīng)10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳梯度分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，后用5%脫脂奶粉封閉2 h，再分別與EDA+FN及內(nèi)參β-Actin第一抗體(1∶500稀釋)混勻后4℃孵育過夜，次日經(jīng)TBST緩沖液沖洗3次，加入由辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體(1∶10000稀釋)常溫孵育2 h。使用高靈敏度ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶，用Quantity One軟件(美國Bio-Rad公司)對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量分析，以β-Actin為內(nèi)參基因，計(jì)算EDA+FN蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 Real-time PCR法分析EDA+FN基因表達(dá)情況 采用Trizol法提取肉芽組織總RNA，經(jīng)純度及完整性檢測后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，反應(yīng)體系20 μl，分別為：5×buffer 4 μl，dNTP 2 μl，Rnasin核糖酶抑制劑1 μl，RNA提取液5 μl，Random Primer 1 μl，M-MLV(反轉(zhuǎn)錄酶)1 μl，Nucleasr-Free Water 6 μl。各樣本取1 μl反轉(zhuǎn)錄液進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μl，分別為：2×SYBR Green PCR Master Mix (Fermentas, USA)10 μl，上、下游引物(10 μM)各1 μl，模板1 μl，去離子水7 μl。PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火及延伸1 min。

所用引物如下：EDA+FN上游引物：5′-CTGACACAACAAACGGCTG-3′，下游引物：5′-GTGAGTAACGCACCAGGAAG-3′[12-13]。PCR反應(yīng)在ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems， USA)進(jìn)行，以GAPDH為內(nèi)參基因，計(jì)算EDA+FN基因表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 兩組年齡、性別、空腹血糖、糖化血紅蛋白、潰瘍時間、血肌酐等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

2.2 EDA+FN表達(dá)比較 與本組治療前比較，兩組治療后EDA+FN面密度值、EDA+FN相對蛋白表達(dá)量、EDA+FN相對mRNA表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；0.7≤ABI≤0.9組治療后EDA+FN面密度值、EDA+FN相對蛋白表達(dá)量及EDA+FN相對mRNA表達(dá)量較0.5≤ABI<0.7組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2、圖1～3。

表1 采用創(chuàng)面負(fù)壓治療的踝肱比值不同的糖尿病足兩組一般資料比較

注：FPG為空腹血糖，ALT為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；ABI為踝肱比值；*指Fisher檢驗(yàn)

表2 采用創(chuàng)面負(fù)壓治療的踝肱比值不同的糖尿病足兩組EDA+FN相關(guān)指標(biāo)比較

注：與本組治療前比較，bP<0.01；與0.5≤ABI<0.7組比較，dP<0.01；ABI為踝肱比值

圖1 采用創(chuàng)面負(fù)壓治療的踝肱比值不同的糖尿病足兩組免疫組織化學(xué)分析EDA+FN表達(dá)(箭頭所指為陽性因子)ABI為踝肱比值

圖2 采用創(chuàng)面負(fù)壓治療的踝肱比值不同的糖尿病足兩組Western blot法分析EDA+FN表達(dá)ABI為踝肱比值

圖3 采用創(chuàng)面負(fù)壓治療的踝肱比值不同的糖尿病足兩組Real-time PCR法分析EDA+FN基因表達(dá)ABI為踝肱比值

3 討論

糖尿病足是由于糖尿病合并神經(jīng)病變及不同程度末梢血管病變而引起的下肢感染、潰瘍形成和(或)深部組織破壞，是導(dǎo)致糖尿病患者致殘、致死的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。由于糖尿病足創(chuàng)面的發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)及病理特點(diǎn)較為復(fù)雜，具有特殊性，創(chuàng)面常遷延不愈，甚至可致截肢(趾)等嚴(yán)重后果，故臨床急需尋找有效的治療方法。近年國內(nèi)外臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)及系統(tǒng)綜述分析顯示，與標(biāo)準(zhǔn)換藥法相比，NPWT可促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織生長，縮短愈合時間，無嚴(yán)重不良反應(yīng)及并發(fā)癥，是治療糖尿病足安全、有效的方法之一[5-6,14]。然而，NPWT對不同缺血創(chuàng)面的治療效果的相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。cFN是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成之一，其中EDA+FN是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的重要因素之一[7-8]。糖尿病性創(chuàng)面常因血管神經(jīng)病變、感染、局部高血糖、糖基化終末產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、異常炎性因子等因素導(dǎo)致創(chuàng)面局部微環(huán)境改變，從而促進(jìn)FN降解增加，致創(chuàng)面遷延不愈[15-17]。

Arslan等[18]觀察糖尿病患者足部行NPWT治療前后pFN的變化，結(jié)果顯示治療后pFN表達(dá)增加，但未對EDA+FN進(jìn)行相關(guān)研究。為探討NPWT對糖尿病足不同缺血創(chuàng)面肉芽組織EDA+FN的影響，本研究以糖尿病足為研究對象，結(jié)果顯示兩組經(jīng)NPWT后，創(chuàng)面肉芽組織EDA+FN沉積較治療前明顯增多，且0.7≤ABI≤0.9組增多更為明顯，同時創(chuàng)面肉芽組織EDA+FN蛋白及基因表達(dá)水平與治療前相比均提高，且0.7≤ABI≤0.9組EDA+FN蛋白和mRNA相對表達(dá)量升高更明顯。本文研究表明，NPWT可顯著提高0.7≤ABI≤0.9組糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織EDA+FN的表達(dá)。

綜上，NPWT對不同缺血糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織EDA+FN的表達(dá)有所不同，對輕度缺血患者肉芽組織EDA+FN的作用更明顯，隨著缺血程度的加重，NPWT對創(chuàng)面肉芽組織EDA+FN的表達(dá)可能下降，從而影響NPWT對糖尿病足創(chuàng)面的治療效果，本研究為NPWT在糖尿病足創(chuàng)面的治療選擇上提供參考依據(jù)。

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Effect of Negative Pressure Wound Therapy on EDA+FN Level in Different Ischemia Granulation Tissues of Diabetic Foot Wounds

YANG Shao-ling1, ZHU Lyu-yu1, HU Li-ye1, LIU Yang2, WU Shan2
(1. Department of Endocrinology, Bethune Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China; 2. Graduate School of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China)

Objective To investigate effect of negative pressure wound therapy (NPWT) on EDA+FN level in different ischemia granulation tissue of diabetic foot wounds. Methods A total of 30 diabetic feet fitting the inclusion criteria during January 2014 and January 2016 were divided into 0.5≤ABI<0.7 group (n=15) and 0.7≤ABI≤0.9 group (n=15) according to ABI (ankle brachial index) value. All patients

NPWT. Granulation tissues of wounds were collected before treatment and at the 14thd of treatment to observe the changes of EDA+FN. Results Compared with those before treatment in same group, values of area density of EDA+FN, relative protein expression of EDA+FN and relative mRNA expression of EDA+FN were significantly increased after treatment in both groups (P<0.01). After treatment, values of area density of EDA+FN, relative protein expression of EDA+FN and relative mRNA expression of EDA+FN in 0.7≤ABI≤0.9 group were significantly higher than those in 0.5≤ABI<0.7 group (P<0.01). Conclusion NPWT has different effects on EDA+FN levels in different ischemia granulation tissue of diabetic foot wounds. EDA+FN levels in different ischemia granulation tissue of diabetic foot wounds may decrease with aggravated ischemia degree.

Diabetic foot; Negative pressure wound therapy; Granulation tissue

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(12277725)

050082 石家莊，解放軍白求恩國際和平醫(yī)院內(nèi)分泌科(楊少玲、朱旅云、胡麗葉)；050000 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(劉洋、武珊)

R587.29

A

1002-3429(2017)06-0092-05

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.06.033

2017-02-20 修回時間：2017-03-22)