林潔++付長龍++葉錦霞++陳俊++吳廣文

【摘 要】目的：觀察膝關(guān)節(jié)炎治療儀對硝普鈉（SNP）誘導(dǎo)體外大鼠軟骨細胞凋亡的影響。方法：采用膝關(guān)節(jié)炎治療儀不同刺激強度干預(yù)1 mM SNP誘導(dǎo)第2代大鼠軟骨細胞的凋亡模型，鏡下觀察軟骨細胞形態(tài)，用噻唑藍（MTT）法檢測軟骨細胞的活力，倒置熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)及密度變化。結(jié)果：倒置相差顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)炎治療儀能減少細胞凋亡，MTT發(fā)現(xiàn)4級干預(yù)強度抑制細胞凋亡效果最佳，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色觀察其能有效減輕軟骨細胞核固縮。結(jié)論：膝關(guān)節(jié)炎治療儀可能通過抑制軟骨細胞凋亡從而達到防治骨關(guān)節(jié)炎的作用，但其具體抗凋亡途徑有待進一步揭示。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；膝關(guān)節(jié)炎治療儀；軟骨細胞；凋亡；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of therapeutic instrument for knee osteoarthritis on apoptosis of chondrocytes induced by sodium nitroprusside（SNP）in vitro.Methods：The rat（GenerationⅡ）model with apoptosis of chondrocytes induced by 1 mM SNP in vitro was intervened with different stimulus intensities，observing the morphous of chondrocytes under microscope，detecting the vitality of chondrocyte with MTT，and observing the morphous of nucleus and the changes of density under inverted fluorescent microscopy.Results：Observed under the microscope，the therapeutic instrument for knee arthritis could reduce cell apoptosis.MTT showed that 4-scale intervention was the best intensity to inhibit apoptosis.According to DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole）staining，it could effectively reduce nuclear pyknosis.Conclusion：The therapeutic instrument for knee osteoarthritis can prevent and treat osteoarthritis by inhibiting apoptosis of chondrocytes，but the specific anti apoptotic pathway needs to be further revealed.

【Keywords】 osteoarthritis；therapeutic instrument for knee osteoarthritis；chondrocytes；apoptosis；rats

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為主要病理特征的常見慢性關(guān)節(jié)性疾病[1]。隨著社會老齡化趨勢的來臨，OA患者越來越多，盡管花費大量資源研究本病但仍未發(fā)現(xiàn)特效治療方法[2]，故尋求一種有效緩解癥狀、操作方便、大眾化的治療方法成為未來需求。膝關(guān)節(jié)炎治療儀（knee arthritis therapeutic apparatus，KATA）是專門針對OA患者研制的一款便捷式家用治療儀[3]，課題組前期研究表明，KATA具有疏通經(jīng)絡(luò)、行氣活血、滑利關(guān)節(jié)的作用，能有效減輕病理表現(xiàn)、調(diào)節(jié)細胞因子分泌、促進軟骨細胞增殖[4-8]?，F(xiàn)觀察KATA對體外培養(yǎng)大鼠軟骨細胞凋亡的影響，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 4周齡清潔級SD雄性大鼠6只，體質(zhì)量60～80 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002。動物處置按照科技部2006年《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》執(zhí)行。

1.2 主要試劑 磷酸鹽緩沖液（HyClone，生產(chǎn)批號AB217272）；Ⅱ型膠原酶（VETEC，生產(chǎn)批號V900892-100MG）；DMEM（改良培養(yǎng)基）/LOW GLUCOSE（HyClone，生產(chǎn)批號ABB210359）；胎牛血清（HyClone，生產(chǎn)批號AAD201365）；青/鏈霉素（HyClone，生產(chǎn)批號J160002）；0.25%胰蛋白酶（HyClone，生產(chǎn)批號J150037）；MTT粉末

（Life Science，生產(chǎn)批號1415C035）；4%多聚甲醛溶液（Solarbio，生產(chǎn)批號20140828）；DAPI染料（Life Technologies，生產(chǎn)批號1753067）。

1.3 主要儀器 KATA（福建省祥興電子科技有限公司）；AE100電子秤（瑞士Metter公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica儀器有限公司）；多功能酶標儀（奧地利TECAN公司）；Olympus IX70倒置熒光顯微鏡（日本Olympus株式會社）。

2 實驗方法

2.1 軟骨細胞的分離和培養(yǎng) 6只SD大鼠，采用20 g·L-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，消毒并離斷雙膝，在750 mL·L-1乙醇中浸泡5 min，放入含雙抗磷酸鹽緩沖液（PBS）中。于超凈臺處剝離關(guān)節(jié)周圍肌肉、韌帶，剔除軟骨表面的滑膜，切割軟骨，將其切碎成1 mm×1 mm×1 mm大?。缓笥肞BS沖洗3次，將其置入含有3 mL質(zhì)量分數(shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿放在含體積分數(shù)為5%的CO2 37 ℃培養(yǎng)箱中；每90分鐘吸取上清于15 mL離心管中，1000 r·min-1離心機離心5 min，收集細胞沉淀；更換消化液繼續(xù)消化，重復(fù)3次。用DMEM完全培養(yǎng)液（含質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清，青鏈霉素100 U·mL-1），重懸細胞，接種于25 cm3培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；48 h后首次換液，以后每48 小時換液1次。待軟骨細胞鋪滿至80%～90%瓶底，用胰酶消化傳代。實驗使用第2代軟骨細胞。

2.2 倒置顯微鏡觀察軟骨細胞形態(tài) 取生長良好的第2代軟骨細胞調(diào)整為細胞密度1×105·mL-1后，接種于6孔板中，每孔2 mL，放置于細胞培養(yǎng)箱中。48 h后，將細胞隨機分為空白對照組、模型對照組[1 mM硝普鈉（SNP）誘導(dǎo)24 h]、干預(yù)組1（1 mM SNP + KATA 2級強度干預(yù)30 min，每日3次）、干預(yù)組2（1 mM SNP + KATA 4級強度干預(yù)30 min，每日3次）、干預(yù)組3（1 mM SNP + KATA 6級強度干預(yù)30 min，每日3次）、干預(yù)組4（1 mM SNP + KATA 8級強度干預(yù)30 min，每日3次）。其中造模方法參照文獻[9]，用SNP誘導(dǎo)軟骨細胞24 h，具體干預(yù)操作同前期實驗干預(yù)方法[10]：將預(yù)置鉑絲的六孔板蓋子換到含有細胞的六孔板上，再連接KATA進行干預(yù)。實驗結(jié)束后，于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)。

2.3 MTT檢測軟骨細胞活性 按照2.2項中的分組及處理方法干預(yù)軟骨細胞，24 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，在6孔板中每孔加入l mL質(zhì)量分數(shù)為0.5% MTT溶液，37 ℃孵育4 h后，吸棄MTT溶液，加入1 mL DMSO，振蕩10 min，轉(zhuǎn)移至96孔板，在多功能酶標儀處檢測每孔OD值，測量波長570 nm。重復(fù)實驗5次，每次設(shè)6個

復(fù)孔。

2.4 DAPI染色觀察軟骨細胞調(diào)亡情況 取生長良好的第2代軟骨細胞調(diào)整為細胞密度1×105·mL-1后，接種于6孔板中，每孔2 mL，放置于細胞培養(yǎng)箱中。48 h后，將細胞隨機分為空白對照組、模型對照組（1 mM SNP誘導(dǎo)24 h）、干預(yù)組（1 mM SNP + 采用2.3中MTT實驗發(fā)現(xiàn)的最佳作用強度進行干預(yù)30 min，每日3次）。干預(yù)24 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入500 μL質(zhì)量分數(shù)為4%的中性甲醛，于4 ℃冰箱固定。30 min后吸棄固定液，PBS洗3次，按每孔500 μL加入DAPI染液，室溫避光孵育5 min后棄染液，PBS洗3次，熒光倒置顯微鏡觀察軟骨細胞核的形態(tài)，并計算細胞的凋亡率。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，各組間比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 KATA對各組大鼠軟骨細胞形態(tài)的影響 空白對照組細胞形態(tài)表現(xiàn)為分布均勻、細胞密度較大，見圖1（1）；模型對照組和干預(yù)組4則見軟骨細胞數(shù)量減少，大部分細胞發(fā)亮、變小，培養(yǎng)液中可見飄浮軟骨細胞，見圖1（2）、1（6）；干預(yù)組1，2，3中細胞發(fā)亮、數(shù)量減少程度較模型對照組低，培養(yǎng)液中見有少量漂浮軟骨細胞，見圖1（3）、

1（4）、1（5）。

3.2 KATA干預(yù)強度與各組大鼠細胞活性的關(guān)系 模型對照組的軟骨細胞活性明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；干預(yù)組1，2中軟骨細胞活性高于模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其中干預(yù)組2的細胞活性較好；干預(yù)組3，4軟骨細胞活性有較模型對照組好的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

3.3 KATA干預(yù)后各組大鼠軟骨細胞的凋亡情況 空白對照組軟骨細胞密度較大且均勻分布，細胞核表現(xiàn)為均勻亮藍色熒光；模型對照組細胞密度較

小，細胞核呈發(fā)亮、固縮、碎裂狀態(tài)，細胞凋亡率與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；干預(yù)組可見部分細胞核固縮、發(fā)亮，但其細胞密度較模型對照組大，凋亡情況較模型對照組輕，細胞凋亡率與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2、表2。

4 討 論

關(guān)節(jié)軟骨具有承受力學(xué)負荷、吸收和緩沖應(yīng)力、潤滑等作用[11]，OA最主要的病理表現(xiàn)為軟骨損害和退變。關(guān)節(jié)軟骨是由軟骨細胞、基質(zhì)及膠原纖維構(gòu)成，軟骨細胞作為其唯一存在的細胞，增殖、凋亡和分化對于軟骨損傷及重塑具有重要影響。細胞凋亡指細胞在一定條件下，遵循自身的程序，主動結(jié)束生命的過程，是維持機體環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。越來越多的證據(jù)表明，軟骨細胞的凋亡與OA的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系[12-14]，調(diào)節(jié)軟骨細胞凋亡對于OA防治具有重要意義，故一種有效抑制軟骨細胞凋亡的療法，可較好地控制、延緩OA的病情進展。

KATA是一種物理治療儀，輸出波形為疏密波，密波2.2 s，疏波1.1 s，周期為3.3 s，密波頻率100 Hz，疏波頻率2 Hz，設(shè)有不同等級刺激強度以供使用者自行選擇。前期臨床試驗表明KATA對OA具有一定的治療作用[8，15]，前期動物實驗表明KATA能明顯改善大鼠關(guān)節(jié)軟骨損害、延緩軟骨細胞的退變[6]，但其對軟骨細胞凋亡的影響尚不明確，故本實驗從KATA對SNP誘導(dǎo)體外軟骨細胞凋亡的影響出發(fā)，以期為解答此疑問提供一些線索。

本實驗通過倒置相差顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)KATA能減少軟骨細胞凋亡。通過MTT檢測，結(jié)果顯示，干預(yù)組1，2，3，4中細胞活性均有優(yōu)于模型對照組的趨勢，干預(yù)組1，2與模型對照組細胞活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其中又以干預(yù)組2細胞活性較高，即4級干預(yù)強度能最佳地抑制細胞凋亡。DAPI是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料，常用于觀察細胞凋亡變化情況。本實驗中，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組細胞核發(fā)亮、核固縮情況較模型對照組輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

本實驗發(fā)現(xiàn)，KATA能減少軟骨細胞凋亡，為KATA防治OA提供了實驗依據(jù)，但其在體外實驗中發(fā)揮抗凋亡作用的具體途徑有待后期研究進一步補充。本研究存在一些不足之處，如兩電極間距、培養(yǎng)液不同造成電阻不同，從而導(dǎo)致電流刺激不盡相同，這些物理學(xué)、生物學(xué)方面的問題還有待多學(xué)科合作共同解決。

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收稿日期：2016-10-28；修回日期：2017-03-13