梁欽博 鄧呈亮 魏在榮 王波 張文奪 王達(dá)利

人瘢痕疙瘩間充質(zhì)樣干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中Notch信號(hào)表達(dá)的研究

梁欽博 鄧呈亮 魏在榮 王波 張文奪 王達(dá)利

目的 研究人瘢痕疙瘩間充質(zhì)樣干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，Notch 1～4受體的表達(dá)情況，探討Notch信號(hào)通路是否參與調(diào)控人瘢痕疙瘩間充質(zhì)樣干細(xì)胞的成骨分化。方法 經(jīng)患者知情同意后，分離培養(yǎng)人瘢痕疙瘩間充質(zhì)樣干細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD29、CD34、CD44、CD45及CD90的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Oct 4的表達(dá)；體外誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)3周后行茜素紅染色；于誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后2、3周，采用實(shí)時(shí)定量-多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及免疫蛋白印跡法（western blot），分別檢測(cè)細(xì)胞Notch 1～4受體mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表型 CD29（98.76%）、CD44（98.11%）、CD90（97.86%），不表達(dá)造血干細(xì)胞表型 CD34（0.05%）、CD45（0.03%）；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)多能干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4呈陽(yáng)性表達(dá)；向成骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)3周后，茜素紅染色可見(jiàn)明顯的鈣鹽結(jié)節(jié)。RT-PCR和western blot結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，Notch 1～4受體mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 在人瘢痕疙瘩間充質(zhì)樣干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，Notch受體信號(hào)的表達(dá)逐漸減弱，低水平的Notch信號(hào)激活可能有利于瘢痕疙瘩間充質(zhì)樣干細(xì)胞的成骨分化。

瘢痕疙瘩；間充質(zhì)干細(xì)胞；Notch信號(hào)通路；成骨分化

瘢痕疙瘩是人體真皮損傷后引發(fā)或自發(fā)產(chǎn)生 的以膠原及細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積所致的過(guò)度瘢痕化，目前尚無(wú)理想的治療方法。Notch信號(hào)通路是在動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)通路，其參與干細(xì)胞的早期分化，決定干細(xì)胞的分化方向，是調(diào)控干細(xì)胞分化的重要信號(hào)通路。大量研究表明，Notch信號(hào)通路對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stemcells，MSCs）成骨分化的調(diào)控存在爭(zhēng)議[1-2]。我們前期研究在瘢痕疙瘩中分離出干細(xì)胞（keloid-derived mesenchymal stem cells，KMSCs)，經(jīng)誘導(dǎo)后可以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞方向分化，且通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Notch 1～4基因在KMSCs中表達(dá)[3-4]。而既參與調(diào)控MSCs的分化，又可能參與瘢痕疙瘩形成的Notch信號(hào)通路，是否調(diào)控KMSCs的分化，目前尚不清楚。自2014年9月至2015年9月，我們參照前期研究方法，分離出KMSCs，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白印跡法檢測(cè)誘導(dǎo)前后不同時(shí)間段細(xì)胞中Notch 1～4受體mRNA和蛋白的表達(dá)，比較mRNA和蛋白的相關(guān)變化，為進(jìn)一步研究KMSCs的定向分化抑制和瘢痕疙瘩的治療，提供基礎(chǔ)研究的資料。

1 對(duì)象與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及制備

本研究獲得遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)（遵醫(yī)倫理批復(fù)20150612）同意。手術(shù)切除瘢痕疙瘩6例，由遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科提供。瘢痕疙瘩病史1～2年，平均16個(gè)月；男性3例，女性3例；年齡18～65歲。瘢痕疙瘩位于前胸、后背、耳垂等部位，手術(shù)前均未接受相關(guān)治療。所有離體標(biāo)本均由患者簽屬知情同意書(shū)。標(biāo)本離體后，無(wú)菌條件下收集保存，在2 h內(nèi)開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞提取。

1.2 主要儀器與試劑

PCR基因擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96）、PCR 擴(kuò)增儀（C1000PCR）、全能型凝膠成像分析系統(tǒng)（ChemiDocMP）均由美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀（Accuri C6，美國(guó)Becton Dickinson公司）；小鼠抗人單克隆熒光標(biāo)記抗體（CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD90-FITC、CD45-APC，美國(guó)eBioscience公司）；Western相關(guān)試劑（北京博奧森生物技術(shù)公司）；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑（美國(guó)Sigma公司）。

1.3 方法

1.3.1 人KMSCs的分離、培養(yǎng) 收集手術(shù)切除的瘢痕疙瘩標(biāo)本，修剪、切割后加入3 mg/ml的Ⅱ型中性蛋白酶于4℃下消化，次日棄上皮，剪切真皮部分，加入Ⅰ型膠原酶，置于37℃下消化2 h，加入DnaseⅠ終止消化；離心棄上清液，重懸細(xì)胞，過(guò)濾、離心，添加10 ml增殖培養(yǎng)基（含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，添加1%雙抗、2 mML-谷氨酰胺、100 mM非必須氨基酸及550 μm2-巰基乙醇）懸浮，接種培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)；待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%，消化后離心，培養(yǎng)基重新懸浮，按1×104/cm2的細(xì)胞密度傳代接種，每隔3 d換液1次。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人KMSCs表面標(biāo)志 收集第3代KMSCs，洗滌2次，加入PBS，震蕩，直接加入熒光素標(biāo)記的小鼠抗人抗體，室溫避光孵育20～25 min，加入PBS 2 ml，震蕩洗滌，離心去上清液，加入200 μl多聚甲醛固定液，上機(jī)分析，采用小鼠抗人的IgG作為同型對(duì)照。

1.3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Oct4的表達(dá) 取第3代人KMSCs接種于放置蓋玻片的培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，培養(yǎng)72 h后取出蓋玻片，漂洗，4%多聚甲醛固定，沖洗，加入山羊血清封閉液孵育約30 min，加入Oct4抗體一抗過(guò)夜，次日復(fù)溫，漂洗，加入二抗，置于37℃下30 min，沖洗，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，沖洗，蘇木素染色液復(fù)染，光鏡觀(guān)察并拍照。

1.3.4 體外誘導(dǎo)人KMSCs向成骨細(xì)胞分化 取第3代人KMSCs，以1×105/ml細(xì)胞密度接種于預(yù)放置蓋玻片的6孔板內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%～90%，換成3 ml/孔成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含5 mMβ-GP、1×10-7mmol/L DEX、50μg/ml vitamin C、10%FBS），于37℃、5%CO2細(xì)胞孵箱培養(yǎng)，2～3 d換液1次，誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行茜素紅S染色，檢測(cè)鈣鹽沉積；吸棄成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液，漂洗，4%多聚甲醛固定，1%茜素紅S染色5 min，顯微鏡下觀(guān)察。

1.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)14、21 d目的細(xì)胞Notch 1～4 mRNA的表達(dá) ⑴引物設(shè)計(jì)。引物由大連寶生物TAKARA公司設(shè)計(jì)、合成。Notch1：F：5′GCTACGA GTGTGCCTGTGA 3′R：5′AGCCATTGATGCCGTCCTC 3′，擴(kuò)增片段為 117bp；Notch 2：F ：5′AGTGGTATGGACTGTGAGGAG 3′R ：5′GAAGGCAGAGGCA GGAGAA 3′，擴(kuò)增片段為106bp；Notch 3：F：5′CGATGTCAACGAGTGTCTGTC 3′R：5′TGTG TTGG CGTACAGGTCTT 3′，擴(kuò)增片段為100bp；notch4：F：5′TCG GTGCTGGCTTCTCTTC 3′R：5′TACTGGTCATAGGCTGGAGTG 3′，擴(kuò)增片段 為 120 bp；β-actin：F：5′GCACTCTTCCAGCCTTCCTT 3′R：5′TGTGTTGGCGTAC AGGTCTT 3′；擴(kuò)增片段為114 bp。⑵總RNA的提取及Realtime-PCR。收集待測(cè)細(xì)胞，常規(guī)方法提取總RNA，檢測(cè)OD值，計(jì)算RNA濃度。10 μl體系（含200 ng總RNA）反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以（20 μl）擴(kuò)增體系在 ABI 7900 qPCR儀上進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。預(yù)變性95℃，2 min，變性 94℃，20 s，退火 65℃，20 s，延伸72℃，30 s；共40個(gè)循環(huán)。以樣本Ct值作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，內(nèi)參基因 Ct=（Ct1+Ct2+Ct3）/3；用相對(duì)定量公式XN,C=2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 免疫蛋白印跡法檢測(cè)誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)14、21 d目的細(xì)胞Notch 1～4 mRNA的表達(dá) 在目的細(xì)胞中分別加入蛋白裂解液，研磨提取總蛋白，低溫保存?zhèn)溆?；BCA法測(cè)蛋白濃度；30 μg/孔上樣后100 V電泳；濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用10%脫脂奶粉封閉1 h；加入1∶600兔抗人Notch 1～4單克隆抗體，4℃過(guò)夜；二抗為1∶4000辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG，于常溫下作用1 h；用LumiLight化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光、顯影、定影。實(shí)驗(yàn)用兔抗人β-actin多克隆抗體（1∶600）作為內(nèi)參。所得顯影后，用Quantity One圖像分析系統(tǒng)掃描條帶的灰度值，以Notch 1～4條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，整理分析數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 人KMSCs的形態(tài)和生長(zhǎng)特性

原代培養(yǎng)的KMSCs在倒置顯微鏡下觀(guān)察，細(xì)胞呈短梭形、三角形、橢圓形等不規(guī)則形狀，原代細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，3～4 d增殖速度加快，8～10 d細(xì)胞可連續(xù)生長(zhǎng)至瓶底80%～90%；傳代培養(yǎng)的KMSCs較原代更易貼壁，且增殖速度加快，5～6 d細(xì)胞匯合率可達(dá)90%以上，細(xì)胞排列不規(guī)則，胞體拉伸，形態(tài)均一，多為長(zhǎng)梭形（圖 1，2）。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志

采用流式細(xì)胞術(shù)分析第3代細(xì)胞表型。結(jié)果顯示，該細(xì)胞群高表達(dá) MSCs表型 CD29、CD44、CD90；不表達(dá)造血系統(tǒng)抗原標(biāo)記CD34、CD45。見(jiàn)圖3。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Oct4的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，人KMSCs細(xì)胞核呈棕黃色，多能干細(xì)胞標(biāo)志Oct4呈陽(yáng)性表達(dá)，用PBS處理的空白對(duì)照組為陰性表達(dá)（圖4，5）。

2.4 人KMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

人KMSCs在誘導(dǎo)劑作用下進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)呈多邊形或不規(guī)則形狀，簇狀分布，重疊生長(zhǎng)。細(xì)胞團(tuán)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。3周后茜素紅染色可見(jiàn)明顯鈣鹽結(jié)節(jié)形成（圖6，7）。

2.5 RT-PCR檢測(cè)KMSCs Notch 1～4基因表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，Notch 1～4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表 1）。

2.6 Western Blot檢測(cè)KMSCs Notch 1～4蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，Notch 1～4蛋白的相對(duì)表達(dá)量逐漸減少，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表 2，圖 8。

表1 RT-PCR檢測(cè)Notch 1～4基因不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)情況±s

表1 RT-PCR檢測(cè)Notch 1～4基因不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)情況±s

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表2 Western蛋白印跡法檢測(cè)Notch 1～4蛋白不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況±s

表2 Western蛋白印跡法檢測(cè)Notch 1～4蛋白不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況±s

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3 討論

Notch信號(hào)通路是在動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)通路，可介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)接觸，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化。Notch信號(hào)通路激活，導(dǎo)致Notch相關(guān)受體上調(diào)，同時(shí)下調(diào)Notch相應(yīng)配體，而Notch配體的表達(dá)對(duì)Notch受體有下調(diào)作用。這種正反饋機(jī)制，使Notch受體及配體的細(xì)微差別在干細(xì)胞增殖發(fā)育過(guò)程中不斷放大，從而決定了干細(xì)胞的不同分化方向[5-6]。Notch信號(hào)通路在調(diào)控成體干細(xì)胞分化方面發(fā)揮重要作用，一般認(rèn)為，增強(qiáng)Notch通路會(huì)促進(jìn)成體干細(xì)胞分化[7-8]。而在MSCs分化方面，Notch通路所發(fā)揮的作用不盡相同，Notch通路的激活或阻滯與MSCs具體分化為何種功能細(xì)胞有關(guān)[9-12]。在Notch信號(hào)通路中，對(duì)MSCs成骨定向分化方面的研究較多，目前存在的爭(zhēng)議也較大。有研究表明[1-2]，Notch信號(hào)通路激活可以促進(jìn)MSCs的成骨分化，也能抑制MSCs的成骨分化。可見(jiàn)，MSCs在成骨分化過(guò)程中，Notch信號(hào)的表達(dá)情況，目前的研究并不清楚。Syed和Bayat[13]通過(guò)RT-PCR檢測(cè)瘢痕疙瘩與正常皮膚真皮組織中Notch 1～4受體及配體的表達(dá)，在體外激活或阻斷Notch信號(hào)通路后，研究瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)活性的改變，表明Notch信號(hào)通路參與了瘢痕疙瘩的形成。研究組前期結(jié)果顯示，Notch信號(hào)通路和KMSCs均與瘢痕疙瘩的形成有關(guān)。但是，不同的Notch亞型在腫瘤形成過(guò)程中，發(fā)揮的作用也不盡相同，而KMSCs與Notch信號(hào)通路及其不同亞型的關(guān)系如何，Notch信號(hào)通路是否參與調(diào)控KMSCs的分化，對(duì)于臨床研究瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制以及防治有著重要的作用。

圖1 人KMSCs原代培養(yǎng)第2天（倒置顯微鏡×40） 圖2 人KMSCs第3代第2天（倒置顯微鏡×40） 圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人KMSCs表面標(biāo)志分子 a.CD29-PE陽(yáng)性率為98.76% b.CD44-FITC陽(yáng)性率為98.11% c.CD90-FITC陽(yáng)性率為97.86% d.CD34-APC陽(yáng)性率為0.05% e.CD45-PE陽(yáng)性率為0.03% 圖4 人KMSCs內(nèi)Oct4呈陽(yáng)性表達(dá)（倒置顯微鏡×400） 圖5 空白對(duì)照組（倒置顯微鏡×400） 圖6 人KMSCs誘導(dǎo)前（倒置顯微鏡×40） 圖7 誘導(dǎo)3周后，可見(jiàn)明顯的鈣鹽結(jié)節(jié)（茜素紅染色×40） 圖8 誘導(dǎo)前后Notch 1～4的相對(duì)表達(dá)情況

本研究參照了前期的研究方法，從臨床收集的瘢痕疙瘩中成功分離MSCs，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，該類(lèi)細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44、CD90等間充質(zhì)來(lái)源的表面標(biāo)志，不表達(dá)CD34、CD45等造血干細(xì)胞特征表面標(biāo)志。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)該細(xì)胞群Oct4蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性。采取成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%FBS、1×10-7mmol/L DEX、50 μg/ml vitamin C、5 mM β-GP），誘導(dǎo)3周后可見(jiàn)明顯的鈣鹽沉積，說(shuō)明所提取細(xì)胞已成功誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，提示該細(xì)胞確實(shí)具有向成骨細(xì)胞分化的潛能。這些進(jìn)一步證實(shí)了瘢痕疙瘩中存在MSCs，且在誘導(dǎo)KMSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，于誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后2、3周不同時(shí)間段，采取實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)Notch不同亞型的mRNA、蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，Notch不同亞型的mRNA、蛋白的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，Notch信號(hào)通路逐漸減弱。本研究結(jié)果提示，Notch信號(hào)通路可能負(fù)調(diào)控KMSCs的成骨分化，激活低水平的Notch信號(hào)，有利于KMSCs的成骨分化。當(dāng)然，在KMSCs的成骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中，Notch信號(hào)通路逐漸減弱，也有可能是調(diào)控MSCs成骨分化的其他信號(hào)通路，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、Wnt信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路的激活導(dǎo)致Notch信號(hào)通路抑制。V Deregowski（2006年）和MJ Hilton（2008年）先后報(bào)道了Notch信號(hào)能調(diào)節(jié)BMP或Wnt信號(hào)誘導(dǎo)的成骨形成，可見(jiàn)MSCs的成骨分化雖涉及多種信號(hào)通路，可能共同影響細(xì)胞的命運(yùn)，但Notch信號(hào)通路均通過(guò)直接或間接的形式參與，是最重要的誘導(dǎo)成骨分化的信號(hào)通路。本研究的不足在于收集的臨床樣本較少，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義仍有待大樣本量的研究。另外，研究結(jié)果僅能說(shuō)明在KMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，Notch信號(hào)通路有改變，但無(wú)法很好地反映Notch信號(hào)通路在MSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的具體作用。下一步的研究將考慮加入Notch信號(hào)通路的激動(dòng)劑或阻斷劑，以觀(guān)察KMSCs的分化。

總之，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Syed等[13]的研究，即Notch信號(hào)通路參與了瘢痕疙瘩的形成。同時(shí)，我們推測(cè)，瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制與腫瘤有高度的相似性，瘢痕疙瘩內(nèi)存在MSCs；Notch信號(hào)通路極有可能參與調(diào)控KMSCs的自我更新與分化；低水平的Notch信號(hào)激活可能有利于KMSCs的分化，高水平的Notch信號(hào)激活可能抑制KMSCs的分化，維持KMSCs的自我更新。因此，若阻斷Notch信號(hào)通路，維持Notch信號(hào)持續(xù)處于低水平，可能會(huì)促進(jìn)KMSCs的分化；若能精細(xì)調(diào)控這些信號(hào)通路，可避免KMSCs向成纖維細(xì)胞方向分化，從而有望達(dá)到控制瘢痕疙瘩發(fā)生、發(fā)展的目的。

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Expression of Notch signaling pathway expression in the differentiation of human keloid-derived mesenchymal stem cells into osteoblast

LIANG Qin-bo,DENG Cheng-liang,WEI Zai-rong,WANG Bo,ZHANG Wen-duo,WANG Da-li.(Department of Plastic Surgery,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563000,China)

Objective To study the expression of Notch receptor 1 to 4 in the differentiation of human keloid-derived mesenchymal stem cells (hKMSCs)into osteoblast.To explore whether the Notch signaling pathway participates in the regulation of osteogenic differentiation of hKMSCs.Methods hKMSCs were isolated and cultured after patients＇informed consent.The expression of CD29,CD34,CD44,CD45 and CD90 were detected by flow cytometry,and the expression of Oct4 was detected by immunocytochemistry.hKMSCs were induced to differentiate into the osteoblast in vitro,and alizarin red staining was performed at 3 weeks after induced.RT-PCR and Western Blot were performed to detect the expression of mRNA and protein of Notch receptor 1 to 4 at 2 and 3 weeks before and after induction.Results The results of flowcytometry showed that mesenchymal stem cell phenotype of CD29(98.76%),CD44(96.45%)and CD90(97.86%)were highly expressed and hematopoietic stem cell phenotype of CD34(0.05%)and CD45(0.03%)were expressed at a low level.The results of immunocytochemistry showed that the expression of pluripotent stem cell marker Oct4 was positive.After 3 weeks of osteogenic inductionin vitro,obvious calcium salt nodules could be seen through alizarin red staining.The results of RT-PCR and Western Blot showed that with the prolongation of induction time,the relative expression of mRNA and protein of Notch receptor 1 to4 was graduallyreduced.The difference was statisticallysignificant(P＜0.05).Conclusion In the differentiation ofhKMSCs into osteoblast,the expression of the Notch signaling pathway was gradually weakened.Lowlevel of Notch signal activation was beneficial to the osteogenic differentiationof hKMSCs.

Keloid;Mesenchymal stemcells;Notch signalingpathway;Osteogenic differentiation

Deng Cheng-liang,Email:cheliadeng@sina.com.

2016-11-16）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.02.016

2012-2016國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科基金 國(guó)衛(wèi)辦醫(yī)函[2013]544，國(guó)家自然科學(xué)基金（81660323），貴州省科學(xué)技術(shù)基金（黔科合J字LKZ[2012]31號(hào)）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.02.016

遵義醫(yī)學(xué)院附院 燒傷整形外科，貴州 遵義 563003

鄧呈亮，Email：cheliadeng@sina.com

本文引用格式：梁欽博,鄧呈亮,魏在榮,等.人瘢痕疙瘩間充質(zhì)樣干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中Notch信號(hào)表達(dá)的研究 [J].中國(guó)美容整形外科雜志,2017,28(2)：118-122.