陳海妮 沈衛(wèi)民 崔杰 陳建兵 韓濤 季易 高慶文

皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)對(duì)兒童表皮細(xì)胞PAX3表達(dá)的影響

陳海妮 沈衛(wèi)民 崔杰 陳建兵 韓濤 季易 高慶文

目的 比較兒童行皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)前后表皮細(xì)胞配對(duì)盒子（paired box 3,PAX3）表達(dá)的差異，為探討其臨床作用機(jī)制提供依據(jù)。方法 通過(guò)HE染色和免疫組化染色，比較擴(kuò)張前后皮膚軟組織切片和表皮細(xì)胞PAX3蛋白平均光密度變化的情況。結(jié)果 擴(kuò)張后表皮中黑素細(xì)胞增多，PAX3陽(yáng)性區(qū)域平均光密度在擴(kuò)張后為0.37±0.05，且顯著高于擴(kuò)張前0.28±0.06，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)在一定程度上會(huì)導(dǎo)致黑素細(xì)胞數(shù)目增多，可能與兒童表皮細(xì)胞PAX3基因表達(dá)增加有關(guān)。

皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)；黑素細(xì)胞；配對(duì)盒子；兒童

皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)用于兒童在整形外科中的治療日漸增加，其作用機(jī)制可能與擴(kuò)張器注水后產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力增加，誘導(dǎo)皮膚組織中產(chǎn)生多種細(xì)胞因子而促進(jìn)組織生長(zhǎng)密切相關(guān)。但臨床觀察發(fā)現(xiàn)，有部分患兒的擴(kuò)張區(qū)域皮膚色素呈加深現(xiàn)象，具體機(jī)制不詳。既往研究提示，兒童在燒傷、瘢痕、皮膚移植、外傷或手術(shù)后可引起暫時(shí)性或永久性的色素沉著[1]。因此，皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)對(duì)兒童皮膚色素影響的機(jī)制亟待探究。黑素細(xì)胞能合成分泌黑素小體，是各種因素導(dǎo)致皮膚色素加深的靶細(xì)胞，其在表皮層中的分布改變與皮膚色素有關(guān)；配對(duì)盒子（paired box3,PAX3）是調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞活力重要的轉(zhuǎn)錄因子，PAX3在胚胎發(fā)育的早期參與黑色素母細(xì)胞的形成，并激活不同的下游靶基因參與黑素細(xì)胞的增殖、分化和生存途徑遷移[2]。本研究通過(guò)觀察兒童皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)前、后皮膚切片的組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并使用免疫組織化學(xué)方法對(duì)比表皮中PAX3蛋白表達(dá)變化情況，以期更深入地研究擴(kuò)張術(shù)的機(jī)制，旨在為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇自2012年1月至2015年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院燒傷整形科收治的27例行皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)和擴(kuò)張皮瓣轉(zhuǎn)移術(shù)患兒的皮膚標(biāo)本進(jìn)行自身對(duì)照研究。術(shù)前均簽署知情同意書。男性14例，女性13例；年齡3～11歲。其中，面頸部11例，胸部7例，上肢部9例。皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)后，常規(guī)行間斷注水?dāng)U張6～8周；組織標(biāo)本均取自皮膚軟組織擴(kuò)張器埋置和擴(kuò)張皮瓣轉(zhuǎn)移術(shù)中。擴(kuò)張后的標(biāo)本在皮瓣中部取材，以免造成皮瓣損傷；對(duì)照標(biāo)本取自擴(kuò)張器埋置術(shù)前的切口周緣正常皮膚組織。每部位切取3 mm×3 mm×3 mm的組織塊，用于組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2 HE染色組織切片分析 每張切片均由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行病理診斷，并在光鏡下觀察表皮組織及皮膚附件的改變。

1.3 PAX3蛋白免疫組化染色陽(yáng)性區(qū)域平均光密度分析 將取材組織用4%多聚甲醛固定過(guò)夜，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟和石蠟包埋后切片。蠟塊組織3 μm厚切片，梯度脫蠟后PBS緩沖液沖洗，微波修復(fù)抗原；3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，經(jīng)PBS緩沖液沖洗；切片加入稀釋好的兔抗人單克隆抗體PAX3（英國(guó)ABCAM公司），稀釋度為1∶50，室溫孵育1 h，PBS緩沖液沖洗；加入二抗后，室溫孵育10 min，PBS緩沖液沖洗；滴加DAB顯色液，用蒸餾水沖洗后行蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。然后用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。每張免疫組化切片隨機(jī)在400倍顯微視野下，選擇5個(gè)獨(dú)立區(qū)域進(jìn)行彩色圖像拍照采集，胞漿和胞核出現(xiàn)黃或棕黃色顆粒者為陽(yáng)性，同時(shí)將圖片導(dǎo)入Image Pro.Plus 6.0軟件，計(jì)算出每個(gè)視野中PAX3平均光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 在200倍光鏡下觀察擴(kuò)張前后表皮組織變化，可見網(wǎng)狀纖維大量增生（圖1），以附件和毛細(xì)血管周圍較為明顯，真皮乳頭層的彈力纖維呈大量增生；擴(kuò)張術(shù)后，表皮基底層黑素細(xì)胞較術(shù)前明顯增多，且與黑素細(xì)胞相鄰近的角朊細(xì)胞中的黑素顆粒也明顯增多。黑素細(xì)胞位于表皮基底細(xì)胞和棘細(xì)胞之間，其胞漿和/或胞核呈黃色或棕黃色顆粒。擴(kuò)張術(shù)后，黑素細(xì)胞主要分布于表皮基底層與角質(zhì)形成細(xì)胞之間；基底膜帶中的黑素細(xì)胞比例較術(shù)前明顯增多。

2.2 PAX3蛋白免疫組化染色 在400倍光鏡下觀察PAX3陽(yáng)性著色主要位于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的胞漿和胞核（圖2），呈黃色或棕黃色。PAX3陽(yáng)性區(qū)域平均光密度分析，擴(kuò)張組為0.37±0.05，顯著高于對(duì)照組0.28±0.06，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

目前，皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)是整形外科中用于兒童獲取自體皮膚的重要方法，因此，在兒童的瘢痕修復(fù)、皮膚腫瘤切除等方面應(yīng)用較廣泛[3]。其機(jī)制主要以組織擴(kuò)張的方法達(dá)到皮膚面積增加和皮膚血管的新生。但已知機(jī)械應(yīng)力會(huì)造成顯著的組織學(xué)改變，從而影響皮膚組織細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)、酶和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的變化；楊登峰等[4]研究顯示，大鼠擴(kuò)張后的皮膚表皮層明顯增厚，真皮層變??；免疫組織化學(xué)染色可見增殖細(xì)胞呈點(diǎn)狀分布，主要集中于表皮基底層和毛囊鞘；這可能對(duì)表皮不同類型的細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，且間接影響皮膚的質(zhì)地與色澤。兒童處于生長(zhǎng)發(fā)育期，應(yīng)用皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)可能產(chǎn)生皮膚色素改變，其機(jī)制較為復(fù)雜，部分原因可能與擴(kuò)張術(shù)后血運(yùn)變化、手術(shù)創(chuàng)傷和炎癥刺激等有關(guān)。

皮膚黑素細(xì)胞是位于表皮基底層的樹突狀細(xì)胞，能合成分泌黑素小體。成熟后的黑素小體經(jīng)黑素細(xì)胞樹突轉(zhuǎn)運(yùn)至角質(zhì)形成細(xì)胞，而角質(zhì)形成細(xì)胞中黑素小體的多少、大小和聚集方式，則主要影響皮膚的顏色。既往對(duì)擴(kuò)張后皮膚色素改變情況缺乏探討，本研究通過(guò)對(duì)比擴(kuò)張前、后組織切片，觀察到擴(kuò)張后皮膚黑素細(xì)胞的數(shù)量增多，PAX3染色顯著增強(qiáng)，間接說(shuō)明擴(kuò)張術(shù)可以增強(qiáng)黑素細(xì)胞的活性，這或許與皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)增加局部皮膚機(jī)械應(yīng)力同時(shí)，促進(jìn)了擴(kuò)張區(qū)域PAX3等生長(zhǎng)因子的合成與釋放，間接地促進(jìn)了黑素細(xì)胞的增殖有關(guān)。

PAX3是生物體中普遍存在的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，高度表達(dá)于黑素細(xì)胞，包括其干細(xì)胞和成熟的分化細(xì)胞；對(duì)黑色素母細(xì)胞的分化、遷移、增殖以及分化為黑色素細(xì)胞，均起到了重要的作用；黑素細(xì)胞作為皮膚的色素產(chǎn)生細(xì)胞，由PAX3在胚胎發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄形成[5]；PAX3還能促進(jìn)黑色素母細(xì)胞從神經(jīng)嵴中遷移，促使黑色素干細(xì)胞從毛囊遷移至皮膚的真皮乳頭處[6]。目前研究認(rèn)為，皮膚色素沉著主要與黑素細(xì)胞的功能有關(guān)，PAX家族參與了其中的部分功能[7]。皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)可通過(guò)產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力激活多種生長(zhǎng)因子，并通過(guò)釋放堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等生物活性物質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖。有研究證實(shí)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白2（fibroblast growth factor 2,FGF2）可通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）激活PAX3轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞活力[8]。因此，筆者認(rèn)為，擴(kuò)張術(shù)后的表皮細(xì)胞內(nèi)PAX3染色顆粒增多，可能與組織擴(kuò)張后機(jī)械應(yīng)力增加、繼發(fā)產(chǎn)生的炎癥因子及生長(zhǎng)因子表達(dá)增加、激活了PAX3的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有關(guān)。這從分子水平闡釋了皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)可通過(guò)增加機(jī)械應(yīng)力促使黑素細(xì)胞表達(dá)和分布。

圖1 擴(kuò)張術(shù)前后表皮組織變化（HE×200） a.擴(kuò)張術(shù)前 b.擴(kuò)張術(shù)后2個(gè)月圖2 擴(kuò)張術(shù)前后表皮組織PAX3蛋白變化（免疫組化染色×400） a.擴(kuò)張術(shù)前 b.擴(kuò)張術(shù)后2個(gè)月

PAX3基因在幼年黑素細(xì)胞從神經(jīng)嵴至表皮/真皮邊界遷移、發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)發(fā)揮著重要作用，但在成年黑色素細(xì)胞中PAX-3表達(dá)顯著減少[9-10]。本研究主要針對(duì)兒童皮膚擴(kuò)張術(shù)后PAX3的表達(dá)增加進(jìn)行了初步觀察，對(duì)成人的具體影響仍需進(jìn)一步探索，以期更全面地理解其具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，獲取更理想的皮膚擴(kuò)張效果。

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The Changes of PAX3 expression in pediatric skin after tissue expansion surgeries

CHEN Hai-ni,SHEN Wei-min,CUI Jie,CHEN Jian-bin,HAN Tao,JI Yi,GAO Qing-wen.(Department of Burned and Plastic Surgery,Nanjing Children Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing 210000,China)

Objective To investigate the change of paired box 3（PAX3）protein expression in 27 pediatric cases undergoing tissue expansion surgeries.Methods Hematoxylin and eosin stain (HE stain)was performed to detect histomorphology changes.PAX3 protein expression was evaluated with average optical density by immunohistochemical technique.Results Melanocytes in the epidermis increased after expansion.The average optical density of the PAX3 protein positive area was 0.37±0.05 after expansion,significantly higher than that before the expansion (P＜0.01).Conclusion Skin soft tissue expansion results in the increase ofmelanocytes toa certain extent.This maybe related tothe increased expression ofPAX3 in pediatric epidermic cells.

Skin soft tissue expansion;Melanocyte;Paired box;Children

SHEN Wei-min,Email:swmswmswm@sina.com

2016-09-17）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.02.015

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.02.015

南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 燒傷整形科，江蘇 南京 210000

沈衛(wèi)民，Email：swmswmswm@sina.com

本文引用格式：陳海妮,沈衛(wèi)民,崔杰,等.皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)對(duì)兒童表皮細(xì)胞PAX3表達(dá)的影響[J].中國(guó)美容整形外科雜志,2017,28(2)：115-117.