李 坤，連 君，朱 瑾，曾 辛，陳紅兵，吳志華,*

還原協(xié)同加熱處理對花生過敏原Ara h 2結(jié)構(gòu)及抗原性的影響

李 坤1,2，連 君1,3，朱 瑾4，曾 辛5，陳紅兵1,6，吳志華1,6,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；4.江西省兒童醫(yī)院感染科，江西 南昌 330006；5.江西省婦幼保健院臨床實驗室，江西 南昌 330031；6.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

花生過敏能引起蕁麻疹、嘔吐甚至休克等癥狀，通常是終生性過敏。本研究運用加熱處理、半胱氨酸還原對Ara h 2進行單獨和復(fù)合處理，采用圓二色譜、紫外掃描光譜、間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測蛋白加工前后的結(jié)構(gòu)與抗原性變化。結(jié)果顯示，單一的加熱和半胱氨酸還原處理過的蛋白結(jié)構(gòu)與抗原性只發(fā)生部分變化。而復(fù)合處理中，在加熱條件下，半胱氨酸還原蛋白的能力明顯增強，還原后的蛋白二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)發(fā)生大幅變化，抗原性顯著降低。研究結(jié)果表明，二硫鍵對于蛋白Ara h 2結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要作用，二硫鍵被還原和加熱過程破壞后，蛋白的抗原性和結(jié)構(gòu)即發(fā)生重大變化。還原協(xié)同加熱處理有望大幅改善2S球蛋白的結(jié)構(gòu)和致敏性，可以作為蛋白脫敏加工的備選方法。

花生；熱加工；Ara h 2；二硫鍵；結(jié)構(gòu)；抗原性

引文格式：

李坤, 連君, 朱瑾, 等. 還原協(xié)同加熱處理對花生過敏原Ara h 2結(jié)構(gòu)及抗原性的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(11): 89-94. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711015. http://www.spkx.net.cn

LI Kun, LIAN Jun, ZHU Jin, et al. Synergistic effect of cysteine reduction and thermal treatment on structure and antigenicity of peanut allergen Ara h 2[J]. Food Science, 2017, 38(11): 89-94. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711015. http://www.spkx.net.cn

隨著人們生活質(zhì)量的提高，對于食物的選擇不再局限于溫飽，更加注重的是安全和質(zhì)量，而食物過敏的問題及研究也越來越受到重視，世界公認的八大過敏原中，花生位居其一[1-2]。由于花生蛋白的營養(yǎng)高風(fēng)味佳，作為食物配料被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，其致敏性引起了廣泛關(guān)注[3-4]。目前已知的花生過敏原可分為4 類，分別為Cupin超家族（Ara h 1、3）、醇溶蛋白超家族（Ara h 2、6、7、9）、抑制蛋白家族（Ara h 5）、Bet V1同源蛋白（Ara h 8）以及另外兩種：Oleosin油質(zhì)蛋白（Ara h 10、11）、Defensin抵抗素（Ara h 12、13）[5]。其中Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 6是花生的主要過敏原[6]，而Ara h 2是最強的花生過敏原之一，并且能被90%的花生過敏患者血清識別，因此被認為是花生中同時具有強致敏性和廣泛性的過敏原[7-8]。

Ara h 2屬于2S種子貯藏蛋白家族，有Ara h 2.01和Ara h 2.02兩個亞型，分子質(zhì)量分別約為18.7 kD和20.1 kD，pI值為5.2，占花生蛋白總量的10%左右[7,9-10]。關(guān)于花生過敏原Ara h 2致敏性的研究，國內(nèi)外已有了較多的報道[11-15]，已有報道稱二硫鍵對于蛋白Ara h 2的致敏性有重要影響[16-17]，但這些研究采用的還原劑均為二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），它因為具有高毒性而不被允許運用在食品加工中，而且這些研究中對于蛋白還原前后結(jié)構(gòu)變化的細致探討較少，本研究中選擇半胱氨酸作為還原劑，半胱氨酸是一種天然的還原性氨基酸，在食品加工中具有廣泛用途[18-20]，而半胱氨酸是一種弱還原劑，本實驗首先研究了加熱條件下半胱氨酸還原能力的變化，然后運用圓二色譜法及紫外掃描色譜法測定表征蛋白在還原處理前后高級結(jié)構(gòu)的變化，通過間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測加工蛋白的抗原性變化，深入分析了半胱氨酸還原協(xié)同加熱處理對于Ara h 2結(jié)構(gòu)以及抗原性的影響，為半胱氨酸在食品加工中的進一步應(yīng)用以及為脫敏或低致敏花生蛋白的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生產(chǎn)自江西省，為贛花花生品種，購自江西省南昌市青山湖市場?；ㄉ鞍譇ra h 2及其多克隆兔血清由食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室自行制備[21]。

酶標板 美國Corning公司；其他試劑 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

J-810圓二色譜儀 日本Jasco公司；UV WinLab V6紫外-可見分光光度儀 美國PerkinElmer公司；1860酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 還原和加熱處理

依照胡純秋等[21]所述方法進行過敏原Ara h 2的純化，純化后的花生蛋白Ara h 2，其純度在90%以上。為比較熱加工與半胱氨酸還原單獨處理或復(fù)合處理對Ara h 2過敏原蛋白的構(gòu)象及抗原性影響，分別準備4組Ara h 2樣品，樣品經(jīng)50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）稀釋到1 mg/mL，第1組為未處理樣品（記為N-Ara h 2），第2組為5 mmol/L的半胱氨酸常溫（室溫25 ℃，常溫37 ℃：僅在還原程度分析中用到該樣品）還原處理1 h樣品（記為R-Ara h 2），第3組為80 ℃條件下加熱處理1 h樣品（記為H-Ara h 2），第4組為80 ℃條件下、5 mmol/L半胱氨酸還原處理1 h樣品（記為RH-Ara h 2）。采用水浴加熱的方法對蛋白液進行加工處理。取部分處理后的樣品進行非還原性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），其余樣品立即于－20 ℃進行保存。

1.3.2 蛋白還原程度測定

參照Ellman[22]的方法來測定上述4 組溶液中游離巰基基團的含量。將1 mL樣品溶液加入到4 mL含有0.05 mL 0.01 mol/L的5,5’-二硫雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）的磷酸鹽緩沖液中（0.1 mol/L，pH 8.0），混和，避光反應(yīng)20 min后，在412 nm波長處測定其吸光度。

1.3.3 蛋白空間結(jié)構(gòu)模擬分析

采用同源建模的方法模擬出Ara h 2空間結(jié)構(gòu)模型，用已知晶體衍射結(jié)構(gòu)的Ara h 6（PDB數(shù)據(jù)庫編號為1W2Q）作為模板建模，登入SWISS MODEL網(wǎng)站（http:// swissmodel.expasy.org/），在自動建模模式下，輸入Ara h 2的氨基酸序列，24 h內(nèi)登入下載計算得到的蛋白模型文檔。最后運用蛋白空間結(jié)構(gòu)分析軟件Pymol對得到的Ara h 2高級結(jié)構(gòu)進行分析。

1.3.4 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

為表征蛋白的二級結(jié)構(gòu)的變化，采用J-810圓二色譜儀分別對天然Ara h 2和3 個處理的蛋白樣品進行色譜檢測。掃描區(qū)間為240～190 nm，速率為500 nm/min，帶寬1 nm，光譜間隔0.1 nm，3 次累積。將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到圓二色譜分析網(wǎng)站（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/ home.stml）中進行分析，得到各蛋白二級結(jié)構(gòu)成分的含量，獲知加工前后α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的相對含量變化。

1.3.5 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析

將天然Ara h 2和3 個處理的樣品用UV WinLab V6紫外-可見分光光度儀進行紫外檢測。掃描范圍為250～350 nm，掃描速率為480 nm/min，光譜間隔1 nm。

1.3.6 抗原性分析

用間接競爭ELISA測定還原處理前后蛋白的抗原性[21]，96 孔酶標板A中包被2.5 μg/mL的第1組樣品未處理Ara h 2（100 μL/孔），4 ℃過夜。次日傾去板A中包被液，用250 μL/孔的PBST（含有0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液）洗滌3 次，每次5 min。然后，每孔加250 μL封阻液（5%脫脂乳），37 ℃孵育1 h，用PBST洗滌酶標板3 次。取另一塊酶標板B以相同的方式封阻、洗凈，然后加入60 μL的競爭蛋白（加工蛋白：第2、3、4組樣品）和等體積的1∶5 000稀釋的抗Ara h 2多克隆兔血清，實驗空白對照組是將磷酸鹽緩沖液替代競爭蛋白參與反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)1 h。然后取100 μL B板中反應(yīng)液加入到A板中，37 ℃反應(yīng)1 h。洗板3 次后，每孔中加入100 μL 1∶5 000稀釋的HRP酶標羊抗兔IgG，37 ℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，洗板3 次，最后加OPD溶液顯色15 min，用酶標儀在490 nm波長處測量其OD值?？瞻讓φ战M的OD值為B0，各質(zhì)量濃度（0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL）的加工蛋白對應(yīng)的OD值為B。然后，以（B/B0）值為縱坐標，以相對應(yīng)的競爭蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標，利用Origin軟件繪制競爭ELISA曲線，并利用該軟件計算出IC50值，IC50值越小代表抗原性越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化和還原處理的Ara h 2的SDS-PAGE鑒定

如圖1中泳道1所示，與標準蛋白Marker對比蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，利用Quantity One軟件分析，分離純化的Ara h 2的純度達到了95%以上，加熱處理的Ara h 2的條帶位置、強度均與天然蛋白相當(dāng)，說明加熱不會破壞蛋白Ara h 2的一級結(jié)構(gòu)，并且保持較為穩(wěn)定的溶解狀態(tài)。而熱加工聯(lián)合半胱氨酸共同作用處理的Ara h 2（泳道4）與經(jīng)半胱氨酸處理過的Ara h 2（泳道3）條帶位置相當(dāng)，且均處于天然蛋白的上方。推測原因為單獨利用半胱氨酸處理的蛋白溶液與上樣緩沖液混合后，由于加工蛋白添加有半胱氨酸，在100 ℃加熱5 min條件下，蛋白Ara h 2的二硫鍵很可能全部被半胱氨酸還原，效果與加熱聯(lián)合半胱氨酸處理的蛋白相當(dāng)，兩種條件下均使其結(jié)構(gòu)得到最大舒展，分子半徑較大。由斯托克斯定律可知，蛋白泳動速率與分子半徑成反比，因此，在非還原性SDS-PAGE中，蛋白受到凝膠孔徑的影響，即表現(xiàn)出泳動較慢的特性。

圖1 天然與處理后Ara h 2 SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE of native and treated Ara h 2

2.2 蛋白還原程度分析

圖2 經(jīng)處理后蛋白質(zhì)溶解體系中游離巰基含量變化Fig. 2 Content of free sulfhydryl groups in treated protein solution

溶液體系中游離巰基的含量變化可以初步評判蛋白的還原程度。如圖2所示，37 ℃條件下蛋白經(jīng)半胱氨酸常溫還原1 h后，其反應(yīng)體系中游離巰基含量相比于室溫（25 ℃）降低了15.38%，而當(dāng)半胱氨酸在較高溫度（80 ℃）條件下加熱處理蛋白后，其溶液體系中游離巰基含量顯著降低，與體系A(chǔ)相比降低了86.15%。因此，25、37 ℃條件下半胱氨酸不能有效地還原蛋白Ara h 2，而加熱處理則明顯能促進半胱氨酸的還原反應(yīng)。一部分原因是加熱處理改變了蛋白的結(jié)構(gòu)使得半胱氨酸與二硫鍵能得到更多的接觸，另一部分原因是加熱處理提供了反應(yīng)足夠的能量，使得還原反應(yīng)順利進行。因此，在加熱條件下，經(jīng)半胱氨酸處理的Ara h 2得到很好地還原，相比于半胱氨酸或熱加工單獨處理，復(fù)合處理能夠?qū)ra h 2過敏原的抗原性及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生更大的影響[23]。

2.3 蛋白空間結(jié)構(gòu)模擬分析

圖3 Ara h 2.01蛋白空間結(jié)構(gòu)Fig. 3 Spatial structure of Ara h 2.01

花生過敏原Ara h 2屬于2S白蛋白家族，含有8 個半胱氨酸殘基，形成了4 個保守的二硫鍵。圖3展示的是同源建模得到的Ara h 2.01的三維空間結(jié)構(gòu)模型，可以看出α-螺旋是蛋白二級結(jié)構(gòu)的主體成分，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量次之，這與Koppelman[24]、Wu[25]等的研究結(jié)果類似。另外每個二硫鍵的兩端都連接在兩個不同的α-螺旋結(jié)構(gòu)上，5 個α-螺旋結(jié)構(gòu)中只有其中一個沒有與二硫鍵相連接。由此可以從分子水平上初步推測二硫鍵對于Ara h 2蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)以及高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有很重要的作用。

2.4 加熱和還原處理對Ara h 2遠紫外區(qū)圓二色光譜的影響

圖4 熱加工和還原處理對Ara h 2遠紫外區(qū)圓二色譜的影響Fig. 4 Effect of heating and reducing treatment on the far-UV CD spectrum of Ara h 2

表1 Ara h 2蛋白二級結(jié)構(gòu)經(jīng)熱加工和還原處理后各構(gòu)象的相對含量Table 1 Percentages of conformational units in Ara h 2 secondary structures after heat and reducing treatment

蛋白質(zhì)的遠紫外圓二色光譜可以反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)信息，從圖4可以看出，天然蛋白Ara h 2圓二色譜圖在在190 nm附近有1 個正峰，222和208 nm有2 個負峰，說明天然Ara h 2存在α-螺旋結(jié)構(gòu)，且相對含量如表1所示為51.4%，經(jīng)過單一的加熱處理和還原處理之后，蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量較天然蛋白均有了明顯降低，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量均有了明顯增加。但當(dāng)?shù)鞍捉?jīng)過加熱和半胱氨酸還原復(fù)合處理之后，α-螺旋相對含量為16.7%，較天然蛋白降低了67.6%，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量均有了顯著增加，分別增加了180.2%和159.8%，而無規(guī)卷曲相對含量卻沒有明顯變化，這與Mattison等[26]的研究結(jié)果相似。結(jié)果表明，單一的加熱處理和半胱氨酸還原處理均只能使蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生部分變化，而加熱和半胱氨酸還原復(fù)合處理能使蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生大幅變化，蛋白的α-螺旋相對含量顯著降低，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量顯著增加。從實驗結(jié)果可以推測，蛋白Ara h 2經(jīng)過高溫還原之后，分子內(nèi)二硫鍵打開，其所連接的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榱甩?折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

2.5 加熱和還原處理對Ara h 2遠紫外光譜的影響

圖5 熱加工及還原處理對Ara h 2蛋白紫外吸收光譜的影響Fig. 5 Effect of heating and reducing treatment on the UV absorptionspectrum of Ara h 2

蛋白質(zhì)分子上色氨酸和酪氨酸殘基具有紫外有吸收的特性，吸收峰約在280 nm波長處[27]。因此，蛋白對紫外光吸收的情況可以反映蛋白構(gòu)象的變化。由圖5可知，加熱處理蛋白的最大吸收峰略高于天然蛋白，當(dāng)?shù)鞍捉?jīng)過半胱氨酸還原后，蛋白在250～285 nm波段內(nèi)紫外吸收強度要稍大于天然蛋白和熱處理蛋白，但在285～350 nm波段內(nèi)無明顯差別，而當(dāng)?shù)鞍捉?jīng)過加熱與還原聯(lián)合處理后，其紫外吸收強度在整個波段內(nèi)都要大于其他3 種蛋白，并且其最大吸收峰值有了顯著增加，說明單一的加熱處理和單一的半胱氨酸還原處理均只能使蛋白三級結(jié)構(gòu)得到部分展開，而加熱和半胱氨酸還原聯(lián)合處理能使蛋白高級結(jié)構(gòu)得到更充分展開，暴露出更多的色氨酸和酪氨酸等雜環(huán)氨基酸。

2.6 抗原性分析

為探索加熱和還原處理對蛋白Ara h 2抗原性的影響，采用間接競爭ELISA法檢測其與兔血清的反應(yīng)強度[28]。由圖6可知，天然Ara h 2的IC50值為0.91 μg/mL，熱處理Ara h 2的IC50值為1.66 μg/mL，還原處理的Ara h 2的IC50值為1.75 μg/mL，熱處理和還原復(fù)合處理后的Ara h 2，其IC50值為7.92 μg/mL，而IC50值越小代表抗原性越強。相比于天然Ara h 2，熱處理和還原處理后蛋白的抗原性均有明顯降低，但不顯著（P＞0.05），當(dāng)?shù)鞍捉?jīng)過加熱和半胱氨酸還原聯(lián)合處理后，其抗原性較其他3個蛋白均有顯著降低（P＜0.05）。過敏原的致敏性由其構(gòu)象性表位和線性表位決定[29]，加熱處理和還原處理均可在一定程度上改變蛋白的結(jié)構(gòu)，進而破壞原有的構(gòu)象性表位。半胱氨酸是一個較弱的還原劑，加熱處理則可以促進還原反應(yīng)的進行，進而使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抗原性表位得到破壞或掩蔽，導(dǎo)致其抗原性有了顯著降低[30]。

圖6 熱加工及還原處理對Ara h 2蛋白抗原性的影響Fig. 6 Effect of heating and reducing treatment on the antigenicity of Ara h 2

3 結(jié) 論

單獨的加熱處理和半胱氨酸還原處理均只能使蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生小的變化。而加熱和半胱氨酸還原復(fù)合處理則能高效地還原Ara h 2，被還原后的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生大幅變化，α-螺旋相對含量顯著降低，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量顯著增加，更多的雜環(huán)氨基酸暴露在分子表面。結(jié)構(gòu)上的改變使得過敏原的抗原性表位發(fā)生掩蔽或者破壞，導(dǎo)致Ara h 2的抗原性顯著降低，進而推測Ara h 2的致敏性可能降低。由此可見，還原協(xié)同加熱處理有望大幅改善2S球蛋白的結(jié)構(gòu)和抗原性甚至是致敏性，因此可以作為蛋白脫敏加工的備選方法。

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Synergistic Effect of Cysteine Reduction and Thermal Treatment on Structure and Antigenicity of Peanut Allergen Ara h 2

LI Kun1,2, LIAN Jun1,3, ZHU Jin4, ZENG Xin5, CHEN Hongbing1,6, WU Zhihua1,6,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. School of Environment and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 3. School of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 4. Department of Infectious Diseases, Children’s Hospital of Jiangxi Province, Nanchang 330006, China; 5. Clinical Laboratory, Jiangxi Province Maternal and Child Heath Hospital, Nanchang 330031, China; 6. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Peanut is listed among the eight major food allergens by the FAO, and peanut allergy is life-long and could cause hives, vomiting or other symptoms. In the present study, thermal treatment and cysteine reduction were applied individually and in combination on peanut allergen Ara h 2 to study their effect on the allergenic protein. The changes in the structure and antigenicity of Ara h 2 were characterized by circular dichroism (CD) spectroscopy, UV spectroscopy and indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), respectively. The results showed that thermal treatment and cysteine reduction could individually change the structure of Ara h 2, leading to a slight decrease in the antigenicity. But the combined treatment resulted in a signif i cant decrease in the antigenicity of Ara h 2 due to the enhanced reducing capacity of cysteine under thermal conditions and consequent remarkable changes in the secondary and tertiary structures of the protein. Moreover, the disulf i de bonds played important roles in the structural stability of Ara h 2. When they were destroyed by reduction and heating, the structure and antigenicity changed signif i cantly. These results indicated that reduction combined with heating may be an effective method for eliminating the allergenicity of Ara h 2.

peanut; thermal treatment; Ara h 2; disulf i de bond; structure; antigenicity

10.7506/spkx1002-6630-201711015

TS255.1

A

1002-6630（2017）11-0089-06

2016-07-26

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102205）；國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31260411；81260103；31660446）；江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)對象計劃項目（20142BCB23007）；江西省自然科學(xué)基金項目（20114BAB205012）

李坤（1993—），女，碩士研究生，研究方向為生物化工。E-mail：1964366432@qq.com

*通信作者：吳志華（1976—），男，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：wuzhihua@ncu.edu.cn