康 樂，宋煥祿*

（北京工商大學(xué) 分子感官科學(xué)實驗室，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

pH值對牛肉酶解物美拉德產(chǎn)物風(fēng)味特性的影響

康 樂，宋煥祿*

（北京工商大學(xué) 分子感官科學(xué)實驗室，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

本研究旨在探討pH值（5.0～6.5）對牛肉酶解物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（enzymic beef hydrolysate Maillard reaction product，EBH-MRP）風(fēng)味特性的影響。結(jié)果表明：隨著pH值的增加，EBH-MRP的感官特性主要從肉香、咸鮮味向烤香、苦味發(fā)展，對空白雞湯的鮮味提升作用由強(qiáng)至弱，醇厚感提升作用穩(wěn)步增強(qiáng)?？辔杜c烤香間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，過度的烤香不僅掩蓋肉香，還意味著苦味物質(zhì)的生成，抑制味蕾對鮮味、鮮味提升作用及醇厚感的感知強(qiáng)度。結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)含量的測定發(fā)現(xiàn)，肉香既不與重要前驅(qū)物半胱氨酸（Cys）的參與量具有相關(guān)性，也不與關(guān)鍵肉香味物質(zhì)的含量具有相關(guān)性。說明肉香的感知是多類氣味物質(zhì)共同調(diào)控的結(jié)果，且生成機(jī)制極為復(fù)雜。此外，含氮雜環(huán)氣味物質(zhì)的總含量與烤香間有著極顯著的正相關(guān)關(guān)系；大于3 000 D的糖肽交聯(lián)產(chǎn)物對苦味具有一定貢獻(xiàn)；適當(dāng)?shù)碾慕到庾饔糜欣诖己窀械奶嵘?/p>

牛肉酶解物；美拉德反應(yīng)；風(fēng)味；pH值；相關(guān)性

康樂, 宋煥祿. pH值對牛肉酶解物美拉德產(chǎn)物風(fēng)味特性的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(11): 25-32. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201711005. http://www.spkx.net.cn

KANG Le, SONG Huanlu. Effect of pH on flavor characteristics of Maillard reaction products from enzymatic hydrolysates of beef[J]. Food Science, 2017, 38(11): 25-32. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711005. http://www.spkx.net.cn

牛肉以其獨特的肉香味及其醇厚鮮美的湯汁深受消費者青睞[1]。美拉德反應(yīng)是形成牛肉風(fēng)味的重要途徑，包括滋味物質(zhì)在內(nèi)的水溶性小分子羰基化合物與氨基化合物通過一系列的復(fù)雜反應(yīng)最終形成肉香味物質(zhì)[2]。近年來，由于食品工業(yè)對于天然食品風(fēng)味的需求以及與氨基酸相比，肽參與的美拉德反應(yīng)其產(chǎn)物氣味更加飽滿圓潤、鮮味更加綿延溫和，使得應(yīng)用動物蛋白水解液為前驅(qū)物制備熱反應(yīng)香精的研究進(jìn)展迅速[3-5]。肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的鮮味、醇厚感以及對模型溶液的增鮮提厚作用也相繼被報道[6-8]，但對熱反應(yīng)香精的氣味、滋味、滋味提升作用以及各感官屬性之間相互作用的研究還很鮮見。

pH值是影響美拉德反應(yīng)路徑的重要因素[9-10]。美拉德反應(yīng)前驅(qū)物經(jīng)縮合、Amadori重排后形成Amadori重排產(chǎn)物，再根據(jù)體系pH值的不同，經(jīng)過不同方式的烯醇化，最終得到的滋味物質(zhì)和氣味物質(zhì)的種類及含量都不同，風(fēng)味感官鑒評也因此不同。Meynier等[11]指出：生肉在熱加工前經(jīng)僵直、后熟后，pH值一般在5.5～6.0之間；而熱加工后由于其存在著高緩沖能力的緩沖體系，使pH值變化不超過0.2～0.5。因此，探究pH值在5.0～6.5之間肉香味模型體系中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味特性的變化，對食品加工及工業(yè)上肉味香精的制備都具有重要意義。

本研究構(gòu)建了牛肉酶解物-Cys-木糖美拉德反應(yīng)模型體系，探究pH值（5.0～6.5）對牛肉酶解物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（enzymic beef hydrolysate Maillard reaction product，EBH-MRP）氣味、滋味及對空白雞湯的滋味提升作用；同時，測定EBH-MRP中揮發(fā)性氣味物質(zhì)含量、游離氨基酸含量及肽分子質(zhì)量分布，進(jìn)一步說明EBH-MRP感官屬性下的化學(xué)本質(zhì)。此外，運用統(tǒng)計學(xué)方法——相關(guān)分析來深入探究EBH-MRP氣味、滋味和滋味提升作用之間的相關(guān)性，以及風(fēng)味物質(zhì)與感官屬性之間的相關(guān)性，以期為熱反應(yīng)香精的工藝摸索及呈味機(jī)制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛里脊肉（蛋白含量22.2%）購于北京市華光超市。

復(fù)合風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme?500MG（酶活力5×104U）、復(fù)合蛋白酶Protamex?（酶活力1.5×105U）丹麥諾維信公司；木糖、L-Cys等其他分析純試劑北京頤豐天成科技有限公司；色譜純試劑正構(gòu)系列烷烴（C7～C30）、2-甲基-3-庚酮 美國Sigma公司；色譜純有機(jī)試劑 美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

4848型高壓反應(yīng)釜 美國Parr公司；1200分析型高效液相色譜儀、7890A-7000B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Agilent公司；Sniffer9000嗅聞儀 瑞士Brechbuhler公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉酶解物的制備

根據(jù)前期優(yōu)化條件及文獻(xiàn)參考[12]對牛里脊肉進(jìn)行酶解。取新鮮牛里脊肉剔除肥肉后洗凈絞碎，85 ℃條件下加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，冷卻后按1∶2（m/V）加入去離子水，用5 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5，置于水浴鍋中，在50 ℃條件下同時添加復(fù)合蛋白酶Protamex?（1 000 U/g底物）和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme?500MG（800 U/g底物），酶解過程中每小時測定調(diào)整pH值，酶解3 h后，90 ℃加熱20 min滅酶。將酶解物在4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min，上清液經(jīng)石油醚洗滌3 次，取水相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥后即為牛肉酶解物。此時牛肉酶解物的水解度約為15.28%。樣品置于－18 ℃冰箱中貯藏備用。

1.3.2 EBH-MRP的制備

將牛肉酶解物0.45 g、木糖0.11 g、L-Cys 0.09 g溶于20 mL磷酸鹽緩沖液中（pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5），混勻后放入高壓反應(yīng)釜中，在125 ℃條件下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后立即用冰浴冷卻，以防止進(jìn)一步發(fā)生熱反應(yīng)。EBH-MRP經(jīng)4 ℃、24 h冷藏后進(jìn)行下一步分析。

1.3.3 EBH-MRP揮發(fā)性化合物的提取

采用手動固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技術(shù)對EBH-MRP中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行提取。在40 mL頂空瓶中分別加入3 mL樣品、0.5 g食鹽和1 μL質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL的內(nèi)標(biāo)物2-甲基-3-庚酮溶液。將樣品置于60 ℃水浴中平衡20 min，插入SPME纖維頭（DVB/CAR on PDMS），頂空吸附40 min。吸附完畢后，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口中，于250 ℃條件下解析5 min進(jìn)樣。每個樣品在相同提取與檢測條件下重復(fù)做3 次平行實驗。

1.3.4 EBH-MRP揮發(fā)性化合物的分離

采用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對萃取出的揮發(fā)性成分進(jìn)行分離分析。經(jīng)氣相色譜分離后，分離餾分分別進(jìn)入質(zhì)譜檢測器和嗅聞檢測器，3 位研究人員在嗅聞口記錄所聞到的香味特征和強(qiáng)度。為防止鼻黏膜的干燥，在嗅聞口通入30 mL/min濕潤的空氣。餾分分離采用DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。升溫程序為：初始溫度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫到200 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min升溫到250 ℃，保持3 min，共41 min。氣相色譜使用的載氣為氦氣；流速為1.2 mL/min；分流比1∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊（electron impact，EI）離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～350。

1.3.5 揮發(fā)性化合物的鑒定

采用Agilent MassHunter數(shù)據(jù)分析軟件B.07.00的氣味化合物保留指數(shù)（retention index，RI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，通過NIST 14譜庫進(jìn)行質(zhì)譜檢索以及與嗅聞數(shù)據(jù)對比3 種方法結(jié)合對未知揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定。RI計算公式如式（1）所示。

式中：N為待測香氣化合物a左側(cè)低碳數(shù)烷烴的碳數(shù)/個；n為a兩側(cè)兩個烷烴間相差的碳數(shù)/個；tR為相應(yīng)化合物的保留時間/min。

由于本實驗只需對比定量，因此采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析。每種化合物的質(zhì)量濃度計算見式（2）。

式中：ρi為化合物質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρis為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Sj為化合物的色譜峰面積；Sis為內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積。

1.3.6 氨基酸含量的測定

采用安捷倫專用柱前衍生法對樣品中的16 種游離氨基酸（Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Cys、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys）進(jìn)行定量分析。色譜柱型號為Zorbax Eclipse-AAA（150 mm×4.6 mm，5 μm），高效液相色譜法按照錢敏等[13]的方法進(jìn)行。

1.3.7 肽分子質(zhì)量分布的測定

采用凝膠色譜法對樣品的肽分子質(zhì)量分布進(jìn)行測定。色譜柱型號為TSK GLSW 2000（300 mm×7.8 mm， 5 μm），流動相為用甲酸調(diào)整pH值至3.0的20%乙腈水溶液，流速為0.5 mL/min，柱溫為25 ℃。測定220 nm波長處樣品的吸光度。為了確定肽分布，同樣條件下用抑肽酶（6 512 D）、VB12（1 355 D）、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸（451 D）、谷胱甘肽（307 D）繪制分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.8 感官鑒評方法

來自北京工商大學(xué)分子感官科學(xué)實驗室的9 名有經(jīng)驗的成員（5女4男）組成感官鑒評小組，對本實驗的樣品進(jìn)行描述性感官鑒評并進(jìn)行相應(yīng)打分。本實驗分別從氣味、滋味、滋味提升作用3 個方面對EBH-MRP進(jìn)行綜合感官評價。經(jīng)小組商議后，確定肉香、烤香、焦糖香及不良?xì)馕稙镋BH-MRP的4 個氣味香韻，鮮味、醇厚感、苦味為其滋味的三大屬性，對空白雞湯的增鮮和提厚作用為該樣品的兩大滋味提升作用。

1.3.8.1 感官訓(xùn)練方法

為熟悉感官鑒評指標(biāo)，小組成員進(jìn)行了為期3 個月的感官鑒評訓(xùn)練，每天訓(xùn)練的時間大于3 h。所有的訓(xùn)練分3 個部分并于室溫（25～28 ℃）條件下進(jìn)行。相關(guān)訓(xùn)練溶液的具體配制方法見表1。

表1 感官訓(xùn)練相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法Table 1 Preparation of standard solutions for sensory panel training

對空白雞湯的鮮味提升作用：文火熬煮含有10 mmol/L NaCl的雞胸肉2 h作為空白雞湯模型溶液，添加3 mmol/L的谷氨酸鈉，并60 ℃水浴共熱10 min，冷卻后對比空白雞湯溶液來訓(xùn)練鮮味提升作用；對空白雞湯的醇厚感提升作用：文火熬煮含有10 mmol/L NaCl的雞胸肉2 h作為空白雞湯模型溶液，添加5 mmol/L的谷胱甘肽，60 ℃水浴共熱10 min，冷卻后對比空白雞湯溶液來訓(xùn)練醇厚感提升作用。

1.3.8.2 感官評價標(biāo)準(zhǔn)

為綜合考量并對本實驗樣品進(jìn)行總體打分，經(jīng)小組商議后，確定樣品的氣味、滋味及滋味提升作用占總體可接受性的權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.3和0.3。其中，氣味屬性中的肉香權(quán)重為0.3，烤香為0.1，焦糖香為0.1，不良?xì)馕稙椋?.1；滋味屬性中的鮮味權(quán)重為0.2，醇厚感為0.2，苦味為－0.1；對空白雞湯的滋味提升作用中鮮味提升作用權(quán)重為0.15、醇厚感提升作用為0.15。各感官指標(biāo)的評分采用7 分制，0～7 分代表從未感知到風(fēng)味強(qiáng)度極強(qiáng)。

具體感官評價方法為：1）對于樣品氣味和滋味的感官評價：將EBH-MRP以1∶5（V/V）的比例稀釋于去離子水中，取2 mL樣品于口中并使其充滿口腔，咀嚼10 次感受鮮味、醇厚感及苦味，深吸氣使空氣帶著樣品的氣味達(dá)到鼻后腔，刺激鼻黏膜來對樣品的氣味輪廓（肉香、烤香、焦糖香、不良?xì)馕叮┻M(jìn)行評價。2）對于樣品滋味提升作用的評價：將EBH-MRP以體積分?jǐn)?shù)1%的比例添加到空白雞湯模型溶液中，60 ℃恒溫水浴加熱10 min，冷卻后，先后取2 mL空白雞湯溶液和加入樣品的空白雞湯溶液于口中，咀嚼10 次后對樣品的增鮮提厚作用進(jìn)行感官評價。

鑒評小組成員在室溫（25～28 ℃）條件下進(jìn)行感官評價，樣品裝于茶色瓶中以隨機(jī)方式呈遞給小組成員，每鑒評完一個樣品用清水漱口，小組成員間不能交流。所有樣品的感官評價在1 d之內(nèi)完成，共鑒評3 d以確定數(shù)據(jù)的可信度并取平均值。每個鑒評人員的3 次評分差異不得超過2 個標(biāo)度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

曲線圖的繪制采用Microsoft Excel 2007軟件。顯著性分析（P＜0.05）及相關(guān)性分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對EBH-MRP風(fēng)味感官特性的影響及相關(guān)性分析

表2 不同pH值條件下EBH-MRP氣味、滋味及滋味提升作用的描述性感官鑒評Table 2 Descriptive sensory evaluation of smell, taste and taste enhancement of EBH-MRP at different pH values

表3 不同pH值條件下EBH-MRP各感官屬性評分結(jié)果Table 3 Evaluation of each sensory attribute of EBH-MRP at different pH values

不同pH值下EBH-MRP描述性感官鑒評及各感官屬性評分結(jié)果如表2、3所示。表2中EBH-MRP的感官描述顯示：在pH 5.0～6.5之間，隨著pH值的增加，EBH-MRP的氣味特征主要從肉香向烤香發(fā)展，而滋味特性主要從咸鮮味向中度苦味發(fā)展，對空白雞湯的鮮味提升作用由強(qiáng)至弱，醇厚感提升作用穩(wěn)步增強(qiáng)。

具體分析（表3）發(fā)現(xiàn)：pH 6.0-EBH-MRP的肉香、烤香及焦糖香評分均較高，pH 5.5-EBH-MRP的肉香評分最高，烤香、焦糖香評分相對偏低，而pH 5.0-EBH-MRP的肉香評分較高，烤香、焦糖香評分卻較低。多種香韻相互作用使得感官評價顯示pH 6.0-EBH-MRP的甜烤香掩蓋了肉香最終呈現(xiàn)甜烤香韻，pH 5.0-EBH-MRP由于甜烤香的烘托作用極低而呈現(xiàn)單一瘦肉香，而pH 5.5-EBH-MRP甜烤香適度最終呈現(xiàn)飽滿協(xié)調(diào)的肉香。此結(jié)果說明：肉香強(qiáng)度高，其他香韻強(qiáng)度適中，肉味香精的香味才更協(xié)調(diào)飽滿而被大眾所接受。滋味方面，pH值在5.0和5.5時EBH-MRP的鮮味、鮮味提升作用、醇厚感強(qiáng)烈，而在6.0及6.5時鮮味、鮮味提升作用卻較低，醇厚感也有所下降，這時發(fā)現(xiàn)苦味增加明顯，因此推測出兩種可能：苦味的產(chǎn)生抑制了鮮味對舌苔的刺激；鮮味物質(zhì)生成量變少而苦味物質(zhì)生成量變多。此外，在pH 5.0～6.5間，隨著pH值的增加，EBH-MRP對空白雞湯的醇厚感提升作用穩(wěn)步上升，并不與EBH-MRP本身的醇厚感有相同的趨勢，因此推測，EBH-MRP本身呈現(xiàn)醇厚味的機(jī)制與其對空白雞湯醇厚感提升作用的機(jī)制并不相同。

綜合pH值對EBH-MRP風(fēng)味感官總體特性影響發(fā)現(xiàn)：當(dāng)烤香強(qiáng)度偏高時，苦味強(qiáng)度隨之升高，同時鮮味、醇厚感、鮮味提升作用下降。為進(jìn)一步探索此規(guī)律，相關(guān)性分析被用于此研究中。結(jié)果顯示：在pH 5.0～6.5間，烤香與苦味之間存在著顯著正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)：0.94；P＜0.05），鮮味與苦味之間存在著極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)：－0.99；P＜0.01），醇厚感與苦味之間存在著極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)：－0.99；P＜0.01），鮮味與鮮味提升作用之間存在著極顯著的正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)：1.00；P＜0.01）。因此推出，當(dāng)EBH-MRP肉香明顯，烤香、焦糖香適度時，其滋味鮮美醇厚，并具有增鮮提厚作用，且不具有苦味?？鞠愕倪^度，就是美拉德反應(yīng)苦味物質(zhì)生成的標(biāo)志。

2.2 pH值對EBH-MRP中相關(guān)氨基酸含量的影響及相關(guān)性分析

圖1 EBH-MRP中相關(guān)氨基酸含量隨pH值的變化趨勢Fig. 1 Changes in the cotents of free amino acids at different pH values

不同pH值下EBH-MRP總游離氨基酸、Cys、Met、鮮味氨基酸（Glu和Asp）、苦味氨基酸（Leu、Tyr、Ile、Arg、His、Val、Phe和Lys）含量的測定結(jié)果如圖1所示。在pH值5.0～6.5范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，總游離氨基酸（圖1A）含量增加，這是因為pH值的升高可提高美拉德反應(yīng)的速率[9]。與總游離氨基酸含量變化趨勢相同的是鮮味氨基酸（圖1D），其在pH 6.0和6.5處含量顯著增加，雖然EBH-MRP中呈鮮的物質(zhì)不僅有鮮味氨基酸，還包括5’-核苷酸、琥珀酸、小肽等成分[14]，鮮味氨基酸的含量并不能代表EBH-MRP的鮮味強(qiáng)度，但能反映出鮮味物質(zhì)的變化規(guī)律。因此，結(jié)合2.1節(jié)中滋味特性感官評價結(jié)果，進(jìn)一步推出苦味物質(zhì)的大量生成抑制了味蕾對鮮味物質(zhì)的感知強(qiáng)度。而隨著pH值的增加，對肉香味物質(zhì)的生成具有重要貢獻(xiàn)的Cys（圖1B）及Met（圖1C）的含量總體呈遞減趨勢，說明其參與美拉德反應(yīng)的程度隨之升高，但肉香味卻不隨之增加。說明復(fù)雜物質(zhì)協(xié)同作用而體現(xiàn)出的肉香味并不依賴于單一物質(zhì)的參與量，因此，在本研究范圍內(nèi)，EBH-MRP中含硫氨基酸的含量與肉香味之間并不具備相關(guān)性。此外，苦味氨基酸的含量隨著pH值的增加也成遞增趨勢。Maehashi等[15]報道：許多疏水性氨基酸如亮氨酸等可對食品產(chǎn)生強(qiáng)烈的苦味。本實驗中，苦味明顯出現(xiàn)是從pH 6.0開始，而苦味氨基酸含量的顯著增加是在pH 6.5，且各pH值條件下EBH-MRP中苦味氨基酸含量約占總氨基酸含量的67%，但pH 5.0-EBH-MRP和pH 5.5-EBH-MRP卻不呈現(xiàn)苦味，這說明在本研究范圍內(nèi)EBH-MRP中苦味氨基酸含量與苦味并沒有直接關(guān)系。這與Liu Jianbin等[4]的研究結(jié)果相吻合。

2.3 pH值對EBH-MRP肽分子質(zhì)量分布的影響及相關(guān)性分析

圖2 EBH-MRP中肽分子質(zhì)量分布隨pH值的變化曲線Fig. 2 Changes in peptide distribution of EBH-MRP at different pH values

由圖2可知，在pH值由5.0升高到5.5時，EBH-MRP中大于5 000 D、3 000～5 000 D、尤其是1 000～3 000 D的大分子肽段含量降低，而小于1 000 D的各部分肽段含量均上升，說明pH值的增加使得肽降解速率加快，大分子肽段更多地降解為小分子肽段。Ishii等[16]報道牛肉中溫和的味道可能來自于肽。由2.1節(jié)中感官評價結(jié)果可知，pH值由5.0升高到5.5時，EBH-MRP的醇厚感增強(qiáng)，而這兩組體系并沒有出現(xiàn)苦味，醇厚感也因此并沒有被掩蔽，說明醇厚感與肽分子質(zhì)量分布具有一定相關(guān)性，即適當(dāng)增大肽降解程度，有利于醇厚感的提升。而當(dāng)體系pH值在6.0、6.5時，EBH-MRP出現(xiàn)了苦味，同時醇厚感有所下降，說明苦味對醇厚感有一定掩蓋作用，該兩組pH的EBH-MRP中大于5 000 D、3 000～5 000 D的肽段含量呈現(xiàn)增加趨勢，說明大于3 000 D的糖肽交聯(lián)產(chǎn)物可能對EBH-MRP的苦味具有一定貢獻(xiàn)，這與Liu Jianbin等[4]的研究結(jié)果相一致。從1 000～3 000 D肽段含量變化曲線來看，隨著pH值的增加肽段含量先降低再增加，這可能由于1 000～3 000 D處于中間肽段，既發(fā)生肽降解作用又發(fā)生肽交聯(lián)作用，使得該肽段含量的高低取決于這兩種作用的相對強(qiáng)弱。500～1 000、200～500 D和小于200 D的肽段在pH 6.0～6.5時出現(xiàn)下降趨勢，這是由于小于1 000 D的肽是美拉德反應(yīng)活性肽，可以不經(jīng)降解作用直接參與到美拉德反應(yīng)中[17]，在該pH值范圍內(nèi)，小分子肽降解成游離氨基酸及參與美拉德反應(yīng)的程度之和強(qiáng)于大分子肽的降解作用。此外，pH 6.0～6.5 EBH-MRP中烤香味的急劇增加可能與二肽直接參與美拉德反應(yīng)生成吡嗪類物質(zhì)有關(guān)[18]。

2.4 pH值對EBH-MRP氣味活性化合物的影響及相關(guān)性分析

表4 不同pH值條件下EBH-MRP氣味活性化合物的含量Table 4 Contents of odor active compounds in EBH-MRP at different pH values

續(xù)表1

各pH值條件下EBH-MRP氣味活性化合物的含量如表4所示。肉香最為飽滿的pH 5.5-EBH-MRP中共鑒定出59 種氣味活性化合物，其中包括7 種醛酮類，其含量為總含量的1.96%；6 種不含硫呋喃類，占4.78%；9 種含硫呋喃類，占52.59%；5 種吡嗪類，占0.48%；23 種噻吩類，占19.45%；2 種噻唑類，占7.48%；3 種非雜環(huán)硫醇類，占12.83%；2 種吡咯類，占0.16%。肉味是由多種化合物共同作用的結(jié)果，這些含硫、氧、氮的雜環(huán)化合物以及羰基化合物都曾被報道對肉味具有貢獻(xiàn)[19]。形成肉味最重要的前體物是Cys，其經(jīng)過Strecker降解反應(yīng)后生成硫化氫、氨及乙醛，這是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中雜環(huán)化合物雜原子的重要來源[20]。本實驗通過外加L-Cys的方式構(gòu)建美拉德反應(yīng)體系，從感官評價結(jié)果和氣味活性化合物的分析上來看非常成功。

本實驗鑒定出的主要含硫化合物含硫呋喃類和噻吩類總含量占?xì)馕痘衔锟偤窟_(dá)72.04%。Macleod[21]研究的肉味化合物中大多數(shù)都含硫，其中1、2或5位上有甲基或含硫取代基的呋喃和噻吩是重要的呈味物質(zhì)，此外，2 個呋喃環(huán)和多個硫原子可使肉香增加。pH 5.5-EBH-MRP中，符合此規(guī)律的含硫化合物的種類占含硫呋喃類和噻吩類總數(shù)的66%，含量占57%，說明本實驗鑒定出的肉香物質(zhì)不僅有效，且多為關(guān)鍵肉香化合物。孫寶國等[22]提出肉香味含硫化合物的特征分子結(jié)構(gòu)為：分子中含有相鄰的兩個碳原子分別與一個硫原子和一個氧原子（或另一個硫原子）相連的結(jié)構(gòu)單元。將孫寶國等[22]提出的結(jié)構(gòu)與Macleod[21]發(fā)現(xiàn)的規(guī)律對比并結(jié)合本實驗所鑒定出的肉香物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸納發(fā)現(xiàn)：2-甲基-3-呋喃硫醇的衍生物，2位取代基是甲硫基或羰基，或3位直接與硫原子或氧原子相連的噻吩類化合物是關(guān)鍵肉香味化合物。

圖3 EBH-MRP中關(guān)鍵氣味活性化合物含量隨pH值的變化趨勢Fig. 3 Changes in the contents of meaty flavor in EBH-MRP at different pH values

如圖3A所示，pH值從5.0升高到5.5，關(guān)鍵含硫肉香味化合物含量增加了130%；而從pH 5.5升高到6.0，其含量并沒有持續(xù)上升，反而顯著下降；pH值繼續(xù)升高至6.5，其含量沒有顯著性變化。分析肉香味與關(guān)鍵肉香化合物的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，兩者之間并沒有顯著相關(guān)性。而這與文獻(xiàn)[11,24]得出的結(jié)論“在pH值4.5～6.5之間，肉味化合物隨著pH值的增加而減少”并不吻合，可能由于其體系是Cys-葡萄糖單一模型體系，而本實驗美拉德反應(yīng)體系中含有牛肉酶解液這樣復(fù)雜的混合物參與，多種類型揮發(fā)性物質(zhì)競爭形成而導(dǎo)致規(guī)律并不相同。

吡嗪、噻唑、吡咯類是呈甜烤香氣的重要風(fēng)味物質(zhì)。美拉德反應(yīng)中，含氮雜環(huán)化合物的生成機(jī)理是羰氨縮合，而氨基在較低pH值環(huán)境中質(zhì)子化，不能進(jìn)行親核進(jìn)攻[21]，因此，含氮雜環(huán)化合物的形成具有很強(qiáng)的pH值依賴性。本實驗中，2,6-二甲基吡嗪、2-異丁基吡嗪、4,5-二甲基噻唑、2,4,5-三甲基噻唑、5-乙基-2,4-二甲基噻唑及2-乙酰基噻唑只在pH值達(dá)到6.5時才生成，如圖3B所示，含氮雜環(huán)化合物總含量隨pH值的增加而增加，這與Meynier等[11]的研究結(jié)果一致。分析含氮化合物總含量與烤香的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，兩者之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)0.99，P＜0.01），說明烤香的感知強(qiáng)度在一定程度上可以說明含氮雜環(huán)化合物的生成量。

不含硫的呋喃和醛酮類被認(rèn)為是糖的降解產(chǎn)物，還原糖在偏酸性環(huán)境下經(jīng)Amadori重排并脫氨后，斷裂成醛酮類或自身環(huán)化成糠醛類化合物[25]。這些化合物不僅本身具有一定的水果香、奶油香或焦糖香，對肉味起到風(fēng)味修飾作用[26-27]，還會生成如2-甲基-3-呋喃硫醇等肉香味物質(zhì)的重要中間產(chǎn)物[28-30]。2,3-二甲基-2-環(huán)戊烯酮雖在煮牛肉風(fēng)味中鮮見報道，但卻是美拉德反應(yīng)重要的標(biāo)志性產(chǎn)物，是呋喃酮和麥芽酚的五碳類似物，具有典型的焦糖氣息。不含硫呋喃類化合物含量最多的是糠醛，是EBH-MRP中焦糖風(fēng)味最重要的來源。圖3C為醛酮類與不含硫呋喃類化合物含量隨著pH值變化的趨勢圖，與EBH-MRP中焦糖香進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間相關(guān)系數(shù)為0.74，雖不成顯著正相關(guān)性，但說明不含硫的呋喃類和醛酮類對EBH-MRP中的焦糖香韻具有一定貢獻(xiàn)。

3 結(jié) 論

本研究通過構(gòu)建牛肉酶解物-Cys-木糖美拉德反應(yīng)模型體系來研究pH值（5.0～6.5）對其風(fēng)味感官特性及風(fēng)味物質(zhì)的影響。結(jié)果表明：隨著pH值的增加，美拉德反應(yīng)速率加快。EBH-MRP的感官特性主要從肉香、咸鮮味到烤香、苦味方向發(fā)展，對空白雞湯的鮮味提升作用由強(qiáng)至弱，醇厚感提升作用穩(wěn)步增強(qiáng)?？辔杜c烤香間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系，過度的烤香不僅掩蓋肉香，還意味著苦味物質(zhì)的生成，抑制味蕾對鮮味、醇厚感的感知強(qiáng)度，同時抑制了EBH-MRP對空白雞湯模型溶液的鮮味提升作用。結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)含量的測定發(fā)現(xiàn)：Cys雖為肉香味化合物形成的重要前驅(qū)物，其參與美拉德反應(yīng)的程度與肉香間并不具備相關(guān)性，且關(guān)鍵肉香味化合物的含量與肉香之間也不具備相關(guān)性，說明肉香的感知是多類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同作用的結(jié)果，且生成機(jī)制極為復(fù)雜。此外，揮發(fā)性含氮雜環(huán)化合物總含量與烤香間有著極顯著的正相關(guān)關(guān)系；小于1 000 D的小分子肽具有美拉德反應(yīng)活性，大于3 000 D的糖肽交聯(lián)產(chǎn)物對苦味具有一定貢獻(xiàn)，適當(dāng)?shù)碾慕到庾饔糜欣诖己窀械奶嵘?。EBH-MRP感官特性的體現(xiàn)是揮發(fā)性與不揮發(fā)性化合物之間的相互作用的結(jié)果。

[1] 蘇揚. 牛肉的風(fēng)味化學(xué)及風(fēng)味物質(zhì)的探討[J]. 四川理工學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2000, 13(2): 68-72. DOI:10.3969/ j.issn.1673-1549.2000.02.017.

[2] 邵瀾媛, 周建偉, 劉東紅. 食品中美拉德反應(yīng)機(jī)理及動力學(xué)模型的研究進(jìn)展[J]. 中國食品學(xué)報, 2012, 12(12): 103-112. DOI:10.16429/ j.1009-7848.2012.12.021.

[3] 宋詩清, 張曉鳴, 劉芳, 等. 牛肉酶解物對牛肉特征香味形成的影響研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(19): 76-81. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2012.19.033.

[4] LIU Jianbin, LIU Mengya, HE Congcong, et al. Effect of thermal treatment on the flavor generation from Maillard reaction of xylose and chicken peptide[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 64(1): 316-325. DOI:10.1016/j.lwt.2015.05.061.

[5] 劉建彬, 康樂, 劉夢婭, 等. 雞肉肽在美拉德反應(yīng)中對生成肉味化合物的貢獻(xiàn)研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(4): 301-310. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.4.049.

[6] OGASAWARA M, KATSUMATA T, EGI M. Taste properties of Maillard-reaction products prepared from 1 000 to 5 000 Da peptide[J]. Food Chemistry, 2006, 99(3): 600-604. DOI:10.1016/ j.foodchem.2005.08.040.

[7] 劉平, 車振明, 張曉鳴. 大豆肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在雞湯中的應(yīng)用[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(4): 110-113. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2014.04.051.

[8] ERIC K, RAYMOND L V, HUANG M G, et al. Sensory attributes and antioxidant capacity of Maillard reaction products derived from xylose, cysteine and sunflower protein hydrolysate model system[J]. Food Research International, 2013, 54(2): 1437-1447. DOI:10.1016/ j.foodres.2014.01.030.

[9] 孫麗平, 汪東風(fēng), 徐瑩, 等. pH和加熱時間對美拉德反應(yīng)揮發(fā)性產(chǎn)物的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 35(4): 122-125. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2009.04.035.

[10] AMES J M, GUY R C, KIPPING G J. Effect of pH and temperature on the formation of volatile compounds in cysteine/reducing sugar/starch mixtures during extrusion cooking[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(4): 1885-1894. DOI:10.1021/jf0012547.

[11] MEYNIER A, MOTTRAM D S. The effect of pH on the formation of volatile compounds in meat-related model systems[J]. Food Chemistry, 1995, 52(4): 361-366. DOI:10.1016/0308-8146(95)93282-V.

[12] 劉建彬. 雞肉肽參與美拉德反應(yīng)的機(jī)理及其反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味特性研究[D]. 北京: 北京工商大學(xué), 2015: 10-18.

[13] 錢敏, 白衛(wèi)東, 趙文紅, 等. 酵母抽提物中游離氨基酸的測定與分析[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(7): 878-881. DOI:10.13982/ j.mfst.1673-9078.2012.07.041.

[14] KUMIKO N. Umami: a universal taste[J]. Food Reviews International, 2007, 18(1): 23-38. DOI:10.1081/FRI-120003415.

[15] MAEHASHI K, HUANG L. Bitter peptides and bitter taste receptors[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2009, 66(10): 1661-1671. DOI:10.1007/s00018-009-8755-9.

[16] ISHII K, TSUCHIDA M, NISHIMURA T, et al. Changes in the taste and taste components of beef during heating at a low temperature for a long time[J]. Journal of Home Economics of Japan, 1995, 46(3): 229-234.

[17] WANG R, YANG C, SONG H L. Key meat flavour compounds formation mechanism in a glutathione-xylose Maillard reaction[J]. Food Chemistry, 2012, 131(1): 280-285. DOI:10.1016/ j.foodchem.2011.08.079.

[18] van LANCKER F, ADAMS A, de KIMPE N. Formation of pyrazines in Maillard model systems of lysine-containing dipeptides[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(4): 2470-2478. DOI:10.1021/jf903898t.

[19] KERTH C R, MILLER R K. Beef flavor: a review from chemistry to consumer[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2015, 95(14): 2783-2798. DOI:10.1002/jsfa.7204.

[20] 向智男, 寧正祥. 肉品風(fēng)味的形成與美拉德反應(yīng)[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2004, 20(2): 143-146. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2004.02.056.

[21] MACLEOD G. Flavor of meat and meat products[M]. Newfoundland: Springer US, 1994: 4-37. DOI:10.1007/978-1-4615-2177-8_2.

[22] 孫寶國, 田紅玉, 鄭福平, 等. 肉香味含硫化合物的核心分子結(jié)構(gòu)及應(yīng)用[J]. 精細(xì)化工, 2005, 22(1): 29-31. DOI:10.13550/ j.jxhg.2005.01.009.

[23] DRANSFIELD E, NUTE G R, MOTTRAM D S, et al. Pork quality from pigs fed on low glucosinate rapeseed meal: influence of level in the diet, sex and ultimate pH[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36(7): 546-556. DOI:10.1002/jsfa.2740360705.

[24] YEO H C H, SHIBAMOTO T. Microwave-induced volatiles of the Maillard model system under different pH conditions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1991, 39(2): 370-373. DOI:10.1021/ jf00002a029.

[25] BOEKEL M A J S V. Formation of flavour compounds in the Maillard reaction[J]. Biotechnology Advances, 2006, 24(2): 230-233. DOI:10.1016/j.biotechadv.2005.11.004.

[26] CROSS C K, ZIEGLER P. A comparison of the volatile fractions from cured and uncured meat[J]. Journal of Food Science, 2006, 30(4): 610-614. DOI:10.1111/j.1365-2621.1965.tb01811.x.

[27] 孫圳, 韓東, 張春暉, 等. 定量鹵制雞肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)剖面分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(15): 3030-3045. DOI:10.3864/ j.issn.0578-1752.2016.15.017.

[28] YAGHMUR A, ASERIN A, GARTI N. Furfural-cysteine model reaction in food grade nonionic oil/water microemulsions for selective flavor formation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(10): 2878-2883. DOI:10.1021/jf011158l.

[29] XU Q Q, LIU J B, SONG H L, et al. Formation mechanism of volatile and non-volatile compounds in peptide-xylose Maillard reaction[J]. Food Research International, 2013, 54(1): 683-690. DOI:10.1016/ j.foodres.2013.07.066.

[30] 羅玉龍, 靳志敏, 劉夏煒, 等. 肉制品中香味物質(zhì)形成原因研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(2): 254-258. DOI:10.13995/ j.cnki.11-1802/ts.201502045.

Effect of pH on Flavor Characteristics of Maillard Reaction Products from Enzymatic Hydrolysates of Beef

KANG Le, SONG Huanlu*
(Food Nutrition and Human Health-Tech Innovation Center of Beijing, Laboratory of Molecular Sensory Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

In this study, the effect of pH (5.0–6.5) on flavor characteristics of Maillard reaction products from enzmatic hydrolysates of beef (EBH-MRP) was studied. Results showed that as the pH increased, the sensory properties of EBHMRP were mainly changed from meaty, salty to roast, and bitter flavor. The umami taste intensity of model blank chicken soup was enhanced more weakly, but the kokumi taste intensity was improved steadily. A significant positive correlation was observed between roast aroma and bitterness taste intensity. Excessive roast aroma implied the formation of bitter compounds, which not only could mask the meaty aroma of EBH-MRP but also inhibit its umami, kokumi taste and umamienhancing intensity. Quantitative analysis of flavor compounds demonstrated that meaty aroma intensity was neither correlated with the amount of the important precursor cysteine (Cys), nor with the contents of the key aroma substances. These findings demonstrated that meaty aroma was regulated by the interaction of various odorant compounds, which were generated by an extremely complex mechanism. In addition, a significantly positive correlation existed between the total content of nitrogen-containing heterocyclic odorants and roast aroma intensity. The high molecular weight EBH-MRP (＞ 3 000 D) was the major contributor to the bitterness taste. The increase of kokumi taste was associated with appropriate degradation of peptides.

enzymatic hydrolysate of beef; Maillard reaction; flavor; pH value; correlation

10.7506/spkx1002-6630-201711005

TS202.3

A

1002-6630（2017）11-0025-08引文格式：

2016-07-22

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171645）

康樂（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品風(fēng)味化學(xué)。E-mail：1031424810@qq.com

*通信作者：宋煥祿（1961—），男，教授，博士，研究方向為食品風(fēng)味化學(xué)。E-mail：songhl@th.btbu.edu.cn