邢艷玲，吳靜

蛋白激酶C ζ抑制劑對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A-431增殖和侵襲的影響

邢艷玲1，吳靜2?

目的探討蛋白激酶C（PKC）ζ抑制劑T5450996對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A-431增殖和侵襲能力的影響。方法應(yīng)用Z′-LYTE?試劑盒篩選PKCζ抑制劑T5450996；利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期分析觀察T5450996對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A-431增殖的影響；運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)分析T5450996對(duì)A-431遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果T5450996 可以抑制 PKCζ激酶的活性，半數(shù)抑制濃度（IC50）約為 35 μmol/L；與對(duì)照組相比，35 μmol/L 和 70 μmol/L的T5450996可以顯著抑制A-431細(xì)胞的增殖，阻滯A-431細(xì)胞周期；劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示35 μmol/L和70 μmol/L的T5450996處理A-431細(xì)胞后，A-431細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯下降（均P＜0.05），20 μmol/L的T5450996沒有明顯作用（均P＞0.05）。結(jié)論P(yáng)KCζ抑制劑T5450996可顯著抑制皮膚鱗癌細(xì)胞A-431的增殖和侵襲能力，是一個(gè)有潛在應(yīng)用前景的小分子抑制劑。

蛋白激酶C；蛋白激酶抑制劑；皮膚腫瘤；細(xì)胞增殖；腫瘤侵潤(rùn)；腫瘤轉(zhuǎn)移；A-431

皮膚癌主要包括鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌，近年來發(fā)病率逐漸升高［1］。作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要組成部分，蛋白激酶C（PKC）在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用［2-3］。PKCζ為非典型 PKC 中的一個(gè)亞型，其與乳腺癌［4-5］、結(jié)腸癌［6］和胰腺癌［7］等多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，PKCζ可成為抗腫瘤藥物治療的靶點(diǎn)，而PKCζ抑制劑可阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PKCζ假底物抑制劑可抑制多種PKC亞型的活性和轉(zhuǎn)位［8］。本文研究PKCζ抑制劑T5450996對(duì)人皮膚鱗癌細(xì)胞株A-431增殖和侵襲能力的影響，探討PKCζ抑制劑作為抗腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移藥物的可行性和相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人皮膚鱗癌細(xì)胞株A-431購于中科院上海生物細(xì)胞所；PKCζ抑制劑T5450996（分子式C15H19N3O）購自烏克蘭Enamine公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國(guó)Hyclone公司；Z′-LYTETM試劑盒購自美國(guó)Invitrogen公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自日本東仁化學(xué)科技公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國(guó)BD公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國(guó) Sigma公司；Transwell小室購自美國(guó)Millipore公司；6孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 PKCζ抑制劑篩選 根據(jù)Z′-LYTETM試劑盒使用說明書進(jìn)行PKCζ抑制劑的篩選。首先，在384孔板中加入10 μL 體系溶液，包括 10 μmol/L 的三磷酸腺苷（ATP）、2 μmol/L的肽段底物、125 μg/L的PKCζ激酶和不同濃度的抑制劑，室溫孵育1 h后再加入10 μL反應(yīng)液孵育1 h，加入終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)445 nm/520 nm波長(zhǎng)的熒光信號(hào)比值并分析抑制率。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 皮膚鱗癌細(xì)胞株A-431接種于含有10%胎牛血清、4.5 g/L葡萄糖和雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后分別用20、35和70 μmol/L的T5450996處理，對(duì)照組加入DMSO。

1.2.3 細(xì)胞增殖活性測(cè)定 采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A-431細(xì)胞，按4 000個(gè)/孔接種至96孔培養(yǎng)板中，分別加入濃度為 20、35、70 μmol/L 的 T5450996，每個(gè)濃度平行 4孔，并設(shè)一個(gè)對(duì)照組。將96孔板放入37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。每孔中加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在酶標(biāo)儀上讀取450 nm波長(zhǎng)下的光密度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種2×105個(gè)A-431細(xì)胞，孵育箱過夜培養(yǎng)后，分別用20、35和70 μmol/L的T5450996處理12 h，對(duì)照組加入DMSO，胰酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心15 min，重懸于200 μL 4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，吹打均勻后，緩慢吸入到10 mL 95%的乙醇中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行懸浮固定，4℃過夜。1 000 r/min離心棄乙醇，500 μL PBS重懸細(xì)胞，加入RNaseA至終濃度 100 mg/L，37 ℃水浴 30 min，碘化丙啶（PI，20 mg/L）避光染色30 min，上機(jī)檢測(cè)，利用Mod Fit LT軟件分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種5×105個(gè)A-431細(xì)胞，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為90%左右，在無血清DMEM培養(yǎng)液中饑餓培養(yǎng)12 h后，用10 μL槍頭用力均勻地在培養(yǎng)板中劃痕，無菌PBS洗滌3次，每孔加入新鮮無血清培養(yǎng)液2 mL，并分別加入20、35和70 μmol/L的T5450996，對(duì)照組加入DMSO，37℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)12 h。顯微鏡下觀察并測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)（0、3、6、9、12 h）劃痕的寬度，并根據(jù)寬度的變化來計(jì)算細(xì)胞遷移的距離。每孔計(jì)數(shù)4個(gè)隨機(jī)距離，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取50 μL稀釋Matrigel鋪于Transwell小室聚碳酸酯膜上，37℃孵育1 h使Matrigel聚合成凝膠，吸走小室中多余的液體，并在上室、下室分別加入200 μL和600 μL無血清培養(yǎng)液，37℃平衡過夜；取 20 μmol/L T5450996 處理組、35 μmol/L T5450996 處理組、70 μmol/L T5450996處理組和對(duì)照組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×105個(gè)/孔，用200 μL無血清DMEM 培養(yǎng)液重懸，加入Transwell小室上室，在下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，取出小室，用棉簽擦去上室未穿過膜的細(xì)胞，4%中性甲醛固定10 min，吉姆薩染色10 min，PBS洗滌3次，干燥，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞（×200），計(jì)算各組算術(shù)平均數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Fig.1 Molecular structure of T5450996圖1 T5450996的分子結(jié)構(gòu)式

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PKCζ抑制劑的篩選 應(yīng)用經(jīng)典的PKCζ抑制劑篩選試劑盒，篩選得到小分子化合物T5450996（相對(duì)分子質(zhì)量257.33）可以顯著抑制PKCζ激酶的活性，并隨著濃度的增大，抑制率增加，半數(shù)抑制濃度（IC50）約為 35 μmol/L，見圖 1、2。

2.2 T5450996對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A-431細(xì)胞增殖的影響 35 μmol/L、70 μmol/L 的 T5450996 處理組的OD值均低于20 μmol/L T5450996處理組和對(duì)照組細(xì)胞（F=8.973，P＜0.05），后2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），35 μmol/L T5450996 處理組和 70 μmol/L T5450996處理組差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

Fig.2 The inhibitory rate of PKCζ treated by T5450996圖2 T5450996的PKCζ抑制率

Fig.3 Comparison of the OD values of cell proliferation between four groups圖3 4組細(xì)胞增殖的OD值比較

2.3 T5450996對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A-431細(xì)胞周期的影響 結(jié)果表明，35 μmol/L T5450996處理組、70 μmol/L T5450996處理組細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于20 μmol/L T5450996處理組和對(duì)照組，S期細(xì)胞比例顯著低于20 μmol/L T5450996處理組和對(duì)照組，后2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），G2/M期細(xì)胞比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.4 T5450996對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A-431遷移能力的影響 T5450996處理細(xì)胞 12 h后，35 μmol/L T5450996處理組、70 μmol/L T5450996處理組細(xì)胞的遷移距離明顯小于20 μmol/L T5450996處理組和對(duì)照組細(xì)胞（F=26.397，P＜0.05），后 2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖 4。

Tab.1 Comparison of cell cycles between four groups表1 4組細(xì)胞的細(xì)胞周期比較 （n=6，%，±s）

Tab.1 Comparison of cell cycles between four groups表1 4組細(xì)胞的細(xì)胞周期比較 （n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與 20 μmol/L T5450996 處理組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組20 μmol/L T5450996 處理組35 μmol/L T5450996 處理組70 μmol/L T5450996 處理組F G0/G1期74.49±3.87 75.32±4.06 82.26±2.84ab85.85±4.41ab18.612＊＊S期17.25±2.14 16.73±1.79 10.06±0.87ab7.34±1.45ab17.248＊＊G2/M期8.26±1.22 7.95±1.12 7.68±2.11 6.81±0.66 1.769

Fig.4 Comparison of the migration distances between four groups圖4 4組細(xì)胞的遷移距離比較

2.5 T5450996對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A-431侵襲能力的影響 20、35、70 μmol/L T5450996處理組和對(duì)照組的穿過小室的細(xì)胞數(shù)（單位：個(gè)）分別為74.22±13.31、32.34±5.93、28.67±7.63 及 82.81±15.58，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.530，P＜0.01），其中 35、70 μmol/L T5450996 處理組低于 20 μmol/L T5450996處理組和對(duì)照組（P＜0.05），對(duì)照組和 20 μmol/L 處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，35和70 μmol/L T5450996處理組差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

Fig.5 Comparison of the invasion ability between four groups圖5 4組細(xì)胞的侵襲能力比較（×200，比例尺=40 μm）

3 討論

皮膚癌是常見的惡性腫瘤之一，其中鱗狀細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，病死率更高［9］。目前，臨床上治療皮膚癌的方法有手術(shù)、放療、化療及冷凍等［10-12］，雖然可對(duì)患者的病情進(jìn)行控制，但效果仍然存在一定局限性。

PKC是一組磷脂依賴性的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用［13］。根據(jù)同工酶的結(jié)構(gòu)、特性及激活劑的不同PKC 可分為以下 4 大類［14］：傳統(tǒng)型 PKC，包括PKCα［15］、βⅠ、βⅡ、γ；新型 PKC，包括 PKCδ、ε、η、θ、μ；非典型 PKC，包括 PKCζ、ι（或 λ）；3 個(gè) PRK 成員（PRK1～3）。研究表明，PKC也是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要信號(hào)分子，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移多個(gè)過程［16］。同時(shí)，PKC可以被某些促癌劑如佛波酯所激活，也可以被某些抗癌劑所抑制［13］。近年來，已有大量的PKC抑制劑［17］被發(fā)現(xiàn)，如苔蘚蟲素［18］、Enzastaurin［19］、米哚妥林（PKC-412）［20］等已應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，取得了較理想的效果。研究發(fā)現(xiàn)，PKCζ過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移密切 相關(guān)［4］。 近 年 來 文獻(xiàn) 報(bào)道 ，PKCζ抑制 劑PKCZI195.17可抑制PKCζ活性，并可抑制乳腺癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移［21］。因此，PKCζ有可能成為診斷惡性腫瘤的分子標(biāo)志物和抗腫瘤藥物治療的靶點(diǎn)。研究PKCζ抑制劑的作用和機(jī)制有助于新型抗腫瘤藥物的開發(fā)和合理設(shè)計(jì)［8］。

本研究首先利用經(jīng)典Z′-LYTE?試劑盒篩選到一個(gè)顯著抑制PKCζ激酶活性的小分子化合物T5450996，其 IC50為 35 μmol/L。為了證實(shí)其在皮膚鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲中發(fā)揮作用，本研究利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析、劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T5450996處理A-431后細(xì)胞增殖和侵襲能力的變化。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（DMSO處理組）比較，35 μmol/L 和 70 μmol/L T5450996可明顯抑制A-431細(xì)胞的增殖；細(xì)胞周期分析顯示，35 μmol/L和70 μmol/L T5450996可對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A-431的細(xì)胞周期產(chǎn)生明顯的阻滯作用，影響A-431細(xì)胞周期各時(shí)相的分布；劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，35 μmol/L 和 70 μmol/L T5450996 可以抑制皮膚鱗癌細(xì)胞A-431的遷移能力和侵襲能力。這些結(jié)果初步證實(shí)PKCζ抑制劑T5450996具有抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的作用，其具體的作用機(jī)制將進(jìn)一步探討。盡管T5450996抑制PKCζ作用的IC50值較高，但可以通過進(jìn)一步的優(yōu)化合成提高抑制效率。該P(yáng)KCζ抑制劑T5450996的發(fā)現(xiàn)對(duì)于進(jìn)一步研究PKCζ的結(jié)構(gòu)功能、篩選出更加高效的抑制劑，并設(shè)計(jì)出新型抗癌制劑具有重要的臨床意義。

綜上所述，PKCζ抑制劑能夠顯著抑制皮膚鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲，有望作為抗腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移藥物進(jìn)一步開發(fā)利用，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

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（2017-04-12收稿 2017-05-16修回）
（本文編輯 李鵬）

The effect of PKC ζ inhibitor on the proliferation and invasion of skin squamous carcinoma cell line A-431

XING Yan-ling1,WU Jing2?
1 Department of Dermatology,Xianshuigu Hospital Jinnan District,Tianjin 300350,China;2 Department of Clinical Laboratory,the Third Central Hospital of Tianjin,Tianjin Institute of Hepatobiliary Disease,Tianjin Key Laboratory of Artificial Cell,Artificial Cell Engineering Technology Research Center of Public Health MinistrycCorresponding Author E-mail:wujing_821013@sina.com

ObjectiveTo investigate the effect of protein kinase C(PKC)ζ inhibitor T5450996 on the proliferation and invasion of skin squamous carcinoma cell line A-431.MethodsPKCζ inhibitor T5450996 was screened through Z′-LYTE?kit.Cell proliferation assay and cell cycle analysis were used to observe the effects of T5450996 on the proliferation of skin squamous carcinoma A-431 cells.Scratch assay and invasion assay were used to explore the effects of T5450996 on the migration and invasion of skin squamous carcinoma A-431 cells.ResultsThe PKCζ inhibitor T5450996 can inhibit the activity of PKCζ kinase,and the IC50value of T5450996 was about 35 μmol/L.Compared to the control group,35 μmol/L and 70 μmol/L concentrations of T5450996 significantly suppressed the proliferation of A-431 cells and blocked the cell cycle of A-431 cells.The results of scratch assay and invasion assay indicated that the migration and invasion capacities of A-431 cells were markedly impaired after the treatments with 35 μmol/L and 70 μmol/L concentrations of T5450996(P＜0.05).However,20 μmol/L concentration of T5450996 showed no significant effect(P＞0.05).ConclusionPKCζ inhibitor T5450996 significantly inhibits the proliferation and invasion capacities of skin squamous carcinoma cell line A-431,and which may be a small molecular inhibitor with potential applications in the future.

protein kinase C;protein kinase inhibitors;skin neoplasms;cell proliferation;neoplasm invasiveness;neoplasm metastasis;A-431

R739.5

：A

10.11958/20170369

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81301985）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目（14JCQNJC14000）；天津市第三中心醫(yī)院、衛(wèi)生部人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心、天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家自然科學(xué)基金孵育項(xiàng)目（2017YNR3）

1天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院皮膚科（郵編300350）；2天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津市肝膽疾病研究所，天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心

邢艷玲（1982），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事皮膚病、性病的研究

△通訊作者 E-mail:wujing_821013@sina.com