邵潔，張兵兵，趙猛，周云麗，任麗

葡萄球菌核酸酶樣結(jié)構(gòu)蛋白1在應(yīng)激刺激下與T細胞胞內(nèi)抗原1共同參與應(yīng)激顆粒聚集

邵潔，張兵兵，趙猛，周云麗，任麗△

目的探討葡萄球菌核酸酶樣結(jié)構(gòu)蛋白1（SND1）在應(yīng)激刺激下如何與T細胞胞內(nèi)抗原1（TIA-1）共同參與應(yīng)激顆粒（SG）的聚集以及如何調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)。方法利用免疫熒光實驗和激光共聚焦顯微鏡觀察HeLa細胞中的SND1蛋白與TIA-1蛋白在應(yīng)激刺激下是否形成共定位顆粒，并利用綠色熒光蛋白載體過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞進行外源蛋白表達，從而確定在應(yīng)激刺激下SND1蛋白與TIA-1結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。利用RNA干擾技術(shù)敲除HeLa細胞中SND1蛋白表達并利用Western Blotting檢測蛋白表達水平，從而觀察SND1低表達是否對TIA-1聚集形成SG產(chǎn)生影響。利用不同熱休克刺激時間觀察SND1與TIA-1的聚集過程是否存在動態(tài)變化。結(jié)果SND1蛋白在應(yīng)激刺激下與TIA-1蛋白結(jié)合共同參與SG聚集，其主要作用結(jié)構(gòu)域為葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域（SN domain）。SND1低表達不會抑制TIA-1聚集到SG，但會減少SG的數(shù)量。在不同熱休克刺激時間下，SND1聚集到SG的運輸過程滯后于TIA-1。結(jié)論SND1蛋白在應(yīng)激刺激下與TIA-1蛋白共同參與SG的聚集，從而調(diào)節(jié)細胞應(yīng)激反應(yīng)。

應(yīng)激；RNA干擾；葡萄球菌核酸酶樣結(jié)構(gòu)蛋白1；T細胞胞內(nèi)抗原1；應(yīng)激顆粒

真核細胞在受到應(yīng)激刺激時會啟動細胞的保護機制，聚集可調(diào)節(jié)細胞功能的蛋白形成應(yīng)激顆粒（SG）。SG的成分包括未被翻譯的mRNA、翻譯起始因子、核糖體、RNA結(jié)合蛋白等［1］。SG的主要功能

被認為是抑制mRNA的翻譯，同時選擇性地合成生存急需蛋白，從而保護細胞免受應(yīng)激侵害［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)葡萄球菌核酸酶樣結(jié)構(gòu)蛋白1（SND1）可與Ras-GAP SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白（G3BP）結(jié)合從而參與SG形成，并調(diào)節(jié)細胞應(yīng)激反應(yīng)［3］。另有研究表明SND1作為含有多聚A尾mRNA的結(jié)合蛋白參與mRNAs的代謝與穿梭［4］，而SND1在參與應(yīng)激反應(yīng)時其103位的蘇氨酸會被磷酸化修飾［5］，但其對抗應(yīng)激刺激的具體機制尚未闡明。T細胞胞內(nèi)抗原1（TIA-1）是參與SG聚集、結(jié)合多聚A尾mRNA的RNA結(jié)合蛋白［6-7］。TIA-1是RNA識別模序類家族成員，在穩(wěn)定狀態(tài)下會富集于細胞核內(nèi)，同時也會在某些生理狀態(tài)下穿梭于胞核與胞質(zhì)之間［7］，并且TIA-1是SG的標(biāo)志蛋白，其朊病毒樣結(jié)構(gòu)域（PRD）具有自我聚集功能，可促進SG中的RNA結(jié)合蛋白聚集［6］。本研究旨在探討SND1蛋白如何通過與TIA-1結(jié)合參與應(yīng)激反應(yīng)，從而為今后研究細胞應(yīng)激反應(yīng)等保護機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與過表達質(zhì)粒 HeLa細胞由芬蘭坦佩雷大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)研究所分子免疫學(xué)實驗室惠贈。綠色熒光蛋白載體過表達質(zhì)粒包括pEGFP-SND1全長蛋白、pEGFP-SN片段、pEGFP-TSN片段，均為天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑及儀器 抗SND1抗體（鼠源，多克隆抗體）、抗α-Tubulin抗體（兔源，多克隆抗體）、Texas Red-596標(biāo)記的抗羊熒光二抗（兔源，多克隆抗體）、Alexa Flour-488標(biāo)記的抗鼠熒光二抗（兔源，多克隆抗體）購自Abcam公司?？筍ND1抗體（羊源，多克隆抗體）、抗TIA-1抗體（羊源，多克隆抗體）購自Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源、抗羊源、抗兔源的IgG二抗購自晶美公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司。亞砷酸鈉（Arsenite Sodium）購自美國Sigma公司。小干擾RNA序列，包括亂序siRNA（Scramble siRNA）和siRNA-SND1由美國Invitrogen公司設(shè)計并合成。激光共聚焦顯微鏡（FV1000，日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)激刺激實驗 培養(yǎng)HeLa細胞，在細胞處于對數(shù)生長期時將HeLa細胞分別接種到3個90 mm培養(yǎng)皿中，分為A、B、C組，A組即正常對照組，37℃培養(yǎng)；B組以45℃-45 min刺激；C組為亞砷酸鈉0.5 mmol/L-1 h刺激，即培養(yǎng)基中加入亞砷酸鈉至終濃度為0.5 mmol/L。按以上刺激條件對細胞進行應(yīng)激刺激，由于TIA-1是SG的標(biāo)志蛋白，所以SG形成標(biāo)準(zhǔn)為：HeLa細胞經(jīng)過抗TIA-1抗體染色后，在顯微鏡下能觀察到TIA-1呈陽性表達的紅色熒光顆粒即為SG。

1.2.2 免疫熒光和激光共聚焦實驗 對經(jīng)過以上刺激條件

的HeLa細胞進行免疫熒光抗體染色。首先用4%多聚甲醛-PBS溶液對細胞進行固定，再加0.2%TritonX-100-PBS溶液對細胞透化處理，并用0.2%BSA-PBS溶液封閉細胞之后進行抗體孵育：加一抗anti-TIA-1羊源（1∶200）在水平搖床上4℃搖16 h，之后加德克薩斯紅（Texas Red）抗羊二抗熒光抗體（1∶500）在水平搖床上室溫搖1 h。再加一抗anti-SND1鼠源（1∶50）和阿萊克斯熒光（Alexa Flour）488抗鼠二抗熒光抗體（1∶500），方法同前。最后用DAPI溶液進行核染色，標(biāo)本用激光共聚焦顯微鏡觀察并收集圖片，100×放大物鏡。結(jié)果圖片用Image J 1.48u圖像處理軟件編輯和整理。紅色圖片是細胞中的TIA-1的表達與定位，綠色圖片是SND1的表達與定位，處理后可觀察兩蛋白細胞內(nèi)共定位（即綠色與紅色重疊的黃色圖片）。

1.2.3 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）實驗 培養(yǎng)HeLa細胞，設(shè)置A、B、C 3組，3組細胞的處理條件同方法1.2.1，進行應(yīng)激刺激后裂解HeLa細胞，每個培養(yǎng)皿加細胞裂解液，冰上作用30 min，之后采用超聲破碎法裂解細胞，離心，收集上清獲全細胞裂解液；BCA法測定總蛋白濃度，并取出3組各自的全細胞裂解液樣本的10%作為Input（陽性對照）。再將每組全細胞裂解液混勻后按體積均分3份，每份樣本分別加入抗 SND1抗體（1∶500）、抗 TIA-1抗體（1∶200）和IgG抗體（作為陰性對照）以及瓊脂糖4B磁珠，在4℃水平搖床作用16 h后離心，收集磁珠后得到蛋白復(fù)合物樣本，進行蛋白免疫印跡實驗。

1.2.4 蛋白免疫印跡實驗（Western Blotting） 將Co-IP方法得到的蛋白復(fù)合物在4%SDS-PAGE濃縮凝膠和10%SDSPAGE分離凝膠進行凝膠分離蛋白。電泳結(jié)束后將凝膠在250 mA、90 min條件下電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，牛奶常溫封閉1 h，TBST沖洗，裁剪目的條帶SND1和TIA-1，分別置于抗SND1抗體（1∶2 000）和抗 TIA-1抗體（1∶1 000）以及抗 α-Tubulin（1∶5 000）抗體中4℃孵育過夜。而后將PVDF膜置于二抗（1∶5 000）孵育液中1 h，最后用ECL發(fā)光底物顯色陽性蛋白條帶。

1.2.5 pEGFP過表達質(zhì)粒和小干擾RNA轉(zhuǎn)染實驗 培養(yǎng)HeLa細胞，對數(shù)生長期時將細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，饑餓過夜。取3份同樣的10 μL Lipofectamine 2000分別加入3份200 μL無血清培養(yǎng)基中孵育10 min。再將過表達質(zhì)粒pEGFP-SND1全長蛋白、pEGFP-SN和pEGFP-TSN片段各取10 μL，分別加入3份200 μL無血清培養(yǎng)基中孵育10 min。之后將1份Lipofectamine 2000混合物與pEGFP-SND1全長蛋白質(zhì)?；旌衔镌俜跤?0 min，另2個質(zhì)?；旌衔镆来送āＷ詈髮?種質(zhì)?；旌衔锞徛渭佑?組細胞中，邊滴加邊混勻，培養(yǎng)24～48 h后觀察轉(zhuǎn)染效率。小干擾RNA轉(zhuǎn)染的方法同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。Scramble siRNA序列為5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3′（作為陰性對照，不敲除SND1的表達），SND1-siRNA 序列為 5′-AAGGCATGAGAGCTAATAATC-3′，并利用Western Blotting檢測SND1是否被敲除。

2 結(jié)果

2.1 SND1與TIA-1在應(yīng)激刺激下可以形成細胞內(nèi)共定位顆粒 激光共聚焦顯微鏡下可見，SND1在應(yīng)激刺激下與TIA-1可形成細胞內(nèi)共定位顆粒。A組顯示SND1與TIA-1彌散、均勻地分布于細胞內(nèi)，無共定位顆粒出現(xiàn)。B組和C組可見SND1與TIA-1聚集于同一顆粒中，這些顆粒即為SG，見圖1。

Fig.1 SND1 co-localized with TIA-1 on stress granules under stress condition(scale bar 10 μm)圖1 SND1在應(yīng)激刺激下與TIA-1形成共定位顆粒（比例尺 10 μm）

Fig.2 SND1 interacted with TIA-1 weakly under stress stimuli圖2 SND1在應(yīng)激刺激下與TIA-1有微弱的蛋白結(jié)合作用

Fig.3 SN domain of SND1 associated with TIA-1 under stress stimuli(scale bar 10 μm)圖3 SN結(jié)構(gòu)域是SND1在應(yīng)激刺激下與TIA-1相互作用結(jié)構(gòu)域（比例尺10 μm）

2.2 SND1蛋白與TIA-1在應(yīng)激刺激下可形成微弱的Co-IP結(jié)合 Co-IP結(jié)果顯示，A組培養(yǎng)條件下得到的蛋白復(fù)合物中幾乎檢測不到SND1和TIA-1的結(jié)合作用。而在B組和C組培養(yǎng)條件刺激下，Co-IP所得到的蛋白復(fù)合物中能檢測到兩者微弱的結(jié)合作用，見圖2。

2.3 SND1在應(yīng)激刺激下通過其SN結(jié)構(gòu)域與TIA-1產(chǎn)生細胞內(nèi)共定位 不同蛋白片段與TIA-1的蛋白定位情況有所不同，pEGFP-SND1、pEGFP-SN過表達蛋白均可與TIA-1形成共定位顆粒，但pEGFP-TSN過表達蛋白不能與TIA-1形成共定位顆粒，見圖3。

2.4 敲除HeLa細胞內(nèi)源性SND1蛋白的表達 轉(zhuǎn)染了SND1-siRNA的HeLa細胞被敲除了SND1表達。轉(zhuǎn)染了SND1-siRNA的HeLa細胞，SND1表達降低，而轉(zhuǎn)染了Scramble siRNA的HeLa細胞并沒有影響SND1表達量，同時以TIA-1以及α-tubulin的表達作為參照蛋白，見圖4。

2.5 敲除SND1表達未抑制TIA-1的聚集但會影響SG的大小和數(shù)量 敲除HeLa細胞的SND1蛋白表達后，免疫熒光結(jié)果顯示SND1低表達，未影響TIA-1的聚集，但減少了SG的數(shù)量。轉(zhuǎn)染了ScramblesiRNA的HeLa細胞在應(yīng)激刺激下，SND1與TIA-1的聚集未受任何影響，而轉(zhuǎn)染了SND1-siRNA的HeLa細胞經(jīng)過45℃-45 min刺激后，雖然TIA-1仍能聚集形成SG，但SG的數(shù)量明顯減少，見圖5。

2.6 SND1在應(yīng)激刺激下聚集到SG的過程滯后于TIA-1 在不同的熱休克刺激時間下，隨著刺激時間的延長，SND1與TIA-1逐漸聚集形成SG，在刺激5 min時已經(jīng)可見明顯的TIA-1陽性顆粒，但SND1的聚集還不明顯，刺激30 min時SND1陽性顆粒才基本形成，兩者共同聚集于SG。在不同的刺激時間，分別計數(shù)100個HeLa細胞，其中含有SND1陽性顆粒的細胞數(shù)明顯少于含有TIA-1陽性顆粒的細胞數(shù)，SND1聚集到SG的運輸過程滯后于TIA-1，見圖 6、7。

Fig.4 The expression of SND1 interfered by RNAi and measured by Western Blotting assay圖4 SND1蛋白表達水平通過RNAi被敲除并利用Western Blotting檢測蛋白表達

Fig.5 Knockdown of SND1 did not inhibit the recruitment of TIA-1 onstress granules(scale bar 10 μm)圖5 敲除SND1不會抑制TIA-1聚集到SG（比例尺10 μm）

Fig.6 Aggregation of SND1 laged behind TIA-1 on stress granules(scale bar 10 μm)圖6 SND1聚集到SG的過程滯后于TIA-1（比例尺10 μm）

3 討論

SG是細胞在應(yīng)對應(yīng)激刺激時形成的胞內(nèi)動態(tài)顆粒結(jié)構(gòu)［3］。當(dāng)真核細胞受到氧化應(yīng)激、熱休克、紫外線照射及病毒感染等應(yīng)激刺激時，首先會終止蛋白質(zhì)翻譯的起始過程，然后重新改編mRNAs代謝程序，調(diào)節(jié)具有修復(fù)損傷功能的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄及表達［3，8-9］。由此，細胞胞質(zhì)中就形成了這種無胞膜的細胞亞結(jié)構(gòu)［4］，它的出現(xiàn)是細胞保護性機制啟動的表現(xiàn)。近來研究報道了TIA-1、G3BP、多聚A尾mRNA結(jié)合蛋白（PABP）等許多分子都參與SG的聚集［7，10］。TIA-1 作為 SG 的重要標(biāo)志蛋白，可以通過其PRD結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)SG中蛋白的相互聚集過程，因而被稱為 SG 的啟動因子［2，11］。TIA-1 可調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ受體 1（AT1R）的 mRNA 的聚集［12］，這些研究顯示TIA-1是調(diào)節(jié)SG功能的重要分子。

SND1是近來發(fā)現(xiàn)參與SG聚集的組分之一，其不僅可以與G3BP結(jié)合參與SG的形成［3］，還可與AT1R共定位于SG，調(diào)節(jié)其聚集和穿梭過程，并可調(diào)節(jié)多聚A尾mRNAs向SG的聚集過程［4，13］。而本研究顯示SND1在應(yīng)激刺激時通過其SN結(jié)構(gòu)域與TIA-1結(jié)合并共定位于SG，證實SND1實現(xiàn)其功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是N端4個相似的葡萄球菌核酸酶樣結(jié)構(gòu)域［3，14］。由此結(jié)果推測SN結(jié)構(gòu)域很可能起到蛋白與蛋白之間的橋聯(lián)作用，從而促進蛋白復(fù)合物的形成。另外，RNAi敲除SND1表達不會影響TIA-1聚集形成SG，提示SND1不是啟動SG聚集的蛋白組分，SG的形成也不是單一某個蛋白就能決定的。其具體機制，一方面可能與蛋白自身結(jié)構(gòu)特點有關(guān)，另一方面可能與其調(diào)節(jié)不同的RNA代謝有關(guān)，SND1的缺失可能只影響某一類mRNA的代謝而不會影響其他mRNA及RNA結(jié)合蛋白的聚集，由此就表現(xiàn)為聚集顆粒數(shù)量的減少而不是完全被抑制。而在不同熱休克刺激時間下，TIA-1是先于SND1聚集到SG的蛋白，這也佐證了SG中的蛋白聚集是有時序性和階段性的，應(yīng)激刺激所影響的mRNA及對應(yīng)的RNA結(jié)合蛋白很可能在某些具有引導(dǎo)作用的分子的“指揮”下或依賴不同的信號通路按照一定的時間順序聚集成SG，由此可以推測SG結(jié)構(gòu)具有動態(tài)可變性，這可能與不同的刺激因素和刺激時間有關(guān)［8］。

綜上所述，SND1在應(yīng)激刺激下與TIA-1共同參與SG聚集，從而參與細胞的應(yīng)激反應(yīng)。SG從本質(zhì)上說就是被終止翻譯的那些“受傷”的mRNAs的分類急救中心［9，15］，它不僅掌管著那些 mRNAs的最終命運，而且也作為細胞的信號通路上的“集線器”直接參與應(yīng)激狀態(tài)下的不同信號通路之間的“溝通與對話”［9,16］。而 SND1作為具有結(jié)合多聚A尾mRNAs的一種RNA結(jié)合蛋白，其參與真核細胞對抗應(yīng)激刺激的生物學(xué)機制勢必成為SG及應(yīng)激相關(guān)理論的關(guān)鍵點之一［17］。盡管SND1究竟參與哪種mRNA的代謝以及遵循哪幾條信號通路起作用仍有待進一步驗證，但其作為SG的重要組分已經(jīng)逐漸成為SG理論研究和治療相關(guān)疾病的潛在新靶點。

Fig.7 The number of cells per 100 with SND1+and TIA-1+granules under different stress time points圖7 在不同刺激時間下每100個HeLa細胞中的含有SND1+顆粒和TIA-1+顆粒的細胞數(shù)

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（2017-03-06收稿 2017-04-27修回）

（本文編輯 李國琪）

SND1 protein co-localization with TIA-1 on stress granules under stress stimuli

SHAO Jie,ZHANG Bing-bing,ZHAO Meng,ZHOU Yun-li,REN Li△
Department of Clinical Laboratory,Cancer Institute and Hospital,Tianjin Medical University,National Clinical Research Center of Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China△

E-mail:roland-li@163.com

ObjectiveTo analyze the association of staphylococcal nuclease domain-containing protein 1(SND1)and T-cell intracellular antigen 1(TIA-1)on stress granules,and the regulation of SND1 on stress granules under stress stimuli.MethodsThe immunofluorescence assay and laser scanning confocal microscopy were used to observe the co-localization of SND1 protein and TIA-1 protein under stress stimuli,and the over-expression plasmids of pEGFP vector were transfected into HeLa cells and to verify which domain of SND1 co-localized with TIA-1 under stress stimuli.RNA interferencemediated knockdown of the expression of SND1 protein in HeLa cells was measured by Western Blotting assay.Then whether the knockdown of SND1 affected the recruitment of TIA-1 on stress granules was observed.Heat shocks under different times were used to identify whether there were dynamic changes in transportation of SND1 and TIA-1 on stress granules.ResultsSND1 co-localized with TIA-1 on stress granules under stress stimuli,and the associated domain of SND1 were SN domain.TIA-1 still can be recruited on stress granules but a large amount of stress granules were reduced even though the expression of SND1 protein was decreased.And the transportation of SND1 on stress granules was laged behind TIA-1 under different-times of heat shocks.ConclusionSND1 protein co-localizes with TIA-1 on stress granules,and which co-regulates the cellular stress response under stress stimuli.

stress;RNA interference;Staphylococcal nuclease domain-containing protein 1;T-cell intracellular antigen 1;stress granule

R349.5

：A

10.11958/20170286

國家自然科學(xué)基金青年項目（31501091）

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院檢驗科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室（郵編300060）

邵潔（1980），女，博士研究生，講師，主要從事免疫學(xué)及臨床腫瘤標(biāo)志物研究

△通訊作者 E-mail:roland-li@163.com