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氮摻雜類金剛石薄膜的制備及生物相容性研究

吾凡別克·巴合提1馬嘉平1米拉·巴合提2阿依古麗·吐?tīng)柕?董棣文1祖力卡爾江·阿合買提1

目的 利用等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積（Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition，PECVD）技術(shù)，在鈦合金表面制備含氮類金剛石薄膜（DLC∶N），并對(duì)其生物相容性進(jìn)行研究。方法采用掃描電子顯微鏡、X-射線光電子能譜儀、接觸角測(cè)量?jī)x、拉曼光譜儀對(duì)樣品的表面形貌特征、組成元素和表面潤(rùn)濕性進(jìn)行表征；利用MTT比色法、熒光染色法進(jìn)行生物學(xué)行為的評(píng)價(jià)。結(jié)果成骨細(xì)胞在摻氮類金剛石薄膜（DLC∶N）表面不論是增殖黏附狀態(tài)還是細(xì)胞數(shù)量都優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）。結(jié)論在DLC中加入氮元素，能夠提升其生物相容性，促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附和增殖。

類金剛石薄膜；氮摻雜；黏附；生物相容性

類金剛石薄膜（Diamond-Like Carbon Film,DLC）的產(chǎn)品涉及機(jī)械、光學(xué)、電子和醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，因?yàn)槠渚哂谐錾哪湍p性、超高硬度、高表面光潔度及生物相容性[1-3]。對(duì)于DLC薄膜，研究人員一直嘗試用不同方法來(lái)改進(jìn)其性能，在DLC薄膜中摻雜金屬離子提高DLC的機(jī)械性能就是其中一種[4-10]。但Gutensohn等認(rèn)為，在人體環(huán)境中，無(wú)法保證DLC薄膜中的金屬離子，如W、Cr、Ni，不發(fā)生釋放而引起細(xì)胞毒性或者過(guò)敏反應(yīng)[11,12]。對(duì)于DLC中摻雜非金屬元素的研究，Liao發(fā)現(xiàn)在類金剛石薄膜中摻雜氮元素能夠增強(qiáng)類金剛石薄膜的耐腐蝕性能[13]，但對(duì)于摻入氮元素是否會(huì)影響其生物相容性的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積（Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition，PECVD）技術(shù)制備摻氮類金剛石薄膜（DLC∶N）并表征，同時(shí)與成骨細(xì)胞體外共培養(yǎng)，對(duì)其生物相容性和成骨細(xì)胞活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 薄膜制備

將醫(yī)用鈦合金片（雙威金屬制品有限公司，江蘇）通過(guò)由粗到細(xì)的砂紙逐級(jí)打磨拋光至鏡面狀，超聲蕩洗20分鐘，用氮?dú)獯蹈蓚溆茫洖門i組。

通過(guò)PECVD技術(shù)在備用的鈦合金片表面分別制備出單純的DLC薄膜（記為DLC組）以及含有氮元素的DLC薄膜（記為DLC∶N組）。制備參數(shù)見(jiàn)表1。

1.2 類金剛石薄膜的表征

采用掃描電子顯微鏡（SEM）、X-射線光電子能譜儀（XPS）、激光拉曼光譜儀（Raman）、接觸角測(cè)量?jī)x對(duì)Ti組、DLC組以及DLC∶N組的表面形態(tài)特征進(jìn)行觀察、對(duì)元素含量、拉曼光譜及表面潤(rùn)濕性能進(jìn)行觀察、測(cè)量、分析。

1.3 生物學(xué)性能研究

將Ti組、DLC組以及DLC∶N組樣品同成骨細(xì)胞分別共培養(yǎng)1、3、5天（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組6個(gè)樣），采用MTT比色法檢測(cè)樣品吸光度值，并記錄結(jié)果。

對(duì)各組樣品表面培養(yǎng)第5天的成骨細(xì)胞固定并用熒光染色法染色，通過(guò)熒光顯微鏡（Olympus BX5-1型）對(duì)細(xì)胞附著形態(tài)進(jìn)行觀察。利用Image J軟件對(duì)三組樣品表面細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)及所占面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡、XPS、Raman、接觸角

圖1為Ti組、DLC組以及DLC∶N組樣品在SEM下的表面形貌圖。Ti組表面呈現(xiàn)不規(guī)則的凹坑及劃痕狀結(jié)構(gòu)。DLC組和DLC∶N組表面呈平滑的淺凹和波浪狀結(jié)構(gòu)，將鈦合金基底表面凹坑及劃痕狀結(jié)構(gòu)覆蓋。

圖1 Ti、DLC、DLC∶N組掃描電鏡圖（×100）

圖2 所示為Ti組、DLC組以及DLC∶N組樣品的XPS測(cè)試圖。在Ti組表面測(cè)出Ti2p（456 ev）峰。而DLC組和DLC∶N組中，未出現(xiàn)Ti2p峰。DLC組中以C1s（285 ev）和O1s（531ev）為主。DLC∶N組以C1s（285 ev）、O1s（531ev）、N1s（398 ev）為主，其中氮元素含量為4.9%，說(shuō)明含氮元素類金剛石薄膜制備成功。

圖2 Ti6Al4V、DLC、DLC∶N的XPS光譜圖

圖3 為DLC組和DLC∶N組的拉曼光譜圖。典型的DLC薄膜具有分布在1520 cm-1處的G峰以及分布于1220 cm-1左右的D峰，兩組樣品均具有DLC薄膜的典型特征，也說(shuō)明了DLC薄膜的結(jié)構(gòu)沒(méi)有受到摻入N元素的影響。

圖3DLC、DLC:N薄膜的拉曼光譜圖

圖4 為三組樣品表面接觸角測(cè)試圖，Ti組表面相對(duì)親水，平均接觸角為49.82°（圖3）；DLC∶N組相對(duì)于DLC組更加親水。Xu LC等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[14-17]：一般情況下，細(xì)胞在接觸角低于54°的材料表面不易黏附。而Sen A研究認(rèn)為細(xì)胞最容易在表面接觸角為66°的材料表面黏附生長(zhǎng)[16]，三組材料中DLC∶N組（70.40°）最為接近。

圖4 Ti6Al4V、DLC、DLC∶N平均接觸角

2.2 生物學(xué)性能

圖5（彩圖見(jiàn)插頁(yè)）所示為MTT比色法得到的Ti組、DLC組以及DLC∶N組樣品細(xì)胞增殖率的比較?？梢?jiàn)DLC組以及DLC∶N組表面成骨細(xì)胞增殖率在第1、第3天均大于Ti組（P<0.05），DLC組增殖率在第5天同Ti組無(wú)明顯差異（P≥0.05），DLC∶N組在每個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)的增殖率均高于Ti組，在第1天和第5天的增殖率高于DLC組（P<0.05），說(shuō)明DLC∶N組對(duì)于成骨細(xì)胞黏附生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用。

圖5成骨細(xì)胞在Ti6Al4V、DLC、DLC∶N薄膜表面細(xì)胞的增殖率

圖6 （彩圖見(jiàn)插頁(yè)）為Ti組、DLC組以及DLC∶N組表面成骨細(xì)胞第5天的熒光染色圖?？梢钥闯?，三組材料表面細(xì)胞核形態(tài)保持正常，無(wú)細(xì)胞核碎片出現(xiàn)，說(shuō)明無(wú)早期細(xì)胞凋亡和壞死現(xiàn)象。細(xì)胞以圓球形、長(zhǎng)梭形為主，數(shù)量以長(zhǎng)梭形細(xì)胞居多。Ti組和DLC組的表面細(xì)胞具有明顯偽足，但密度較稀疏；DLC∶N組細(xì)密度更高，細(xì)胞延伸出長(zhǎng)短不同的突起，具有良好的鋪展性和團(tuán)簇生長(zhǎng)傾向。利用Image J軟件完成細(xì)胞計(jì)數(shù)的統(tǒng)計(jì)，標(biāo)記樣品表面細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞所占總面積以及平均細(xì)胞面積進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2。DLC∶N組表面成骨細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)量、所占面積上都明顯優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組（P<0.05），也證實(shí)了DLC∶N組能促進(jìn)表面成骨細(xì)胞的增殖。

圖6 Ti6Al4V、DLC、DLC∶N薄膜表面的成骨細(xì)胞的熒光照片（×100）

表2 Ti6Al4V、DLC、DLC∶N表面成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞總面積和平均尺寸

3 討論

對(duì)于骨科植入材料來(lái)說(shuō)，我們需要材料具有良好的機(jī)械性能及出色的生物相容性。類金剛石薄膜在問(wèn)世以來(lái)就受到醫(yī)學(xué)界研究人員的廣泛關(guān)注，這同其自身結(jié)構(gòu)和特性密不可分，類金剛石薄膜是由C原子以Sp2和Sp3雜化軌道組合，兼?zhèn)浣饎偸臋C(jī)械性能以及石墨材料的生物學(xué)性能，它的產(chǎn)品涉及機(jī)械、光學(xué)、電子和醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域[1]，但對(duì)于類金剛石薄膜的改性也一直在繼續(xù)，曾有研究人員通過(guò)摻雜金屬元素來(lái)降低薄膜內(nèi)部應(yīng)力，但在生物組織環(huán)境中金屬元素可能會(huì)從薄膜中析出，影響材料生物學(xué)性能[11,12]。N元素是蛋白質(zhì)主要組成元素，不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，其次Liao研究發(fā)現(xiàn)在類金剛石薄膜中摻雜氮元素能夠增強(qiáng)類金剛石薄膜的耐腐蝕性能[13]，但對(duì)于摻入氮元素是否會(huì)影響DLC薄膜生物相容性的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PECVD技術(shù)制備摻氮類金剛石薄膜（DLC∶N）并表征，同時(shí)與成骨細(xì)胞體外共培養(yǎng)，研究其生物學(xué)行為，為最終臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

首先通過(guò)XPS及拉曼光譜檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)采用PECVD技術(shù)在一定參數(shù)下可以成功制備摻雜氮元素的類金剛石薄膜（圖2），而且在鈦合金表面的DLC和DLC∶N可以完全覆蓋薄膜，這對(duì)于植入性材料來(lái)說(shuō)，隔絕了基底金屬材料同組織之間的接觸，防止周圍體炎的發(fā)生。其次電鏡下我們發(fā)現(xiàn)鈦合金材料雖然經(jīng)過(guò)打磨拋光至鏡面狀，但在電鏡下仍具有許多凹坑狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格清洗消毒后仍會(huì)有少量金屬碎屑摻雜其中，這必將影響植入體在體內(nèi)的長(zhǎng)期使用，但經(jīng)過(guò)薄膜表面處理后，表面呈致密淺凹狀，通過(guò)簡(jiǎn)單清洗就能將表面清洗干凈，基本不會(huì)殘留碎屑。而通過(guò)表面親水性測(cè)試可以發(fā)現(xiàn)，類金剛石薄膜相對(duì)于鈦合金表面來(lái)說(shuō)相對(duì)疏水，但通過(guò)摻氮處理可以使其更加親水，Sen研究認(rèn)為細(xì)胞最容易在表面接觸角為66°的材料表面黏附生長(zhǎng)[16]，三組材料中DLC∶N組（70.40°）最為接近。

最后，我們通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)于三組材料表面成骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)試，并通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DLC∶N組表面成骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀況明顯好于DLC組以及Ti組，N元素的摻入對(duì)于促進(jìn)DLC薄膜表面成骨細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的原因可能為以下幾點(diǎn)：和Ti組相比，DLC∶N可以把基底材料完全覆蓋，防止鈦合金基底（Ti6Al4V）中Al元素的釋放而產(chǎn)生細(xì)胞毒性，而且致密光滑的表面，也可以防止影響細(xì)胞增殖的碎屑材料殘留于基底凹坑結(jié)構(gòu)中。相比于DLC組，N元素的加入使得DLC薄膜親水角更接近最適于細(xì)胞初期黏附的接觸角度。N元素是我們?nèi)祟惐夭豢缮俚臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)—蛋白質(zhì)的組成部分，不但沒(méi)有細(xì)胞毒性，而且還有可能同表面細(xì)胞形成某種化學(xué)鍵結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞黏附增殖。綜上所述，對(duì)于DLC薄膜來(lái)說(shuō)，摻氮是一種切實(shí)有效的改性方法，DLC∶N不但可以大大提升材料表面耐磨損能力，硬度以及光潔度，還增加了材料的生物相容性能，展示了作為植入性材料應(yīng)用于實(shí)際臨床中的潛力。

4 結(jié)論

本文采用PECVD技術(shù)，在鈦合金表面成功制備了DCL∶N薄膜。在材料表面接種培養(yǎng)成骨細(xì)胞，通過(guò)MTT、熒光染色法對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明鈦合金表面的DCL∶N薄膜具有良好的生物相容性。

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The research of preparation and biocompatibility of nitrogen-doped diamond-like carbon films

Wufanbieke·Baheti1,Ma Jiaping1,Mira·Baheti2,et al.1 Department of Stomatology,People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region;2 Xinjiang Medical University,Xinjiang Urumqi,830000,China

Objective The nitrogen-doped diamond-like carbon film(DLC∶N)was made on Ti6Al4V alloy by means of plasma enhanced chemical vapor deposition(PECVD)technique,and its biocompatibility researched.Methods The surface morphology,chemicalcomposition and contact angle were characterized by means ofSEM,XPS,Raman Spectrometer and contact angle measuring device.The biological behavior was evaluated by MTT and fluorescent staining. Results The proliferation of osteoblastscell on the surface of nitrogen-doped diamond like carbon films(DLC∶N)were higher than those of other experimental groups(P<0.05).Conclusion The addition of nitrogen in DLC can enhance its biocompatibility,improve adhesion and proliferation of osteoblast.

Diamond-like carbon;N-doped;Biocompatibility

R318

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.03.003

swgk2016-12-00292

2016-12-19）

1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科；2新疆醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊830000

吾凡別克·巴合提（1988-）男，碩士，住院醫(yī)師。研究方向：口腔醫(yī)學(xué)。