滕 菲 姜廣建

(北京中醫(yī)藥大學2014級碩士研究生，北京 100029)

紫草素對小鼠卵母細胞發(fā)育成熟的影響※

滕 菲 姜廣建1

(北京中醫(yī)藥大學2014級碩士研究生，北京 100029)

目的 觀察紫草素對小鼠卵母細胞發(fā)育成熟的影響，并探討其作用機制。方法 采用6～8周齡ICR雌性小鼠的GV期未成熟卵母細胞，分別放入含有5、10、20、50 μg/mL濃度紫草素的4組培養(yǎng)液，另外再配置4組含有3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)抑制劑的紫草素培養(yǎng)液，并以不含紫草素的培養(yǎng)液為對照組。單純含紫草素的各組培養(yǎng)液及對照組直接進行卵母細胞培養(yǎng)，含IBMX抑制劑的紫草素培養(yǎng)液先靜置12 h后再洗脫IBMX進行卵母細胞培養(yǎng)。各組均培養(yǎng)2 h后統(tǒng)計生發(fā)泡破裂(GVBD)率，12 h后統(tǒng)計第一極體排出率，并顯微鏡下觀察紫草素對卵母細胞紡錘體及第一極體排出的情況。結果 20、50 μg/mL紫草素對卵母細胞的發(fā)育成熟具有絕對抑制作用，GVBD率及第一極體排出率均為0；5 μg/mL紫草素對卵母細胞無明顯抑制作用(P>0.05)；10 μg/mL紫草素對卵母細胞的GVBD率無明顯影響(P>0.05)，但對第一極體排出率有明顯抑制作用(P<0.05)；顯微鏡下觀察顯示，對照組第一極體排出正常，僅有少量卵母細胞出現(xiàn)異常紡錘體形態(tài)，10 μg/mL紫草素組則第一極體排出受到抑制，出現(xiàn)大量卵母細胞異常紡錘體形態(tài)，紡錘體呈現(xiàn)無極、散極或者多極等異?，F(xiàn)象。結論 高濃度的紫草素對卵母細胞發(fā)育成熟具有明顯抑制作用，可影響紡錘體的形成和第一極體的排出，其作用機制可能與紫草素抑制卵母細胞能量代謝有關。

紫草素；卵母細胞；動物,實驗；小鼠

紫草素是從中藥紫草根部提取的萘醌類化合物，M2型丙酮酸激酶(PKM2)是糖酵解過程中關鍵的限速酶，研究表明紫草素及其類似物是一種有效的PKM2專一抑制劑[1]。腫瘤細胞增殖的能量來源途徑是有氧糖酵解，大量實驗研究表明，紫草素能夠抑制腫瘤細胞中的PKM2，從而有效抑制腫瘤細胞的增殖[2-4]。卵母細胞中能量代謝途徑也是有氧糖酵解，PKM2水平可影響卵母細胞能量代謝過程[5]。紫草素及其類似物是目前研究最多的PKM2抑制劑，主要用于抗腫瘤方面研究，尚未有紫草素對卵母細胞能量代謝影響的相關報道，故本實驗擬對紫草素是否對卵母細胞能量代謝及發(fā)育成熟有影響展開研究。

1 材料與方法

1.1 動物 ICR雌性小鼠72只，6～8周齡，根據(jù)中國動物學會和中國科學院要求進行飼養(yǎng)，斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2014-0006。

1.2 儀器 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；LSM 780激光共聚焦顯微鏡，德國Zeiss公司。

1.3 試劑 紫草素、二甲基亞砜(DMSO)、M2培養(yǎng)液、胎牛血清白蛋白(BSA)、甲醇、石蠟油、吐溫20(Tween20)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、α微管蛋白抗體(α-TubulinAb)、活細胞染料(Hoechst33342)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，均購自美國Sigma試劑公司；Anti-PKM2抗體，購自英國Abcam公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 卵母細胞的收集與培養(yǎng) 取6～8只雌性ICR小鼠，采用頸椎脫位法處死，快速取出小鼠卵巢，然后用刀片將卵巢剁碎，將未成熟的卵母細胞釋放到M2培養(yǎng)液中。在顯微鏡觀察下挑選出形態(tài)飽滿折光性強且?guī)в型暾l(fā)泡的GV期未成熟卵母細胞100～200個備用。

1.4.2 紫草素培養(yǎng)液的制備及分組 取10 mg紫草素用100 μL的DMSO稀釋成100 mg/mL儲備液，再取99 μL的M2培養(yǎng)液將1 μL的儲備液稀釋成1 mg/mL的工作液，再用M2培養(yǎng)液分別稀釋成5、10、20、50 μg/mL的4組含不同濃度紫草素的培養(yǎng)液。再另取IBMX按1∶1 000的比率加入各組，配置成含IBMX的紫草素培養(yǎng)液(IBMX可抑制卵母細胞的發(fā)育成熟)。另外單獨取DMSO加入M2培養(yǎng)液配成1∶5 000倍稀釋的溶液作為對照組。將獲取的GV期未成熟卵母細胞分別放入各組含不同濃度紫草素的培養(yǎng)液及對照組培養(yǎng)液中，每組20～30個。單純含紫草素的各組培養(yǎng)液及對照組直接進行卵母細胞培養(yǎng)，含IBMX抑制劑的紫草素培養(yǎng)液先靜置12 h，讓紫草素充分進入細胞后，再洗脫IBMX進行卵母細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度37 ℃,CO2濃度5%，濕度5%。各組均培養(yǎng)2 h后統(tǒng)計生發(fā)泡破裂(GVBD)率，12 h后統(tǒng)計第一極體排出率。

1.4.3 卵母細胞的GVBD率及第一極體排出率 各組卵母細胞常規(guī)培養(yǎng)2 h后，在顯微鏡下觀察數(shù)出各組發(fā)生GVBD現(xiàn)象的卵母細胞個數(shù)，然后計算每組的GVBD率。12 h后再觀察數(shù)出各組發(fā)生第一極體排出的卵母細胞個數(shù)，然后計算每組的第一極體排出率。該實驗重復3次，取平均值。

1.4.4 紡錘體形態(tài)觀察 將卵母細胞用含有4%多聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH值7.4)進行固定30 min。在室溫下用0.5%的Triton X-100透膜液進行處理20 min，之后將卵母細胞放入含1% BSA的磷酸二氫鉀PBS封閉液中封閉1 h。在含有0.1% Tween 20和0.01% Triton X-100的PBS中分別清洗3次,每次時間間隔5 min。再用由M2培養(yǎng)液按1∶40 000比例稀釋的α-Tubulin抗體進行紡錘體染色。4 ℃冰箱放置過夜，在含有0.1% Tween 20和0.01% Triton X-100的PBS中分別清洗3次,每次時間間隔5 min。洗脫過后用Hoechst33342進行染色體染色。最后，在蓋玻片的四角用9∶1凡士林石蠟油做4個柱，把一滴封片劑點在載玻片中央，移入卵母細胞，蓋上蓋玻片，用激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

2 結 果

2.1 含IBMX的各組紫草素培養(yǎng)液及對照組培養(yǎng)后卵母細胞GVBD率及第一極體排出率情況比較 見表1。

由表1可見，20、50 μg/mL紫草素組卵母細胞GVBD率及第一極體排出率均為0，說明這2個濃度的紫草素對卵母細胞的發(fā)育成熟起到了絕對抑制作用，對卵母細胞具有細胞毒性。5 μg/mL紫草素組卵母細胞GVBD率及第一極體排出率與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明5 μg/mL紫草素對卵母細胞無明顯抑制作用。10 μg/mL紫草素組卵母細胞的GVBD率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但第一極體排出率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明10 μg/mL紫草素對卵母細胞第一極體排出情況有明顯抑制作用。

表1 含IBMX的各組紫草素培養(yǎng)液及對照組培養(yǎng)后 卵母細胞GVBD率及第一極體排出率情況比較 ±s

與對照組比較，*P<0.05

2.2 各組紫草素培養(yǎng)液及對照組培養(yǎng)后卵母細胞GVBD率及第一極體排出率情況比較 見表2。

表2 各組紫草素培養(yǎng)液及對照組培養(yǎng)后 卵母細胞GVBD率及第一極體排出率情況比較 ±s

與對照組比較，*P<0.05

由表2可見，20、50 μg/mL紫草素組卵母細胞GVBD率及第一極體排出率均為0，說明這2個濃度的紫草素對卵母細胞的發(fā)育成熟起到了絕對抑制作用，對卵母細胞具有細胞毒性。5 μg/mL紫草素組卵母細胞GVBD率及第一極體排出率與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明5 μg/mL紫草素對卵母細胞無明顯抑制作用。10 μg/mL紫草素組卵母細胞的GVBD率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但第一極體排出率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明10 μg/mL紫草素對卵母細胞第一極體排出情況有明顯抑制作用。如圖1所示，對照組卵母細胞排出第一極體，10 μg/mL紫草素組未排出第一極體，且細胞質與透明帶之間的卵周隙變大。

對照組 10 μg/mL紫草素組

圖1 對照組和10 μg/mL紫草素組第一極體排出情況

2.3 10 μg/mL紫草素組及對照組卵母細胞的紡錘體形態(tài)觀察 收集10 μg/mL紫草素組及對照組卵母細胞在顯微鏡下進行觀察，對照組僅有少量卵母細胞出現(xiàn)異常紡錘體形態(tài)，10 μg/mL紫草素組則出現(xiàn)大量卵母細胞異常紡錘體形態(tài)，紡錘體呈現(xiàn)無極、散極或者多極等異?，F(xiàn)象。說明10 μg/mL紫草素可干擾卵母細胞分裂過程中紡錘體的形成，從而影響卵母細胞發(fā)育成熟。見表3、圖2。

組 別n正常紡錘體率異常紡錘體率對照組380.38±9.2519.62±9.2510μg/mL紫草素組319.00±5.69*80.99±5.69*

與對照組比較，*P<0.05

染色體 紡錘體 染色體與紡綞體合并后

A：對照組正常形態(tài)的紡錘體呈梭形；B：10 μg/mL紫草素組異常紡錘體形態(tài)呈多極形態(tài)；C：10 μg/mL紫草素組異常紡錘體形態(tài)呈解聚狀態(tài)

圖2 10 μg/mL紫草素組及對照組紡錘體形態(tài)情況比較

由表3可見，10 μg/mL紫草素組正常紡錘體率及異常紡錘體率與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

哺乳動物的糖代謝過程是葡萄糖首先生成丙酮酸，然后再通過氧化磷酸化過程，線粒體利用丙酮酸和氧氣(O2)通過丙酮酸脫氫酶催化形成乙酰輔酶A及CO2，乙酰輔酶A再參與三羧酸循環(huán)，最終以生成36個三磷酸腺苷(ATP)的形式產(chǎn)生能量。而有氧糖酵解是在有O2環(huán)境下，細胞大量攝取葡萄糖，然后經(jīng)過一系列酶的催化生成磷酸烯醇式丙酮酸，然后再在一系列丙酮酸激酶(PK)催化下生成丙酮酸，但所產(chǎn)生的丙酮酸并不經(jīng)過氧化磷酸化，而是在細胞質中酵解形成大量乳酸并只產(chǎn)生2個ATP，這種現(xiàn)象又稱之為Warburg效應。有研究發(fā)現(xiàn)，不僅在腫瘤細胞中存在這種現(xiàn)象，在哺乳動物生殖細胞發(fā)育過程中也存在類似Warburg效應的現(xiàn)象[6-9]。實驗研究表明，原生殖細胞(PGC)優(yōu)先氧化丙酮酸而不是葡萄糖，除此以外原始卵泡氧化產(chǎn)物是乳酸，并且消耗的丙酮酸是葡萄糖的2倍多，說明在這個階段同時存在著有氧糖酵解和線粒體丙酮酸的氧化，而且丙酮酸可能是主要的能量基質[10]。

紫草屬于紫草科多年生草本植物，是中國傳統(tǒng)中草藥之一，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有涼血活血、解毒透疹等功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，紫草具有抗菌、抗變態(tài)反應、抗腫瘤、解熱、止血、降血糖等作用[11]。紫草素是從紫草根中提取的一種萘醌類化合物，對多種腫瘤，如小鼠腹水型肉瘤S180、子宮頸瘤U14、自發(fā)性乳腺腫瘤等具有抑制作用[12]，還可誘導大腸癌CCL229細胞凋亡，且不同濃度的紫草素作用后CCL229細胞均具有明顯的凋亡特征[13]。實驗研究表明，PKM2是細胞糖酵解途徑中的最后一個酶，也是一個重要的限速酶，并且還是腫瘤細胞中有氧糖酵解途徑的關鍵酶，紫草素和它的類似物對腫瘤細胞的PKM2有專一性抑制作用，可在腫瘤細胞表達PKM2時有效抑制細胞糖酵解流，從而抑制腫瘤生長[14]。

本實驗將卵母細胞放入含有不同濃度紫草素的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)觀察，考慮到紫草素進入卵母細胞作用可能需要時間，所以我們采取了2種方法，一種是加入IBMX的培養(yǎng)液，先靜置12 h后洗脫IBMX進行培養(yǎng)[15]，另一種是直接放入含有不同濃度紫草素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2種不同實驗方法的結果共同得出5 μg/mL紫草素對卵母細胞的發(fā)育成熟無影響，而20、50 μg/mL紫草素可對卵母細胞產(chǎn)生絕對抑制作用，10 μg/mL濃度的紫草素對卵母細胞發(fā)育成熟有很大影響，2種方法的橫向比較結果一致，因此我們選擇了10 μg/mL紫草素組卵母細胞進行下一步研究。觀察結果顯示，10 μg/mL紫草素組卵母細胞發(fā)育停滯在了MI前期或者MI期，卵母細胞的第一極體排出也被干擾，第一極體排出率比較低下，并且紡錘體形態(tài)紊亂，組裝未完成，紡錘體呈現(xiàn)無極、散極或者多極等異?，F(xiàn)象。紡錘體的形成和卵母細胞第一極體排出都需要能量，且卵母細胞發(fā)育的能量大部分來自有氧糖酵解，PKM2是有氧糖酵解的關鍵酶，而紫草素對PKM2有專一性抑制作用，因此我們猜測紫草素對卵母細胞發(fā)育成熟的抑制作用是因為能量代謝過程被破壞而導致。

綜上所述，高濃度的紫草素對卵母細胞發(fā)育成熟具有明顯抑制作用，其作用機制可能與紫草素抑制卵母細胞能量代謝有關。將來可進一步研究紫草素對卵母細胞發(fā)育成熟的影響，探索在紫草素抑制作用下卵母細胞的其他能量代謝途徑，從而有助于揭示在生殖過程中母體和胎兒的能量代謝需求，對與代謝紊亂有關生殖疾病的研究及防治具有重要意義。

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(本文編輯：石 康)

Effects of shikonin on the maturation of mouse oocytes

TENGFei*,JIANGGuangjian.

*2014-GradeMasterofBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100029

Objective To observe the effect of shikonin on the maturation of mouse oocytes, and investigate its mechanism. Methods The immature oocytes of GV stage from 6 to 8 weeks old ICR female mice were put in four groups of shikonin nutrient solution that concentration was 5μg/mL, 10μg/mL, 20μg/mL and 50 μg/mL respectively. In addition, there were other four groups that shikonin nutrient solution contained 3-isobutyl 1-methyl xanthine (IBMX) inhibitor, and the nutrient solution with no shikonin was treated as control group. The oocytes were directly cultured in four groups that merely contained shikonin and the control group. The shikonin nutrient solution containing IBMX inhibitor was set aside 12 h and then eluted with IBMX, finally the oocytes were cultured. The rate of germinal vesicle breaking down (GVBD) after culturing 2 h was evaluated, and the first polar body discharge rate after culturing 12 h were evaluated. The effects of shikonin on oocytes spindle and the discharge of first polar body were observed.Results The concentration of 20μg/mL and 50 μg/mL of shikonin had an absolute inhibitory effect on the maturation of oocytes, and the rates of GVBD and the first polar body discharge were all zero. The concentration of 5μg/mL of shikonin had no obvious inhibitory effect on oocytes. The first polar body discharge in control group was normal, and only a few oocytes appeared abnormal spindle. The first polar body discharge in 10μg/mL shikonin group was restrained, and a large number of oocytes appeared abnormal spindle, and the spindle presents the anomalies such as the non-polar, sporadic polar, or multi-polar. Conclusion The high concentration of shikonin has an obviously inhibitory effect on the maturation of oocytes, can affect the formation of spindle and the first polar body discharge, its mechanism can be linked to the inhibition of shikonin on the energy metabolism of oocytes.

Shikonin; Oocyte; Animal; Experiment; Mice

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.05.024

※ 項目來源：北京中醫(yī)藥大學自主選題資助項目(編號：2016-JYB-XS029)

滕菲(1989—)，女，碩士研究生在讀，學士。研究方向：受精生殖學。

R285.5；R714.13

A

1002-2619(2017)05-0739-05

2017-01-16)

1 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院糖尿病研究中心，北京 100029