張 鑫 張晞文 丁 俊 孫學(xué)華 李 曼 周振華 高亞婷 金樹根 高月求

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院細(xì)胞免疫實驗室，上海 201203)

實 驗 研 究

靈貓方及其單味藥醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原表達(dá)的影響※

張 鑫 張晞文1丁 俊1孫學(xué)華2李 曼 周振華 高亞婷 金樹根 高月求△

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院細(xì)胞免疫實驗室，上海 201203)

目的 研究靈貓方及其單味藥(牡丹皮、青皮、胡黃連、貓人參、淫羊藿、貓爪草、生黃芪)醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表達(dá)的影響。方法 制備靈貓方及其7種單味藥的醇提物，分別配制成50、100、200、400 μg/mL 4個濃度，作用于HepG2.2.15細(xì)胞72 h，四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法檢測藥物的細(xì)胞毒性；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg水平。結(jié)果 靈貓方醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg的分泌有抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的遞增而增加(P<0.05)。牡丹皮醇提物、青皮醇提物、胡黃連醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的分泌有抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的遞增而增加(P<0.05)。貓人參醇提物、淫羊藿醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg的分泌有抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的遞增而增加(P<0.05)。結(jié)論 靈貓方醇提取物及組分的牡丹皮、青皮、胡黃連、貓人參、淫羊藿醇提取物能抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的表達(dá)。

胞質(zhì)，代謝；肝炎e抗原，乙型；肝炎表面抗原，乙型；靈貓方

乙型肝炎病毒(HBV)感染是導(dǎo)致急慢性乙型肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌的主要病因[1]，全球約有20億人曾感染HBV，其中慢性HBV感染者有2.4億[2]。目前抗HBV的西藥主要有干擾素、核苷類藥物如拉米夫定、恩替卡韋等，但治療效果均不理想，且有一定的副作用，價格昂貴[3]。大量臨床和實驗研究證實中醫(yī)藥具有抗HBV療效[4-5]，靈貓方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科治療慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB，以下簡稱乙肝)的有效驗方，長期臨床研究證實靈貓方具有保肝降酶、抗病毒作用[6-7]。我們通過體外實驗，研究靈貓方及其組方中7種單味藥的醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表達(dá)的影響，以期明確靈貓方抗HBV的有效成分。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 HepG2.2.15細(xì)胞由上海市公共衛(wèi)生臨床中心惠贈。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Trypsin)和胎牛血清(FBS)購自Life Technologies公司，四甲基噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma-Aldrich公司，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上?？迫A生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗藥物 靈貓方藥物組成：牡丹皮、青皮、胡黃連、貓人參、淫羊藿、貓爪草、生黃芪，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房提供。靈貓方和單味藥的醇提物由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所制備。醇提物溶于0.5% DMSO后加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)液混勻、過濾，配制成50、100、200、400 μg/mL 4種濃度的含藥培養(yǎng)液。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2.2.15細(xì)胞以3.0×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔200 μL含10% FBS

的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別換4種濃度的含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，同時設(shè)置無藥物細(xì)胞對照組，收集上清和細(xì)胞作后續(xù)實驗。

1.5 MTT法檢測藥物的細(xì)胞毒性 96孔板中每孔加入DMEM培養(yǎng)液90 μL和MTT溶液10 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h，去上清，加入DMSO 150 μL后震蕩10 min，自動酶標(biāo)儀(570 nm波長)讀取每孔的吸光度(OD值)，藥物對細(xì)胞生長的抑制率(%)=(OD值對照組-OD值實驗組)/OD值對照組×100%。按Reed-Muench法計算半數(shù)細(xì)胞毒濃度(TC50)[8-9]。TC50=Antilog[logB+(50-<50%抑制率)/(>50%抑制率-<50%抑制率)×C](注：B=<50%時的藥物濃度，C=log稀釋倍數(shù))。

1.6 ELISA法檢測藥物對HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制作用 按照ELISA試劑盒說明書檢測每孔HBsAg和HBeAg的OD值。藥物對HBsAg和HBeAg的抑制率=(OD值對照組-OD值實驗組)/OD值對照組×100%。按Reed-Muench法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)和治療指數(shù)(TI)[8-9]。IC50=Antilog[logB+(50-<50%抑制率)/(>50%抑制率-<50%抑制率)×C](注：B=<50%時的藥物濃度，C=log稀釋倍數(shù))；TI=TC50/IC50，TI>2為藥物有效低毒，1

2 結(jié) 果

2.1 靈貓方醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響 見表1。

表1 靈貓方醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響

與靈貓方醇提物50 μg/mL比較，*P<0.05；與靈貓方醇提物100 μg/mL比較，△P<0.05；與靈貓方醇提物200 μg/mL比較，#P<0.05

由表1可見，靈貓方醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞的TC50為2 551.77 μg/mL，對HBsAg和HBeAg表達(dá)抑制作用的IC50分別為188.80、48.30 μg/mL，TI分別為13.5、52.8，靈貓方醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg的分泌有抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的遞增而增加(P<0.05)。對HepG2.2.15細(xì)胞HBeAg的分泌無抑制作用(P>0.05)。

2.2 牡丹皮醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響 見表2。

表2 牡丹皮醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響

與牡丹皮醇提物50 μg/mL比較，*P<0.05；與牡丹皮醇提物100 μg/mL比較，△P<0.05；與牡丹皮醇提物200 μg/mL比較，#P<0.05

由表2可見，牡丹皮醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞的TC50為456.26 μg/mL，對HBsAg和HBeAg表達(dá)抑制作用的IC50分別為291.88、119.94 μg/mL，TI分別為1.560、3.802，牡丹皮醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的分泌有抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的遞增而增加(P<0.05)。2.3 青皮醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響 見表3。

表3 青皮醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響

與青皮醇提物50 μg/mL比較，*P<0.05；與青皮醇提物100 μg/mL比較，△P<0.05；與青皮醇提物200 μg/mL比較，#P<0.05

由表3可見，青皮醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞的TC50為1 744.17 μg/mL，對HBsAg和HBeAg表達(dá)抑制作用的IC50分別為181.53、278.03 μg/mL，TI分別為9.6、6.3，青皮醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的分泌有抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的遞增而增加(P<0.05)。2.4 胡黃連醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響 見表4。

表4 胡黃連醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響

與胡黃連醇提物50 μg/mL比較，*P<0.05；與胡黃連醇提物100 μg/mL比較，△P<0.05；與胡黃連醇提物200 μg/mL比較，#P<0.05

由表4可見，胡黃連醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞的TC50為823.53 μg/mL，對HBsAg和 HBeAg表達(dá)抑制作用的IC50分別為286.29、384.32 μg/mL，TI分別為2.88、2.14，胡黃連醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的分泌有抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的遞增而增加(P<0.05)。2.5 貓人參醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響 見表5。

由表5可見，貓人參醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞的TC50為398.64 μg/mL，對HBsAg表達(dá)抑制作用的IC50為140.90 μg/mL，TI為2.829，貓人參醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg的分泌有抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的遞增而增加(P<0.05)。對HepG2.2.15細(xì)胞HBeAg的分泌無抑制作用(P>0.05)。

表5 貓人參醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響

與貓人參醇提物50 μg/mL比較，*P<0.05；與貓人參醇提物100 μg/mL比較，△P<0.05；與貓人參醇提物200 μg/mL比較，#P<0.05；NA表示對HBeAg抑制率<50%，IC50未計算

2.6 淫羊藿醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響 見表6。

表6 淫羊藿醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響

與淫羊藿醇提物50 μg/mL比較，*P<0.05；與淫羊藿醇提物100 μg/mL比較，△P<0.05；與淫羊藿醇提物200μg/mL比較，#P<0.05；NA表示對HBeAg抑制率<50%，IC50未計算

由表6可見，淫羊藿醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞的TC50為518.71 μg/mL，對HBsAg表達(dá)抑制作用的IC50為176.77 μg/mL，TI為2.93，淫羊藿醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg的分泌有抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的遞增而增加(P<0.05)。對HBeAg的分泌無抑制作用(P>0.05)。

2.7 貓爪草醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響 見表7。

表7 貓爪草醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響

NA表示對HBsAg和HBeAg抑制率<50%，TC50和IC50未計算

由表7可見，貓爪草醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的抑制率<50%，提示其對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)無影響。

2.8 生黃芪醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響 見表8。

表8 生黃芪醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響

NA表示對HBsAg和HBeAg抑制率<50%，TC50和IC50未計算

由表8可見，生黃芪醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的抑制率<50%，提示其對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)無影響。

3 討 論

乙肝屬中醫(yī)學(xué)脅痛、黃疸、癥積、鼓脹等疾病范疇，主要病因是濕熱或疫毒內(nèi)感，而正氣不足則為發(fā)病的內(nèi)在條件。飲食不節(jié)(潔)、情志不和是本病的誘發(fā)因素。濕熱疫毒，曠日持久，窮必及腎，表現(xiàn)為腎氣虧損，濕熱未盡。我們通過長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)乙肝患者常見神疲乏力、頭暈耳鳴、腰膝痠軟、兩脅隱痛、兩目干澀、月經(jīng)不調(diào)、陽萎遺精等肝腎不足癥狀，以及口干口苦、舌苔黃膩等濕熱內(nèi)蘊癥狀，首次提出以補腎為主、清化為輔的治療原則，并結(jié)合現(xiàn)代藥理研究和臨床實踐，創(chuàng)建了由貓爪草、貓人參、淫羊藿、牡丹皮、黃芪、胡黃連、青皮組成的靈貓方用于治療乙肝[6-7]。貓爪草、貓人參皆入肝經(jīng)，清肝瀉火解毒，兩藥合用更增強清熱解毒之功[10-11]；淫羊藿溫腎壯陽[12]；青皮獨入肝經(jīng)，疏肝理氣；牡丹皮清熱涼血，活血解毒[13]；黃芪補中益氣，利尿脫毒[14]；胡黃連清熱燥濕解毒，利膽退黃[15]。本方補腎同時又充實肝體，改善肝脾之功，清熱利濕。全方配伍精當(dāng)，溫而不燥，補而不滯，相輔相成，標(biāo)本同治。

HepG2.2.15細(xì)胞模型是國內(nèi)外公認(rèn)和常用的體外評價抗HBV藥物的細(xì)胞模型，能穩(wěn)定持續(xù)分泌HBsAg、HBeAg。前期研究發(fā)現(xiàn)靈貓方藥物血清能抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg分泌[16]，但具體的有效單味藥不明。因此，本研究提取靈貓方全方醇提物和該方各單味藥醇提物，觀察不同濃度的醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞毒性及對HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈貓方及其單味藥(牡丹皮、青皮、胡黃連、貓人參、淫羊藿)醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，且在此濃度下能抑制HBsAg和HBeAg表達(dá)，特別是靈貓方醇提物及牡丹皮、青皮和胡黃連醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)具有明顯抑制作用，其治療指數(shù)均>2，有效低毒，抑制率均隨著藥物濃度的增加而增加；貓人參和淫羊藿醇提物能抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg表達(dá)，其治療指數(shù)均>2，有效低毒，且抑制率均隨著藥物濃度的增加而增加，但對HBeAg表達(dá)無抑制作用；貓爪草和生黃芪醇提物對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg均無明顯抑制作用。

本研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)靈貓方及其單味藥(牡丹皮、青皮、胡黃連、貓人參、淫羊藿)醇提物能抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的表達(dá)，進(jìn)一步在體外證實了靈貓方的抗病毒作用，并初步明確靈貓方中牡丹皮、青皮、胡黃連、貓人參、淫羊藿具有抗HBV的作用。由于該體外研究不能反映機體內(nèi)在所特有的免疫調(diào)節(jié)和體內(nèi)代謝對藥物的影響，因此需要通過體內(nèi)實驗作進(jìn)一步驗證，以篩選出有效藥物和成分，探索其作用機制。

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(本文編輯：習(xí) 沙)

Effects of Lingmao recipe and its single herb alcohol extract on the expression of hepatitis B surface antigen and e antigen in HepG2.2.15 cells

ZHANGXin*,ZHANGXiwen,DINGJun,etal.

*LaboratoryofCellularImmunity,ShuguangHospitalAffiliatedofShanghaiTraditionalChineseMedicineUniversity,Shanghai201203

Objective To study the effects of Lingmao recipe and its single herb alcohol extract (Cortex moutan, Green husk, Hu rhizoma coptidis, Cat ginseng, Epimedium, Catclaw buttercup root andAstragalus root) on hepatitis B surface antigen (HBsAg) and e antigen (HBeAg) in HepG2.2.15 cells. Methods Lingmao recipe and seven single herb alcohol extract were prepared, made into different concentration of 50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 mg/mL and 400 mg/mL 4, on the HepG2.2.15 cells for 72 hrespectively.The cytotoxicity of drugs were tested by methylthiazol tetraztlium (MTT) method. The levels of HBsAg and HBeAg were tested by ELISA in supernatant of HepG2.2.15 cells.Results The alcohol extract of Lingmao recipehad inhibitory effect on the secretion of HBsAg in HepG2.2.15 cells, and the inhibitory rate increased with increasing drug concentrations (P<0.05). The alcohol extracts of Cortex moutan, Green husk and Hu rhizoma coptidis had inhibitory effecton the secretion of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells, and inhibition rate increased with increasing drug concentrations (P<0.05). The alcohol extracts of Cat ginseng and Epimedium had inhibitory effecton the secretion of HBsAg in HepG2.2.15 cells, and inhibition rate increased with increasing drug concentrations (P<0.05).Conclusion The alcohol extracts of Lingmao recipe and its components of Cortex moutan, Green husk, Hu rhizoma coptidis, Cat ginseng and Epimedium can inhibit the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells.

Cytoplasm; Metabolism; HBeAg; Hepatitis B; HBsAg; Lingmao recipe

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.05.022

※ 項目來源：國家自然科學(xué)基金委員會資助項目(編號：81473477,81473629,81403351,81503545)；艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(編號：2012ZX10005004-002)；上海市科委科技支撐項目(16401970600)；上海市進(jìn)一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃(2014—2016年)項目(編號：ZY3-LCPT-1-1001,ZY3-CCCX-3-3027)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計劃項目(編號：15YF1412300)；上海中醫(yī)藥大學(xué)預(yù)算內(nèi)項目(自然科學(xué)類)(編號：2014YSN39)；上海申康醫(yī)院發(fā)展中心臨床科技創(chuàng)新項目(編號：SHDC12016121)

張鑫(1984—)，女，助理研究員，博士。從事慢性乙型病毒性肝炎免疫機制和中藥干預(yù)研究。

R373.21；R394.114

A

1002-2619(2017)05-0729-06

2016-11-22)

△ 通訊作者：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院細(xì)胞免疫實驗室，上海 201203

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院胰膽外科，上海 2012032 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科，上海 201203