武果桃，牛國慶，牛琛，任杰，孟冬霞，趙娟，衛(wèi)順生

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030032；2.太原市小店區(qū)畜禽繁育工作站，太原 030032；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030）

直接提取病原菌DNA檢測奶牛隱性乳房炎試驗

武果桃1，牛國慶2，牛琛3，任杰1，孟冬霞1，趙娟1，衛(wèi)順生1

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030032；2.太原市小店區(qū)畜禽繁育工作站，太原 030032；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030）

為研究奶牛隱性乳房炎主要致病菌的快速檢測方法，本試驗選取山西省太原市小店區(qū)某規(guī)?；膛?9頭隱性乳房炎患牛，利用Chelex-100方法直接提取奶樣金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及停乳鏈球菌DNA進行檢測。結(jié)果表明，利用Chelex-100方法直接提取奶樣中病原菌DNA檢測奶牛隱性乳房炎，具有簡單、快速、經(jīng)濟、無污染、PCR敏感性高等優(yōu)點，對PCR快速檢測奶牛隱性乳房炎具有重要意義。

Chelex-100；病原菌；奶牛；隱性乳房炎；DNA

目前，乳房炎仍然是影響奶牛生產(chǎn)效益的主要因素之一[1]，不僅降低奶牛生產(chǎn)性能，嚴(yán)重時還會導(dǎo)致奶牛淘汰。據(jù)報道，國內(nèi)奶牛乳房炎的發(fā)病率為20%～70%，每年造成的直接經(jīng)濟損失超過21億人民幣[2]。相對于臨床型乳房炎，奶牛隱性乳房炎流行面廣，發(fā)病頭數(shù)為臨床型乳房炎的15～40倍，約占乳房炎發(fā)病頭數(shù)的90%[3～5]，不但引起產(chǎn)奶量降低4%～10%，還影響乳品質(zhì)量及奶牛繁殖[6,7]。奶牛隱性乳房炎因無明顯臨床癥狀而容易被忽視，如不積極采取措施則易轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型乳房炎。引起奶牛乳房炎的病原微生物主要是金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌、化膿性棒狀桿菌等。葡萄球菌和鏈球菌是引起奶牛隱性乳房炎的主要病原菌，約占乳房炎病原菌總數(shù)的90%以上。奶牛乳房炎病原菌所占的比例依次為停乳鏈球菌(40.91%)、金黃色葡萄球菌(27.28%)、無乳鏈球菌(13.64%)、乳房鏈球菌(9.09%)。大腸埃希菌 (9.09%)，此外，支原體、病毒等也可引起奶牛隱性乳房炎[8,9]。

目前，檢測奶牛乳房炎致病菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，但該方法費時、費力，需要72h甚至更長時間[10]。本試驗采用Chelex-100法直接從乳房炎患牛的乳汁中提取病原菌DNA并進行PCR擴增，檢測金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌，以探求一種快速、高效的檢測奶牛隱性乳房炎病原菌的方法。

1 材料與方法

1．1 奶樣采集

2015年9月，在太原市小店區(qū)某規(guī)模奶牛場挑選39頭隱性乳房炎患牛（CMT檢測），每頭患牛無菌采集奶樣10mL，4℃條件下，及時送測試中心用于病原微生物檢測。

1．2 試劑及儀器

試劑：D N A提取試劑盒E S溶液、P B S緩沖液、溶葡球菌酶、Chelex-100；引物、Pfu DNA Polymerase 高溫聚合酶、MgCl2（25mmol/L）、10×PCR Buffer(無 Mg2+：100mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，25℃；500mmol/L KCl，0.8%(v/v)Nonidet、dNTP（10mmol/L）、6×DNA Loading Dye、DNA marker、10×TAE（400mmol/L Tris-acetate and 10mmol/L EDTA，pH8.0）、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、無水乙醇、異丙醇、丙三醇，均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

儀器：美國Verity 96well PCR儀、英國Syngene Gene Genius ABI凝膠成像儀、美國 ABI3730XL測序儀。

1．3 試驗設(shè)計

1.3.1 奶樣DNA提取

Chelex-100法：取奶樣0.8mL加入到0.4mL ES溶液[0.5mol/L EDTA（pH 7.5）、0.2%SDS]中，混勻，37℃靜置10min；12 000r/min離心10min，棄上清；加入1mL PBS緩沖液（137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、10mmol/L Na2HPO4、2mmol/L KH2PO4，pH 7.4），振蕩搖勻，10 000r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)1次；加入25μL以滅菌超純水配制的0.02mg/mL溶葡球菌酶，置于37℃ 30 min；加入175μL以滅菌超純水配制的10% Chelex-100，劇烈振蕩5～10s，置于100℃沸水中10min；劇烈振蕩5～10s，12 000r/min離心5min，上清液用于PCR擴增。

1.3.2 引物設(shè)計與合成

參照文獻[11]設(shè)計金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌的擴增引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息詳見表1。

表1 引物信息

1.3.3 PCR擴增及產(chǎn)物測序

細(xì)菌DNA提取在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所進行，PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

50μLPCR反應(yīng)體系：模板1μL、上下游引物各1μL、dNTP（10mmol/L）1μL、Taq Buffer 5μL、25mmol/L Mgcl25μL、Taq酶（5U/μL）0.5μL、去離子水35.5μL。

PCR擴增條件：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s；55～60℃退火35s，72℃延伸40～50s，35個循環(huán)；72℃延伸5～8min。

2 結(jié)果與分析

2．1 PCR電泳結(jié)果

圖1 不同致病菌DNA的PCR電泳結(jié)果注：（1）A為金黃色葡萄球菌，B為大腸桿菌，C為無乳鏈球菌；（2）B、C中樣品編號18～39因無目的條帶而未列出。

由圖1可知，39份奶樣中，33份樣品檢測出金黃色葡萄球菌；14份樣品檢測出大腸桿菌；1份樣品檢測出無乳鏈球菌。數(shù)據(jù)表明，該牛場隱性乳房炎患牛的奶樣中，以金黃色葡萄球菌檢出率為最高，其次為大腸桿菌、無乳鏈球菌，30%～36%的奶樣存在多重感染。

2．2 測序結(jié)果

將上述3種病原菌的PCR產(chǎn)物進行測序，并與GenBank收錄的序列進行比對，其同源性在99.5%以上，證明PCR擴增的各基因片段為相應(yīng)的目的基因片段。

3 討論

隱性乳房炎會降低乳腺腺泡腔的容積和產(chǎn)奶量，從而影響終生產(chǎn)奶量[12,13]，但因不表現(xiàn)臨床癥狀，在生產(chǎn)中極易被忽視。隱性乳房炎若沒有得到較好的處理，則很容易發(fā)展成臨床型乳房炎，增加淘汰幾率[14,15]。

Chelex-100是一種弱陽離子螯合樹脂，可用于從微量精斑、血痕、毛發(fā)、口腔拭子等中提取DNA，常用于法醫(yī)的PCR鑒定[16,17]。在臨床獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，針對目前我國奶牛隱性乳房炎的高發(fā)病率和診斷技術(shù)相對落后的現(xiàn)狀，根據(jù)Chelex-100法可直接快速提取病原菌DNA的特點，本試驗直接提取奶樣中病原菌DNA進行奶牛隱性乳房炎檢測，結(jié)果表明，該方法是完全可行的，而且簡單快速，不需要有機溶劑，全程僅需2.5h，非常適合大量奶樣DNA的提取檢測。

[1] 李甡屾,鄒天紅,于忠強,等． 奶牛DHI測定指標(biāo)與其產(chǎn)奶量的灰色關(guān)聯(lián)分析[J]．中國奶牛, 2010,8:32-34．

[2] 郭昌明,張乃生,周昌芳,等． 髓過氧化物酶檢測奶牛隱性乳房炎研究進展[J]．動物醫(yī)學(xué)進展, 2006,27(6): 54-57．

[3] Graaf T, Dwing R H． Estimation of milk production losses due to sub-clinical mastitis in dairy cattle in Costa Rica[J]．Preventive veterinary medicine, 1996,26(3):215-222．

[4] Degraves F J,Fettow F．Economics of mastitis and mastitis control[J]． The veterinary clinics of North America:Update on Bovine Mastitis, 1993,9:421-434．

[5] Schrick F N,Hockett M E,Saxton A M,et al．Influence of subclinical mastitis During early lactation one productive parameters[J]．J Dairy Sci, 2011,84:1407-1412．

[6] 李波,孔保華,鄭東海,等． 體細(xì)胞數(shù)對乳的影響及其控制措施[J]．中國乳品工業(yè), 2005,33(1):57-59．

[7] 李建斌,孫紹華,田雨澤． 中國荷斯坦牛乳中體細(xì)胞數(shù)變化規(guī)律的研究[J]．家畜生態(tài)學(xué)報, 2006,27(3):79-80．

[8] Per Sieseaard．體細(xì)胞檢測—控制乳腺炎和提高乳品質(zhì)量的方法[J]．乳業(yè)科學(xué)與技術(shù), 2002,3:32-34．

[9] Zagaevskii I S,Iakubchak O N． Microbiological,Physicochemical and cytologic indices of milk in cows with latent (subclinical) mastitis[J]． Vopr Pitan 1991,Jul-Aug (4):63-67．

[10] Riffon R,Sayasith K,Khalil H,et al．Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR[J]． Journal of Clinical Microbiology, 2001,39(7):2584-2589．

[11] 許金明,郝永清． Chelex-100法直接提取乳樣中奶牛乳房炎主要致病菌DNA方法的建立[J]． 中國畜牧獸醫(yī), 2014,41(11):25-29．

[12] Barkema H W,Schukken Y H,Lamtj G M,et al．Management practices associated with low,medium,and high somatic cell counts in bulk milk[J]．J Dairy Sci, 1998,81:1917-1927．

[13] Barkema H W,Deluyker H, Schukken Y H, et al．Quarter milk somatic ell count at calving and at the first six milkings after calving[J]．Prev Vet Med, 1999,38:1-9．

[14] Devliegher S,Barkema H W,Stryhn H,et al．Impact of early lactation somatic ell count in heifers on milk yield over the first lactation[J]． J Dairy Sci, 2005,88:938-947．

[15] Devliegher S, Barkema H W, Opsomer G,et al．Association between somatic ell count in early lactation culling Dairy heifers using Cox frilty models[J]． J Dairy Sci, 2005,88: 560-568．

[16] 周月琴,朱偉,劉志萍,等．用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA[J]．復(fù)旦學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）, 2003,30(4):379-380．

[17] Walsh P S,Metzger D A,Higushi R． Chelex-100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic materia[J]．Bio Techniques, 2013,54(3):134-139．

Study on Direct Extraction of Pathogenic Bacteria DNA to Detect Cows Recessive Mastitis

WU Guo-tao1, NIU Guo-qing2, NIU Chen3, REN Jie1, MENG Dong-xia1, ZHAO Juan1, WEI Shun-Sheng1
(1.Animal Husbandry and Veterinary Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030032; 2.Xiaodian Livestock and Poultry Breeding Station, Taiyuan 030032; 3.Northeast Agricultural University, Harbin 150030)

In order to develop a rapid detection method of the main pathogenic bacteria for cows recessive mastitis, totally, 39 recessive mastitis cows in a large-scale dairy farm of Taiyuan, Shanxi Province were selected in this study, the Chelex-100 method was used to directly extract DNA from milk sample to detect staphylococcus aureus, Escherichia coli and Stop milk streptococcal. Results showed that samples from the milk of pathogenic microorganisms was given priority to with Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The method using Chelex-100 for pathogenic bacteria DNA in directly extracted from milk sample was simple, rapid, economic, pollution-free and with high PCR sensitivity, recessive mastitis cows for PCR rapid detection of pathogenic bacteria was of great significance.

Chelex-100; Pathogenic bacteria; Cows; Recessive mastitis; DNA

S858.23

A

1004-4264（2017）05-0029-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.008

2016-08-16

山西省科技攻關(guān)項目（201603D221021-2）；山西省農(nóng)科院重點攻關(guān)項目（YZD1411）。

武果桃（1967-），漢族，山西太谷人，副研究員，主要從事中獸藥防治動物疾病的工作。

牛國慶。