傅 濤，王麗梅，趙振虎，善亞軍，柳曉蘭，從玉文

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宮血寧膠囊引起大鼠子宮平滑肌收縮及其初步影響機(jī)制研究

傅 濤1，王麗梅2，趙振虎2，善亞軍2，柳曉蘭2，從玉文2

目的 初步了解宮血寧縮宮膠囊作用的影響機(jī)制，為合理應(yīng)用宮血寧膠囊治療婦科出血癥提供理論指導(dǎo)。方法 Wistar大鼠隨機(jī)分為宮血寧對(duì)照組和宮血寧加相應(yīng)對(duì)比藥物組，共9組，每組10只。應(yīng)用離體子宮張力測(cè)定法，測(cè)定各組大鼠離體子宮平滑肌收縮活性。結(jié)果 0.001 μg/ml腎上腺素可完全抑制50 μg/ml宮血寧引起的大鼠子宮平滑肌收縮，而腎上腺素β1受體拮抗藥阿替洛爾和美托洛爾可完全逆轉(zhuǎn)腎上腺素的抑制作用。腎上腺素α受體拮抗藥酚妥拉明雖能抑制α受體激動(dòng)劑甲氧明引起的大鼠子宮平滑肌的收縮，但不能逆轉(zhuǎn)腎上腺素對(duì)宮血寧引起大鼠子宮平滑肌收縮的抑制作用。結(jié)論 宮血寧膠囊引起的大鼠子宮平滑肌收縮的可能影響機(jī)制是通過抑制腎上腺素β受體激活發(fā)揮作用。

宮血寧膠囊；子宮平滑肌收縮；腎上腺素；腎上腺素受體

宮血寧膠囊是由滇重樓總甾體皂苷組成的單方制劑，為國(guó)家中藥保護(hù)品種，具有縮宮止血、消炎鎮(zhèn)痛等功效, 尤其對(duì)子宮功能性出血、大小產(chǎn)后出血、月經(jīng)過多等癥有顯著療效，被國(guó)內(nèi)婦科專家推薦為治療流產(chǎn)后止血的首選中成藥制劑[1, 2]。腎上腺素受體又可分為α和β腎上腺素能受體(α-AR和β-AR)，在子宮發(fā)育不同時(shí)期及懷孕過程中，腎上腺素受體表達(dá)及功能也發(fā)生相應(yīng)的變化[3]。腎上腺素通過激活興奮性α-AR或抑制性β-AR調(diào)節(jié)子宮平滑肌的收縮活性[4]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，宮血寧在體內(nèi)和體外均能引起子宮平滑肌節(jié)律收縮，平滑肌收縮依賴于細(xì)胞外鈣內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣釋放，并受到PLC(磷脂酶C)/IP3(1,4,5-三磷酸肌醇)、PLA2(磷脂酶A2)/AA(花生四烯酸)等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控[5-9]。本研究觀察了宮血寧引起大鼠子宮平滑肌收縮的機(jī)制，以及與腎上腺素受體激活/抑制的關(guān)系，旨在指導(dǎo)臨床上合理應(yīng)用宮血寧膠囊治療不同類型的婦科出血。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備 宮血寧膠囊(云南白藥制藥股份有限公司)，腎上腺素(北京永康制藥廠)，Methoxamine-α受體激動(dòng)劑(SIGMA公司)，高特靈(英國(guó)雅培制藥有限分司)，阿替洛爾(北京益民制藥廠)，美托洛爾(廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所)，酚妥拉明(上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠)。CS502-3C數(shù)字超級(jí)恒溫器(購(gòu)自重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，溫度波動(dòng)度≤±0.5 ℃)；GTS生物信號(hào)傳感器(北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；JZ101型肌肉張力換能器(高碑店市新航機(jī)電設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及分組 Wistar大鼠，雌性，體重230～270 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(醫(yī)動(dòng)字D01-3039)，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。隨機(jī)分為宮血寧對(duì)照組和宮血寧加相應(yīng)對(duì)比藥物組，共9組，每組10只。實(shí)驗(yàn)中使用到的藥品試劑濃度分別為：宮血寧對(duì)照組(50 μg/ml)、腎上腺素(0.001 μg/ml)、阿替洛爾(4 μg/ml)、美托洛爾(4 μg/ml)、甲氧明(20 μg/ml)、高特靈(2 μg/ml，5 μg/ml，10 μg/ml)、酚妥拉明(4 μg/ml)。采用累計(jì)加藥法，宮血寧及其他藥物依次由低濃度加到高濃度，藥物終濃度是指藥物溶于麥?zhǔn)瞎苤?2 ml臺(tái)氏液后的濃度[5, 6]。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 離體子宮肌條制備 Wistar雌性大鼠在實(shí)驗(yàn)前2 d給予己烯雌酚懸濁液腹腔內(nèi)注射0.1 mg/kg一次，造成人工動(dòng)情期。用頸椎脫臼法處死大鼠，剖腹取出子宮，立即置于盛有臺(tái)氏液的玻璃平皿中。小心剝離附于子宮壁上的結(jié)締組織和脂肪組織。將一側(cè)子宮角的兩端分別用線結(jié)扎，轉(zhuǎn)移通入有氧氣、盛有12 ml臺(tái)氏液并已被預(yù)溫至37 ℃的營(yíng)養(yǎng)管中，下端固定，上端與張力傳感器的掛鉤相連。靜息20～30 min，換液2～3次。

1.3.2 大鼠離體子宮平滑肌收縮活性測(cè)定方法 前期研究發(fā)現(xiàn)，宮血寧(25～100 μg/ml)均能引起離體子宮平滑肌節(jié)律收縮，且隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，子宮收縮的張力和頻率均有降低，在給藥后40 min內(nèi)，子宮收縮張力可降到初始效應(yīng)的95%，頻率則降到初始效應(yīng)的90%，據(jù)此，觀察藥物對(duì)宮血寧縮宮作用的影響均在宮血寧給藥后40 min內(nèi)完成[5, 6]。采用GTS生物信號(hào)傳感器生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，利用肌肉張力換能器測(cè)定平滑肌收縮情況。在實(shí)驗(yàn)過程中臺(tái)氏液的工作溫度始終保持在(37±0.5) ℃。營(yíng)養(yǎng)管中持續(xù)通入氧氣，每秒1～2個(gè)氣泡。給予子宮負(fù)荷1 g，待子宮穩(wěn)定后，開始給藥并觀察10 min內(nèi)的波譜變化，由計(jì)算機(jī)記錄并處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 腎上腺素β1受體拮抗藥對(duì)宮血寧引起的子宮平滑肌收縮的影響 如表1所示，宮血寧50 μg/ml可引起離體子宮的節(jié)律收縮，加入腎上腺素0.001 μg/ml可完全抑制宮血寧引起的子宮平滑肌收縮；加入4 μg/ml的阿替洛爾和美托洛爾后，子宮收縮的張力和頻率基本恢復(fù)到初始狀態(tài)，說明宮血寧引起的子宮平滑肌收縮可能與抑制腎上腺素β1受體信號(hào)傳導(dǎo)正相關(guān)。

2.2 腎上腺素α受體激動(dòng)藥/拮抗藥對(duì)宮血寧引起的子宮平滑肌收縮的影響 甲氧明20 μg/ml可引起大鼠離體子宮節(jié)律性收縮，加入高特靈2 μg/ml即能完全拮抗甲氧明的作用，表明激活腎上腺素α受體可引起大鼠離體子宮的節(jié)律收縮。宮血寧50 μg/ml可引起離體大鼠子宮的節(jié)律收縮，加入高特靈至5 μg/ml和10 μg/ml，宮血寧收縮的張力和頻率均沒有明顯降低，說明宮血寧不是通過激活腎上腺素α受體起作用。腎上腺素0.001 μg/ml可完全抑制宮血寧引起的子宮收縮，而酚妥拉明4 μg/ml不能逆轉(zhuǎn)腎上腺素的抑制作用，說明腎上腺素抑制宮血寧引起的子宮平滑肌收縮與腎上腺素α受體激活無關(guān)(表1)。

表1 腎上腺素β1拮抗藥和α受體拮抗藥對(duì)宮血寧引起的大鼠子宮平滑肌收縮的影響 (n=10；

注：與宮血寧對(duì)照組比較，①P<0.05；與甲氧明對(duì)照組比較，②P<0.05

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素本身不能引起子宮節(jié)律收縮，但可抑制宮血寧引起的子宮收縮，加入一定濃度的β受體拮抗藥可基本消除腎上腺素對(duì)子宮收縮的抑制作用，而加入α受體拮抗藥對(duì)子宮收縮沒有影響，說明宮血寧引起的子宮收縮可能與抑制腎上腺素β受體信號(hào)通路有關(guān)。

腎上腺素受體(adrenergic receptor，AR) 為G蛋白偶聯(lián)受體，根據(jù)其對(duì)擬腎上腺素類藥物敏感性的不同及阻斷藥的不同，可分為α-AR和β-AR兩種，其中α-AR分為α1和α2兩種亞型，β-AR可分為β1、β2和β3三種亞型。腎上腺素受體在子宮發(fā)育不同時(shí)期及妊娠不同孕期，其表達(dá)及功能也發(fā)生相應(yīng)的變化[3, 4,11]。妊娠期孕酮占優(yōu)勢(shì)，去甲腎上腺素刺激β-AR和α2-AR，激活腺苷酸環(huán)化酶，通過抑制細(xì)胞內(nèi)鈣升高的通路，引起子宮平滑肌舒張；而在分娩期，雌二醇升高，β-AR脫敏，去甲腎上腺素作用于α2-AR 和α1-AR，抑制腺苷酸環(huán)化酶，激活Gq/PLCγ通路，引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高和子宮平滑肌收縮[3]。配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示，人子宮平滑肌β2-AR占82%，β1-AR占18%，妊娠末期β3-AR表達(dá)增加[12]。三種亞型β-AR均能激活腺苷酸環(huán)化酶，升高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，引起子宮平滑肌舒張[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，β1-AR選擇性拮抗藥阿替洛爾和美托洛爾均能完全逆轉(zhuǎn)腎上腺素對(duì)宮血寧引起子宮平滑肌收縮的抑制作用，說明腎上腺素通過激活β1受體抑制宮血寧引起的子宮平滑肌收縮。下一步研究需評(píng)價(jià)β2-AR和β3-AR在腎上腺素抑制宮血寧引起子宮平滑肌收縮中的作用。

腎上腺素是腎上腺髓質(zhì)分泌的主要激素，當(dāng)人經(jīng)歷某些刺激時(shí)，如興奮、恐懼、緊張、運(yùn)動(dòng)等，體內(nèi)腎上腺素分泌增加[13]。因此，在宮血寧服藥期間，盡量減少這些刺激，以免影響藥物療效。同時(shí)，當(dāng)宮血寧與腎上腺素類或多巴胺類藥物合用時(shí)，應(yīng)考慮藥物之間的相互影響。本研究的成果對(duì)于宮血寧膠囊在婦科出血癥狀中的合理應(yīng)用提供了參考價(jià)值。

[1] 范光升,莊留琪.宮血寧膠囊減少藥物流產(chǎn)后陰道出血的有效性和安全性研究[J].中國(guó)婦幼保健, 2010, 25(35): 5225-5226.

[2] 張勝利, 吳尚純. 宮血寧治療置宮內(nèi)節(jié)育器后異常出血療效的Meta分析 [J]. 中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志, 2010, 18(8): 458-459.

[3] Dupuis M, Lévy A, Mhaouty-Kodja S. Functional coupling of rat myometrial alpha 1-adrenergic receptors to Gh alpha/tissue transglutaminase 2 during pregnancy [J]. J Biol Chem, 2004, 279(18): 19257-19263.

[4] Tanaka Y, Horinouchi T, Koike K. New insights into beta-adrenoceptors in smooth muscle: distribution of receptor subtypes and molecular mechanisms triggering muscle relaxation [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2005,32(7):503-14.

[5] 趙振虎,李建勇,善亞軍,等.宮血寧對(duì)大鼠離體子宮的節(jié)律收縮作用 [J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2004,20(2):93-95.

[6] 趙振虎,李建勇,苑曉玲, 等. 皂苷提取物宮血寧縮宮作用與細(xì)胞外鈣內(nèi)流關(guān)系的研究[J].中國(guó)藥物與臨床, 2005, 5(6): 415-417.

[7] 蘇 佳,劉澤源,趙振虎,等.PLA2 /AA信號(hào)途徑與重樓皂苷誘導(dǎo)大鼠子宮平滑肌收縮活動(dòng)的關(guān)系研究[J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊, 2008, 32(3): 264-268.

[8] Guo L, Su J, Deng B W,etal. Active pharmaceutical ingredients and mechanisms underlying phasic myometrial contractions stimulated with the saponin extract from Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis used for abnormal uterine bleeding [J]. Hum Reprod,2008,23(4):964-971.

[9] Wang L, Jia C, Yu Z,etal. Pennogenin tetraglycoside induces rat myometrial contraction and MLC20 phosphorylation via PLC-IP(3) and RhoA/Rho kinase signaling pathways [J]. PLoS One, 2012, 7(12):e51536.

[10] Martínez M I, EstaL, Morales-Olivas F J,etal. Effect of histamine and histamine analogues on human isolated myometrial strips [J]. Br J Pharmacol, 1992 , 107(2): 528-531.

[11] Darios E S, Seitz B, Watts S W.Smooth muscle pharmacology in the isolated virgin and pregnant rat uterus and cervix [J]. J Pharmacol Exp Ther,2012,341(3):587-596.

[12] Liu Y L, Nwosu U C, Rice P J. Relaxation of isolated human myometrial muscle by beta2-adrenergic receptors but not beta1-adrenergic receptors [J]. Am J Obstet Gynecol, 1998, 179(4): 895-898.

[13] Jovanovic P, Stefanovic B, Spasojevic N,etal. Effects of oxytocin on adreno-medullary catecholamine synthesis, uptake and storage in rats exposed to chronic isolation stress [J]. Endocr Res, 2016, 41(2): 124-131.

(2017-02-13收稿 2017-03-21修回)

(責(zé)任編輯 尤偉杰)

Inhibitory effect of Gongxuening on myometrial contractions and mechanisms

FU Tao1, WANG Limei2, ZHAO Zhenhu2, SHAN Yajun2, LIU Xiaolan2, and CONG Yuwen2.
1.Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Institute of Aviation Medicine of Air Force, Beijing 100089, China; 2. Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China

Objective To investigate the mechanism underlying myometrial contraction stimulated by Gongxuening, and to provide reference for rational use of Gongxuening in the treatment of abnormal uterine bleeding.Methods The contraction of the uterus in vitro induced by Gongxuening in rats was observed using isolated uterine tension measurement, and the influence of such potential factors as epinephrine and its receptor modulators on the contraction was studied.Results It was found that epinephrine at the dose of 0.001μg/ml completely inhibited rat myometrial contractions induced by 50 μg/ml Gongxuening, while β1adrenergic receptor (β1-AR) antagonists atenolol and metoprolol both completely reversed the inhibition by epinephrine. α-AR antagonist phentolamine could not reverse the inhibition by epinephrine during rat myometrial contractions induced by Gongxuening, although it completely inhibited myometrial contractions induced by α-AR agonist methoamine.Conclusions The possible mechanism of rat myometrial contractions induced by Gongxuening may be through inhibition of epinephrine β- AR activation.

Gongxuening; myometrial contractions; epinephrine; adrenergic receptor

國(guó)家自然科學(xué)基金-云南聯(lián)合基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(U1032601)

傅 濤，本科學(xué)歷，副主任醫(yī)師。

1.100089 北京， 空軍航空醫(yī)學(xué)研究所附屬醫(yī)院心內(nèi)科； 2.100850 北京,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所

從玉文，E-mail：congyw@nic.bmi.com

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