曾 智 朱志強 易 鳴

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液質(zhì)聯(lián)用法測定水產(chǎn)品中氯霉素殘留的技術(shù)研究

曾 智 朱志強 易 鳴

氯霉素（Chloroamphenicol，CAP）是一種有效的廣譜抗生素，常用于動物各種傳染性疾病的治療，對多種病原菌有較強的抑制作用，人們經(jīng)常使用氯霉素進行水體消毒和防治漁業(yè)病蟲害，但由于氯霉素對人體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，是多個國家禁止使用的獸用藥物。目前水產(chǎn)品中氯霉素的殘留主要用GB/T20756-2006國家標(biāo)準(zhǔn)進行檢測，本文在此標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化了前處理方法，提高了檢測效率，并且能夠達到規(guī)定的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。具體通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/ MS），多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）和同位素內(nèi)標(biāo)法定量，直接對草魚、鱖魚、對蝦等水產(chǎn)品中的氯霉素進行了檢測。

一、實驗材料

1.儀器

AB QTRAP4500液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（ESI）、勻漿機、離心機、超聲波清洗儀、垂直振蕩器、氮吹儀等。

2.材料

草魚、鱖魚、對蝦等水產(chǎn)品，均采自于養(yǎng)殖場和農(nóng)貿(mào)市場，去皮去骨去內(nèi)臟取可食部分切碎、混勻、冷凍，作為樣品備用。

3.試劑和藥品

甲醇（色譜純）德國Merck（默克）公司；乙酸乙酯（分析純）、正己烷（分析純）、氫氧化銨（25%-28%）（分析純）國藥集團。

表1 梯度洗脫液比例

表2 氯霉素（CAP）和氘代氯霉素（CAP-D5）的質(zhì)譜參數(shù)

4.標(biāo)準(zhǔn)品

氯霉素（CAP）標(biāo)準(zhǔn)品德國Dr公司、氘代氯霉素（CAP-D5）BESTOWN北京振翔科技有限公司。

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

二、實驗儀器方法

1.色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱（1.9μm×2.1mm ×50mm）；柱溫40℃；進樣量10.0μL；流動相乙腈和水，流速0.4mL/min，運行時間6min。

2.質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）；霧化器、碰撞器為氮氣。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

三、實驗步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100.0μg/mL）用甲醇配置，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（40.0ng/mL）用水稀釋；氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液（20.0ng/mL）用水稀釋。

準(zhǔn)確量取一定量的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，用水稀釋成濃度為0.10ng/mL、0.25ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/ mL、3.50ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列使用液，氘代氯霉素的濃度均為1.50ng/mL。

2.樣品前處理

樣品的前處理過程比較重要，直接影響檢測結(jié)果，提取步驟如下：準(zhǔn)確稱量5.00g勻漿樣品，置于50mL離心管中，加入20ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液75.0μL，加入15mL乙酸乙酯，0.4mL氫氧化銨，垂直振蕩1min，4500轉(zhuǎn)離心5min，取上清液至另一50mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并提取液，混勻。取10mL提取液40℃氮吹吹干，加入1.0mL水渦旋，再加入2mL正己烷渦旋30秒，4500轉(zhuǎn)離心5min，棄去上清液，樣液經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾后，待上機分析。

3.樣品加標(biāo)回收率的測定

準(zhǔn)確稱取氯霉素的陰性樣品5.00g，添加濃度為40.0ng/mL的氯霉素使用液12.5μL、62.5μL、87.5μL共3組，加入濃度為20.0ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液75.0μL，每組5個平行樣。

表4 氯霉素的添加濃度及其平均回收率的實驗數(shù)據(jù)（n=5）

四、結(jié)果與討論

1.氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按上述色譜和質(zhì)譜條件測定一系列6個質(zhì)量濃度的氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（見表3），線性范圍為0.25-5.00ng/mL，線性方程為y=0.45422x+0.01047，線性相關(guān)系數(shù)為0.99993，定量限為0.10μg/kg，在以實驗所取的0.10-10.00ng/mL之間的8個點做線性回歸時，當(dāng)用10.00ng/mL作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大濃度時，低濃度的點偏差較大，高于實際濃度的50%左右，所以該線性關(guān)系不適用于氯霉素含量高的水產(chǎn)品檢測。

2.不同水產(chǎn)品中氯霉素含量的檢測結(jié)果（見表4）

氯霉素檢測的線性范圍為0.25-5.00ng/mL，定量限為0.10μg/kg，在加標(biāo)量為0.10μg/kg、0.50μg/kg、1.00μg/kg時，樣品加標(biāo)回收率均在80%-120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10.0%。

3.結(jié)論

目前水產(chǎn)品中氯霉素的殘留主要按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20756-2006進行檢測，此方法在實際操作中操作步驟較為繁瑣，前處理時間較長，且存在一定的污染風(fēng)險。本實驗優(yōu)化了前處理方法，用氮吹取代旋蒸，同時簡化操作步驟，節(jié)省操作時間，且檢測結(jié)果均能滿足檢測要求，提高了檢測效率，但本實驗方法也有一定局限性，當(dāng)樣品中氯霉素含量超過1μg/kg時，線性要求可能無法滿足，此時我們可以通過減少取樣量或增加內(nèi)標(biāo)液的加入量等方法進行改善。綜上所述，我們在液質(zhì)聯(lián)用法測定水產(chǎn)品中氯霉素殘留時，應(yīng)根據(jù)自己的實際情況和需求來選擇適當(dāng)?shù)那疤幚矸椒ǎ堰_到較好的檢測效果。

（通聯(lián)：430070，農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心·武漢 電話：13971303160）