李步瀠，翟蒙恩，張 彬，劉振華，于立明，王曉武，金振曉，段維勛，俞世強(qiáng)

·基礎(chǔ)研究·

褪黑素通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抵抗多柔比星心臟毒性

李步瀠，翟蒙恩，張 彬，劉振華，于立明，王曉武，金振曉，段維勛，俞世強(qiáng)

目的 探討褪黑素(Mel)對多柔比星(DOX)心臟毒性的治療作用及其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。方法 60只雄性C57BL/6小鼠20～25 g，隨機(jī)分為3組(每組n=20)：正常對照(Control)組、DOX組和DOX與Mel共處理(DOX+Mel)組。給予小鼠單次腹腔注射DOX，劑量為15 mg/kg。DOX處理后5天，檢測心功能、心率、心臟凋亡比例以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。 結(jié)果 DOX顯著下調(diào)左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)與左室短軸縮短率(LVFS)，引起心肌損傷，下調(diào)心率，增加心肌細(xì)胞凋亡比例。Mel可顯著改善DOX引起的心臟收縮功能障礙，減輕心肌損傷，上調(diào)心率，并降低心肌細(xì)胞凋亡比例。此外，Mel治療可顯著抑制DOX誘發(fā)的心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而緩解心肌損傷(P均< 0.05)。結(jié)論 Mel共處理可顯著抑制DOX誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度激活，減輕心肌細(xì)胞凋亡，從而抵抗DOX心臟毒性。

褪黑素；多柔比星；心臟毒性；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

蒽環(huán)類藥物多柔比星(doxorubicin，DOX)是目前治療多種腫瘤中療效最確切、應(yīng)用最廣泛的化療藥物之一，但在臨床應(yīng)用因其心臟毒性受到限制[1-3]。臨床上應(yīng)用該藥物的患者存在有以下幾種形式的心臟毒性，即急性、亞急性、慢性進(jìn)展性心臟毒性，這些類型的心臟損傷均可導(dǎo)致心力衰竭，嚴(yán)重影響癌癥患者預(yù)后及生存[4-5]。因此，闡明其致病機(jī)制并探尋有效的防治措施意義重大。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)是在細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、分泌蛋白過度表達(dá)、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、缺氧以及細(xì)胞毒性藥物刺激時(shí)，錯(cuò)誤折疊或者未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量蓄積的現(xiàn)象[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)ER stress過度激活在DOX心臟毒性的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[7-9]。褪黑素(Melatonin，Mel)是一種主要由松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為高效的內(nèi)源性自由基清除劑[10]。大量研究證實(shí)Mel對于多種心血管疾病發(fā)揮了明顯的保護(hù)作用，如抵抗心肌缺血再灌注損傷、緩解糖尿病心肌病、抑制血管平滑肌凋亡等[11-13]。此外，Mel也可顯著緩解DOX心臟毒性和細(xì)胞毒性[3-14]。但Mel能否減輕DOX引起的ER stress尚無人報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠腹腔注射DOX，探討Mel對DOX心臟毒性的保護(hù)作用及其對心肌ER stress信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性C57BL/6小鼠，體重(20～25)g，均由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。Mel(Sigma公司)，DOX(Cayman Chemical公司)，原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測試劑盒(Roche公司)，兔抗PERK抗體、兔抗p-PERK抗體、兔抗eIF2α抗體、兔抗p-eIF2α抗體、鼠抗CHOP抗體(CST公司)，鼠抗β-actin抗體(CMCTAG公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠抗體(中杉金橋公司)。Vevo770小動物超聲儀(購自VisualSonics公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和DOX處理 將60只成年雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，每組20只：①正常對照組(Control組)：腹腔注射生理鹽水，每日攝入自來水；②DOX損傷組(DOX組)：一次性腹腔注射DOX(15 mg/kg)，每日攝入自來水；③DOX與Mel共處理組(DOX+Mel組)：一次性腹腔注射DOX(15 mg/kg)，每日通過飲水?dāng)z入Mel 20 mg/kg，連續(xù)5 d。小鼠DOX處理方法參閱以往文獻(xiàn)[15]。

1.2.2 心功能檢測 DOX腹腔注射5 d后，利用Vevo770小動物超聲儀檢測并計(jì)算小鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)等心功能指標(biāo)。利用PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)監(jiān)測小鼠心率。

1.2.3 心肌HE染色與凋亡檢測 DOX腹腔注射5 d后，迅速取出心臟，以預(yù)冷的PBS沖洗干凈，然后置于4%多聚甲醛固定24 h。經(jīng)脫水、包埋后，垂直于心臟長軸將其切成5 μm厚的切片，并按照文獻(xiàn)所述進(jìn)行蘇木精-伊紅染色[16]。普通光鏡下拍照并觀察心肌細(xì)胞損傷情況。常規(guī)脫蠟至水后，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說明書要求操作。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)以上不重復(fù)的含凋亡細(xì)胞的視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞核數(shù)，總細(xì)胞核數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率(apoptotic ratio)。

1.2.4 蛋白分子表達(dá)的檢測 DOX腹腔注射5 d后，迅速取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后，液氮中保存待測。去各組小鼠心臟提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度并根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整蛋白上樣體積，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到氧乙烯(PVDF)膜，經(jīng)50 g/L脫脂牛奶封閉2 h后，依次滴加抗p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、CHOP及β-actin抗體(濃度為1∶1 000，均以TBST緩沖液配制)， 4℃過夜，TBST洗脫3次，分別加1∶5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(山羊抗鼠及山羊抗兔)，室溫孵育1 h，TBST洗脫3次，使用免疫印跡化學(xué)發(fā)光法檢測并觀察結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參照，檢測各蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 Mel處理改善心功能，減輕心肌損害與凋亡 小鼠腹腔注射DOX后5 d檢測超聲心動圖顯示，與Control組相比，DOX處理后小鼠LVEF和LVFS明顯降低，心率明顯下降(P<0.05)；與DOX組相比，DOX+Mel組LVEF、LVFS及心率顯著提高(P<0.05)；DOX處理1 d后心肌HE染色顯示，與Control組相比，DOX損傷組小鼠發(fā)生心肌損傷，心肌空泡化現(xiàn)象明顯增多(P<0.05)；與DOX組相比，DOX+Mel組小鼠心肌空泡化現(xiàn)象顯著改善；DOX處理1 d后TUNEL法檢測心肌組織凋亡顯示，與Control組相比，DOX處理顯著增加心肌細(xì)胞凋亡率(P<0.05);與DOX組相比，DOX+Mel組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，見圖1。

2.2 Mel抑制ER stress信號通路 Western blot檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，DOX組心肌p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP明顯增高，提示DOX可誘發(fā)心肌組織ER stress反應(yīng)。與DOX組相比，DOX+Mel組能夠顯著下調(diào)p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α比值及CHOP表達(dá)(P<0.05)，見圖2。

3 討 論

DOX引起的心臟毒性是限制其臨床應(yīng)用的一大障礙。闡明其具體機(jī)制并探尋新的有效的防治策略對于該藥物的臨床應(yīng)用具有重大意義。DOX心臟毒性的具體機(jī)制主要包括氧化應(yīng)激損傷、拓?fù)洚悩?gòu)酶II-β、凋亡、自噬等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ER stress在DOX心臟毒性的病理生理過程中發(fā)揮了重要作用。減輕心肌細(xì)胞過度產(chǎn)生的ER stress可以明顯改善DOX心臟毒性[7-9]。因此，尋找有效方案緩解DOX給藥后心肌ER stress是基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

注：A：各組超聲心動圖；B：LVEF；C：LVFS；D：心率；E：心肌切片HE染色(×200)；F：心肌切片TUNEL圖像(×200)； G：心肌細(xì)胞凋亡率(%)。與Control組比較，*P<0.05；與DOX組比較，#P<0.05。圖1 Mel顯著改善DOX引起的心功能障礙與心肌細(xì)胞凋亡(n=20)

注：A～D：DOX處理后各組心肌p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α及CHOP表達(dá)水平的檢測。與Control組比較， *P<0.05；與DOX組比較，#P<0.05。圖2 Mel調(diào)控ER stress和凋亡信號通路(n=20)

Mel是一種主要由松果體分泌的吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，因其具有直接的自由基清除能力和間接的抗氧化能力而發(fā)揮了多種心腦血管保護(hù)作用[17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Mel能夠顯著減低心肌缺血再灌注損傷[18-19]。此外，Mel也可改善DOX引起的心臟毒性[3-14]。前期研究證實(shí)，DOX對心臟功能的影響主要表現(xiàn)為心肌收縮功能下降、心率降低等[20]。心肌細(xì)胞空泡化現(xiàn)象是心肌損傷的重要病理改變，筆者研究發(fā)現(xiàn)，大劑量DOX可誘導(dǎo)發(fā)生心肌細(xì)胞空泡化反應(yīng)，提示發(fā)生心肌損傷。通過TUNEL染色檢測心肌組織凋亡水平， 還發(fā)現(xiàn)大劑量DOX也能導(dǎo)致明顯心肌細(xì)胞凋亡反應(yīng)。Mel共處理可有效緩解DOX心臟毒性，改善心肌收縮功能，增加心率，改善小鼠心臟功能并減少心肌損傷，降低凋亡率。為了進(jìn)一步探究Mel抵抗DOX心臟毒性是否與ER stress相關(guān)仍需進(jìn)一步研究。

在真核細(xì)胞中，分泌性蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)折疊成原始構(gòu)象，并經(jīng)過修飾最終成為具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。只有正確折疊的蛋白質(zhì)才能分泌入高爾基體，但當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、分泌蛋白過度表達(dá)、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、缺氧以及細(xì)胞毒性藥物刺激會造成錯(cuò)誤折疊或者未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量蓄積，稱為ER stress[6]。ER stress發(fā)生時(shí)會激活雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase, PERK)，活化的PERK促使真核生物起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)磷酸化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯水平整體降低，從而減少蛋白質(zhì)的合成[21]。然而應(yīng)激過強(qiáng)或持續(xù)較長時(shí)間時(shí)，ER stress則會激活CHOP(C/EBP-homologous protein)表達(dá)。CHOP進(jìn)而激活凋亡途徑引起細(xì)胞凋亡[22]。研究發(fā)現(xiàn)，針對過度激活的心肌ER stress已成為治療DOX心臟毒性的新的干預(yù)策略[7-9]。然而，Mel是否通過調(diào)節(jié)ER stress來減輕DOX心臟毒性尚無人報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，DOX給藥后能顯著激活心肌ER stress途徑，引起PERK與eIF2α的磷酸化水平以及CHOP的表達(dá)增高，造成心肌損傷。Mel共處理可以顯著降低PERK與eIF2α的磷酸化水平，抑制CHOP的表達(dá)，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞凋亡比例，發(fā)揮心肌保護(hù)效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Mel可顯著減輕DOX引起的ER stress過度激活，從而抑制凋亡，保護(hù)心肌。抑制ER stress很可能是Mel心肌保護(hù)的新機(jī)制之一。本研究揭示了Mel抵抗DOX心臟毒性新機(jī)制，并為Mel相關(guān)藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Melatonin protects heart against Doxorubicin-induced cardiotoxicity partly through inhibiting cardiac endoplasmic reticulum stress

Li Bu-ying, Zhai Meng-en, Zhang Bin, Liu Zhen-hua, Yu Li-ming, Wang Xiao-wu, Jin Zhen-xiao,Duan Wei-xun, Yu Shi-qiang

DepartmentofCardiovascularSurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShanxiXi'an710032,China

YuShi-qiang,Email:shiqiangyu210@126.com

Objective To study the effect of melatonin (Mel) on doxorubicin (DOX)-induced cardiotoxicity and endoplasmic reticulum (ER) stress. Methods Male C57BL/6 mice (20-25g) were subject to a single intraperitoneal injection of doxorubicin (DOX, 15 mg/kg). Animals were randomly divided into three groups: Control group (n=20), DOX group (n=20) and DOX+Mel group (n=20). Five days after DOX injection, cardiac function, heart rate, myocardial apoptotic ratio, and the expression of p-PERK, PERK, p-eIF2α，eIF2α and CHOP were measured. Results Mel treatment significantly improved the cardiac functional recovery, increased heart rate and reduced myocardial injury and apoptosis. Additionally, Mel treatment significantly decreased the p-PERK/PERK ratio, p-eIF2α/eIF2α ratio and CHOP expression following DOX treatment (allP<0.05). Conclusion Our results show that melatonin protects the heart against DOX-induced cardiotoxicity by reducing ER stress.

Melatonin; Doxorubicin; Cardiotoxicity; ER stress

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.02.11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(81570231，81570230，81470415)

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科

俞世強(qiáng)，Email：shiqiangyu210@126.com

2017-02-14)

2017-04-12)