張 力，鄧春玉，鄺素娟，章曉華，莊 建，周成斌

·基礎(chǔ)研究·

低氧條件下缺氧誘導(dǎo)因子-1對(duì)胎鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

張 力，鄧春玉，鄺素娟，章曉華，莊 建，周成斌

目的 觀察低氧條件下缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)對(duì)胎鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，探索胎兒心肌保護(hù)新方法。方法 取胎齡14～18 d Sprague-Dawley(SD)大鼠胎鼠的心肌細(xì)胞置于含5% CO2，3% O2和92% N2的三氣培養(yǎng)箱在37℃下培養(yǎng)24 h，分3組進(jìn)行干預(yù)：對(duì)照組；HIF-1激動(dòng)劑(DMOG)100 μM(DMOG組)；HIF-1抑制劑(Acriflavine)10 μM(Acriflavine組)。共同作用24 h后，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time-PCR, RT-PCR)和免疫印跡分析(Western-blot)檢測(cè)胎鼠心肌細(xì)胞HIF-1α、L型Ca2+通道(LCa)、T型Ca2+通道(TCa)、鈉鈣交換蛋白(NCX)、Ryanodine受體和肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA2a) mRNA表達(dá)及蛋白水平。在激光共聚焦顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示HIF-1α的mRNA表達(dá)量DMOG組較對(duì)照組顯著升高，Acriflavine組較對(duì)照組和DMOG組顯著降低，TCa的mRNA表達(dá)量DMOG組較Acriflavine組顯著升高、NCX的mRNA表達(dá)量DMOG組較對(duì)照組顯著升高，Acriflavine組較對(duì)照組和DMOG組顯著降低，Rynaodine受體的mRNA表達(dá)量Acriflavine組較對(duì)照組顯著降低，DMOG組較Acriflavine組顯著升高，SERCA2α的mRNA表達(dá)量Acriflavine組較對(duì)照組和DMOG組顯著升高(P<0.05，n=5)；Western-blot結(jié)果顯示HIF-1α的蛋白表達(dá)量DMOG組較對(duì)照組及Acriflavine組均顯著升高，LCa的蛋白表達(dá)量DMOG組較對(duì)照組及Acriflavine組顯著升高(P<0.05，n=5)。激光共聚焦顯微鏡下測(cè)定鈣熒光量，DMOG組較對(duì)照組及Acriflavine組顯著增加(P<0.001，n=12)。結(jié)論 在低氧條件下，DMOG過度激活HIF-1，使胎鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載明顯，Acriflavine抑制HIF-1活性，減輕胎鼠心肌細(xì)胞Ca2+超載，增強(qiáng)心肌細(xì)胞調(diào)節(jié)Ca2+的能力，對(duì)未成熟心肌起保護(hù)作用。

低氧；缺氧誘導(dǎo)因子-1；SD胎鼠；心肌細(xì)胞；鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)

低氧是胎兒心臟發(fā)育過程中不可或缺的生長(zhǎng)條件，研究顯示低氧激活缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)，參與早期胎兒心臟的形成、冠脈血管的生長(zhǎng)、流出道的成形和中后期的胎兒心臟發(fā)育等[1]。胎兒心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)轉(zhuǎn)運(yùn)與心功能的改變密切相關(guān)。為了了解低氧條件下HIF-1對(duì)未成熟心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，本研究通過對(duì)胎鼠心肌細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并采用藥物對(duì)HIF-1的活性進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)其對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，旨在探討HIF-1在胎兒心肌保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 麻醉藥物為地西泮注射液(10 mg/2 ml，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)，氯胺酮注射液(100 mg/2 ml，福建古田藥業(yè)有限公司)；三抗、DMEM/F-12(1∶1)、PBS、胎牛血清(gibco公司，美國(guó))；二甲基乙二酰氨基乙酸(DMOG，Selleck)，鹽酸吖啶磺(Acriflavine，aladdin)；氯仿、異丙醇、無水乙醇(廣州中南化工)；DEPC、Trizol、Premix EX TaqTM(Probe qPCR)、Prime ScriptTMRT reagent Kit、Oligod(T) Primer、Random Primer(TaKaRa)；一抗試劑：NCX1、HIF-1-α-ChIP Grade、TPCN1、SERCA2 ATPase、GAPDH(內(nèi)參)(Abcam)；二抗試劑：Goat anti-rabbit IgG-HRP(SANTA CRUZ)；PageRuler Prestained Protein Ladder(SM0671)(Fermentas)；BeyoECL Plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)(P0018)(碧云天公司)；SDS、TEMED(Sigma)；丙烯酰胺、過硫酸銨、甘氨酸(Amresco)；甲叉雙丙烯酰胺(Fluka)；Tris(Roche)；1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8、1.0 mol/L Tris-HCl pH 6.8、TBST緩沖液、還原型SDS-PAGE 5×Loading Buffer(廣州藍(lán)吉生物技術(shù)有限公司)；5×7膠片(柯達(dá))；PVDF膜(Millipore)；脫脂奶粉(Biotoped)；顯影粉、定影粉(天津世紀(jì)奧博有限公司)；甲醇(天津諾克有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)孕鼠，孕14～18 d，體質(zhì)量約400 g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0034。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Stemi DV4型體式顯微鏡(ZEISS公司，德國(guó))；Spectrafuge 6C型高速離心機(jī)(Labnet公司，美國(guó))；二氧化碳培養(yǎng)箱(多氣體型，SANYO，日本)；熒光實(shí)時(shí)定量?jī)x7300(ABI公司，美國(guó))；C1000 Thermal cycler PCR儀、Mini型蛋白電泳系統(tǒng)(BIO-RAD公司，美國(guó))；制冰機(jī)(Scotsman公司，美國(guó))；Scanspeed 1730R低溫離心機(jī)(Labogene，丹麥)；QL-901微型振蕩器、旋渦振蕩器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；LG2000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)；X射線攝影暗匣AX-Ⅱ(127 mm×178 mm)(廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司)；JJ100電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠)；TGL-18R冷凍高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；DK-8D電熱恒溫槽(上海-恒科技有限公司)；島津UV-1750紫外分光光度儀(日本)。

1.4 胎鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) SD孕鼠，給予地西泮5 mg，氯胺酮50 mg肌注麻醉，按照常規(guī)無菌操作原則進(jìn)行開腹，剖開子宮取出胎鼠。剪開胎鼠胸部取其心臟，放入含DMEM/F-12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，去除外周血管、脂肪和結(jié)締組織，用DMEM/F-12洗3遍，用眼科剪剪成1 mm3的塊狀組織，置于含1%胰酶液的離心管中，輕輕吹打后進(jìn)行低速離心，棄上清。再加入1%胰酶液5 ml，反復(fù)吹打1 min，收集吹打消化后的液體，放入含10%胎牛血清5 ml的離心管中終止消化。依次反復(fù)，直至組織塊完全溶解。將收集的液體用篩網(wǎng)過濾，1 000 rpm室溫離心10 min。棄上清，加入4 ml含DMEM/F-12 45 ml+10%胎牛血清5 ml+三抗0.5 ml的不完全培養(yǎng)基，吹打成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，于含5%CO2，3%O2和92%N2的三氣低氧培養(yǎng)箱內(nèi)37℃差速貼壁2 h，分離非心肌細(xì)胞，所得未貼壁細(xì)胞即心肌細(xì)胞。

1.5 分組加藥處理 實(shí)驗(yàn)采取隨機(jī)對(duì)照分組，分為三組：①對(duì)照組；②DMOG 100 μM(DMOG組)；③Acriflavine 10 μM(Acriflavine組)。加藥后置于含5% CO2，3% O2和92% N2的三氣低氧培養(yǎng)箱中與藥物共同作用24 h。

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR) 測(cè)定HIF-1α、L型Ca2+通道(LCa)、T型Ca2+通道(TCa)、鈉鈣交換蛋白(NCX)、Ryanodine受體和肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA2a) mRNA表達(dá)。參照文獻(xiàn)[2-3]方法，用Trizol法提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系見表1，引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件見表2，根據(jù)PCR反應(yīng)的溶解曲線及曲線特征，評(píng)價(jià)引物增殖反應(yīng)的特異性記錄各樣本反應(yīng)的閾值(Threshold cycle，Ct)，樣本mRNA表達(dá)量計(jì)算：第一步：⊿Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；第二步：⊿⊿Ct=⊿Ct-⊿Ct對(duì)照組/最大值；第三步：樣本的相對(duì)表達(dá)量=2-⊿⊿Ct。

表1 RT-PCR反應(yīng)體系

1.7 蛋白免疫印跡 檢測(cè)胎鼠心肌細(xì)胞HIF-1α、LCa、NCX 和SERCA2a的蛋白表達(dá)。將上述分組培養(yǎng)的細(xì)胞去除培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液，離心后取上清進(jìn)行蛋白定量。隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，樣品經(jīng)過分離膠及濃縮膠，待溴酚藍(lán)至分離膠下緣時(shí)停止電泳，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將樣品蛋白濕轉(zhuǎn)至NC膜上。封閉后加入稀釋后的抗體依次進(jìn)行一抗孵育(抗體濃度分別為HIF-1α、LCa、NCX抗體1∶1 000，SERCA2a抗體1∶2 000)和二抗孵育(各抗體濃度均為1∶5 000)，最后在暗室中進(jìn)行ECL顯色。顯色結(jié)果拍照后采用灰度分析進(jìn)行半定量分析。

1.8 Ca2+濃度動(dòng)態(tài)變化測(cè)定 將細(xì)胞接種于專用的激光共聚焦培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)箱內(nèi)與10 μmol/L的fluo-4 AM(2 μl)避光37℃孵育30 min，孵育完畢后用HEPEs液漂洗3次，最后加入含鈣的HEPEs液，通過激光共聚焦顯微鏡連續(xù)監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化，參照相關(guān)文獻(xiàn)[4]設(shè)置參數(shù)，激發(fā)光為氬激光，波長(zhǎng)488 nm，分辨率為512×512，掃描速度為400 Hz，選擇時(shí)間序列xyt掃描模式，采圖所需的總時(shí)間Duration為15 min，采集相鄰兩幀圖像的時(shí)間間隔為1.5 s，在40倍長(zhǎng)工作距離的物鏡下動(dòng)態(tài)觀察Fluo 4-AM指示Ca2+的變化。圖像采用軟件IDL處理，鈣熒光量⊿F/F0=(F-F0)/F0(F和F0分別代表某一時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度和本底的熒光強(qiáng)度)。

表2 RT-PCR寡核苷酸引物及擴(kuò)增條件

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組樣本均數(shù)比較采用單因素ANOVA分析和LSD多重比較法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胎鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 在含5%CO2，3% O2，92% N2混合氣體的低氧培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h后，于40×顯微鏡下可見心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，初為圓形，后變?yōu)樗笮?，單個(gè)細(xì)胞開始搏動(dòng)。細(xì)胞逐漸在培養(yǎng)板鋪展，伸出偽足，相互接觸交織成網(wǎng)(見圖1)。

圖1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)(40×)

2.2 與藥物共同作用后 分組加入藥物后培養(yǎng)24 h，40×顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，DMOG作用下，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，收縮有力，Acriflavine作用下，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，且收縮減弱(見圖2)。

2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各基因mRNA表達(dá)量 RT-PCR結(jié)果顯示HIF-1α的mRNA表達(dá)量DMOG組較對(duì)照組顯著升高，Acriflavine組較對(duì)照組和DMOG組顯著降低，TCa的mRNA表達(dá)量DMOG組較Acriflavine組顯著升高、NCX的mRNA表達(dá)量DMOG組較對(duì)照組顯著升高，Acriflavine組較對(duì)照組和DMOG組顯著降低，Rynaodine受體的mRNA表達(dá)量Acriflavine組較對(duì)照組顯著降低，DMOG組較Acriflavine組顯著升高，SERCA2α的mRNA表達(dá)量Acriflavine組較對(duì)照組和DMOG組顯著升高(P<0.05，n=5)，見表3。

2.4 蛋白免疫印跡分析各基因蛋白水平 Westernblot結(jié)果顯示HIF-1α的蛋白表達(dá)量DMOG組較對(duì)照組及Acriflavine組均顯著升高，LCa的蛋白表達(dá)量DMOG組較對(duì)照組及Acriflavine組顯著升高(P<0.05，n=5)，見表4。蛋白電泳見圖3。

圖3 Western-blot 檢測(cè)各基因蛋白表達(dá)

圖2 藥物作用后的心肌細(xì)胞(40×)

HIF-1αLCaTCaNCXRynaodine受體SERCA2α對(duì)照組1*111*1*1*DMOG組1.862±0.516*3.664±3.1101.736±0.976*1.814±0.652*1.123±0.191*2.539±0.769*Acriflavine組0.261±0.114*2.684±3.5270.242±0.270*0.300±0.149*0.282±0.114*16.577±6.767*

注：*表示組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05。

表4 Western-blot檢測(cè)各基因蛋白表達(dá)

注：*表示組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05。

圖4 心肌細(xì)胞鈣瞬變

2.5 Ca2+濃度測(cè)定 激光共聚焦顯微鏡下可見鈣瞬變，見圖4。測(cè)量鈣瞬變熒光量結(jié)果顯示：DMOG組(14.054±3.236)顯著大于對(duì)照組(8.062±1.350)和Acriflavine組(1.708±0.175)，(P<0.001，n=12)，見圖5。

注：*表示組間比較有顯著性差異P<0.001。圖5 鈣瞬變熒光量測(cè)定

3 討 論

HIF-1是一個(gè)由氧敏感的α亞基和結(jié)構(gòu)性表達(dá)的β亞基組成的異源二聚體。HIF-1β在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，而HIF-1α的活性和表達(dá)水平受氧濃度的影響[5]。HIF-1α是細(xì)胞最早感受缺氧刺激的因子之一，常氧條件下HIF-1無DNA結(jié)合活性，而在低氧條件下其表達(dá)顯著升高[6]。常氧下HIF-1α被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase,PHD)作用后,經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑迅速被降解；低氧下PHD受到抑制，HIF-1α穩(wěn)定性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與HIF-1β形成HIF-1，作用于靶基因的缺氧反應(yīng)元件，激活轉(zhuǎn)錄過程，其調(diào)控基因涉及胎兒心臟發(fā)育的多個(gè)環(huán)節(jié)[7]。

心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)與心功能密切相關(guān)。盡管胎兒心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)的Ca2+儲(chǔ)備較少，但是SR仍然是鈣誘導(dǎo)鈣釋放(calcium induced caldium release，CICR)機(jī)制中Ca2+釋放和回收的重要細(xì)胞器。通過Ca2+通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Ca2+作用于SR膜上的Ryanodine受體，啟動(dòng) CICR機(jī)制，SR釋放Ca2+，與細(xì)胞外進(jìn)入的Ca2+一起產(chǎn)生鈣瞬變，促進(jìn)肌絲的滑動(dòng)，發(fā)生心肌收縮現(xiàn)象；達(dá)到鈣瞬變的峰值后，SERCA2a、 NCX等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將胞漿內(nèi)增多的Ca2+回收到SR內(nèi)或泵出細(xì)胞外，使胞漿內(nèi)Ca2+濃度迅速下降，肌絲滑動(dòng)復(fù)員，心肌舒張[8]。Ryanodine受體參與了心肌的興奮收縮耦聯(lián)、心臟起搏和心率失常的過程，維持了心肌細(xì)胞ATP的生產(chǎn)和生存[9]，其表達(dá)隨著HIF-1活性的增加而上調(diào)。SERCA2a基因在鈣回?cái)z中有重要作用，在SERCA2a編碼基因的啟動(dòng)子上有HIF-1結(jié)合的缺氧反應(yīng)元件，研究顯示低氧和HIF-1抑制胚胎心肌細(xì)胞SERCA2a的表達(dá)和活性[10]。NCX在心肌細(xì)胞膜上是一個(gè)非ATP依賴的雙向鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，低氧下細(xì)胞內(nèi)氫離子增多，促進(jìn)鈉氫交換和NCX轉(zhuǎn)運(yùn)，增加Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載是缺血心肌在再灌注過程中細(xì)胞凋亡、壞死、以及心功能降低的重要原因。

在既往研究[11-15]的基礎(chǔ)上，筆者使用DMOG來減少HIF-1α的降解，促進(jìn)HIF-1的活性，而Acriflavine可以干擾HIF-1α和HIF-1β的結(jié)合，抑制HIF-1的活性。經(jīng)本研究分析，DMOG過度激活HIF-1，使Ca2+通道及Ryanodine受體表達(dá)增強(qiáng)，抑制了SERCA2a的表達(dá)，降低SR攝取Ca2+的能力，同時(shí)上調(diào)NCX的表達(dá)，NCX促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，減少Ca2+排出，從而產(chǎn)生Ca2+超載，激活Ca2+依賴的蛋白酶，影響心肌收縮蛋白的功能，產(chǎn)生心功能不良。相反，Acriflavine抑制了HIF-1的活性，Ca2+通道及Ryanodine受體表達(dá)減弱，SERCA2a的表達(dá)上調(diào)，SR攝取Ca2+的能力增強(qiáng)，鈣瞬變現(xiàn)象不明顯，減少心功能損害。

綜上所述，在低氧條件下，DMOG過度激活HIF-1，使胎鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載明顯，Acriflavine抑制HIF-1活性，減輕胎鼠心肌細(xì)胞Ca2+超載。因此，筆者認(rèn)為HIF-1在調(diào)節(jié)低氧條件下的胎鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮重要作用，抑制HIF-1活性可以對(duì)未成熟心肌起保護(hù)作用。

[1]Patterson AJ, Zhang L. Hypoxia and fetal heart development [J]. Curr Mol Med, 2010, 10(7): 653-666.

[2]梁賅，杜偉，李爽，等. 抑制HIF-1α表達(dá)對(duì)低氧培養(yǎng)SGC-7901胃癌細(xì)胞CD44表達(dá)的影響 [J]. 實(shí)用癌癥雜志，2015, 30(9)：1269-1272.

[3]Zhang H, Liu LH, Shi M,etal. Sphingosine kinase 1 promotes glioma cell proliferation under hypoxia via calcium signaling[J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao, 2015,35(7):1014-1018.

[4]管倩楠，段斐，吳銀玲，等. 用于鈣信號(hào)研究的小鼠心室肌細(xì)胞急性分離的優(yōu)化 [J]. 醫(yī)學(xué)研究與教育，2016,33(2)：6-11.

[5]Zampino M, Yuzhakova M, Hansen J,etal. Sex-related dimorphic response of HIF-1α expression in myocardial ischemia[J]. Am J Physiol Heart Crie Physiol, 2006, 291(2): 957-964.

[6]王蘋蘋，孔繁平，陳學(xué)群. 低氧細(xì)胞應(yīng)激的HIF-1信號(hào)通路[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011, 40(5):559-566.

[7]Hashmi S, Al-Salam S. Hypoxia-Inducible factor-1 alpha in the heart: A double agent[J]? Cardiol Rev, 2012, 20(6): 268-273.

[8]Endoh M. Signal transduction and Ca2+ signaling in intact myocardium[J]. J Pharmacol Sci, 2006, 100(5):525-537.

[9]Bround MJ, Wambolt R, Luciani DS,etal. Cardiomyocyte ATP production, metabolic flexibility, and survival require calcium flux through cardiac ryanodine receptors in vivo[J]. J Biol Chem, 2013, 288(26):18975-18986.

[10]Ronkainen VP, Skoumal R, Tavi P. Hypoxia and HIF-1 suppress SERCA2a expression in embryonic cardiac myocytes through two interdependent hypoxia response elements[J]. J Mol Cell Cardiol, 2011, 50(6): 1008-1016.

[11]Reddy VM, Liddicoat JR, Klein JR,etal. Long-term outcome after fetal cardiac bypass: fetal survival to full term and organ abnormalities[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1996, 111(3): 536-544.

[12]Fenton KN, Zinn HE, Heinemann MK,etal. Long-term survivors of fetal cardiac bypass in lambs[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1994, 107(6): 1423-1427.

[13]Duffy JY, Petrucci O, Baker RS,etal. Myocardial function after fetal cardiac bypass in an ovine model[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2011, 141(4): 961-968.

[14]Heeb EA, Baker RS, Lam C,etal. Role of natriuretic peptides in cGMP production in fetal cardiac bypass[J]. Ann Thorac Surg, 2009, 87(3): 841-847.

[15]周成斌, 張鏡芳, 莊建, 等. 胎羊心臟轉(zhuǎn)流對(duì)胎羊心功能的影響[J]. 中華胸心外科雜志. 2007; 23(5): 329-331.

Effects of hypoxia-inducible factor-1 on intracellular calcium transport in fetal rat cardiomyocytes under hypoxia

Zhang Li, Deng Chun-yu, Kuang Su-juan, Zhang Xiao-hua, Zhuang Jian, Zhou Cheng-bin

GuangdongCardiovascularInstitute,DepartmentofCardiovascularSurgeryofGuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China

ZhouCheng-bin,Email:zcbwwww@163.com

Objective This study aimed to investigate the effects of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) on intracellular calcium (Ca2+) transport in fetal rat cardiomyocytes under hypoxia and to explore new methods of myocardial protection. Methods Cardiomyocytes from Sprague-Dawley (SD) rat aged 14～18 days were isolated and placed in a tri-gas incubator containing 5% CO2, 3% O2, and 92% N2. Cell culture was maintained at 37℃ for 24 h and divided into , control group, the group treated with HIF-1 agonist (DMOG group), and the group treated with HIF-1 inhibitor (Acriflavine group). Real-time fluorescent quantitative PCR (RT-PCR) and Western blotting were used 24 hours after treatment to detect the mRNA and protein expression of HIF-1α, L-type Ca2+channels, T-type Ca2+channels, sodium-calcium exchanger (NCX), ryanodine receptors, and Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum (SERCA2a) . The change of intracellular Ca2+concentration in cardiomyocytes was monitored by a laser scanning confocal microscope.

Results mRNA expression of HIF-1α in the DMOG group was significantly higher and that of Acriflavine group was lower than control group. T-type Ca2+channels mRNA in the DMOG group was higher than Acriflavine group. DMOG group had a increased level of NCX, where as the Acriflavine group showed a significantly reduced level. Acriflavine group had lower expression of ryanodine receptors but higher SERCA2a mRNA expression (P<0.05, n=5). Western blotting results showed an enhance dexpression of HIF-1α and L-type Ca2+channels in DMOG group. (P<0.05, n=5). The amount of calcium fluorescence in DMOG group was significantly higherthan control and Acriflavine group (P<0.001, n=10). Conclusions Under hypoxia, DMOG over activates HIF-1 and can lead to significant intracellular Ca2+overload inside cardiomyocytes of fetal rats. Acriflavine is capable of inhibiting the activity of HIF-1 and reducing the intracellular Ca2+load inside the cardiomyocytes,which may protect immature myocardium.

Hypoxia；Hypoxia-inducible factor-1；SD rat fetus；Cardiomyocyte；Calcium transport

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.02.12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81370274)

510080 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)，廣東省心血管病研究所，廣東省華南結(jié)構(gòu)性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(張 力，周成斌)；廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東省心血管病研究所(鄧春玉，鄺素娟)；廣東省心血管病研究所，廣東省華南結(jié)構(gòu)性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(章曉華，莊 建)

周成斌，E-mail: zcbwwww@163.com

2016-12-22)

2017-01-16)