張 彬，翟蒙恩，李步瀠，劉振華，陳正希，余鵬飛，于立明，梁宏亮，段維勛，金振曉，俞世強(qiáng)

·基礎(chǔ)研究·

蛋白激酶C epsilon信號通路介導(dǎo)褪黑素抗H9C2細(xì)胞缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

張 彬，翟蒙恩，李步瀠，劉振華，陳正希，余鵬飛，于立明，梁宏亮，段維勛，金振曉，俞世強(qiáng)

目的 探討褪黑素(Mel)在H9C2細(xì)胞缺血再灌注損傷過程中的保護(hù)作用及其機(jī)制，明確蛋白激酶C epsilon(PKCε)信號通路在此過程中的作用。方法 H9C2細(xì)胞經(jīng)Mel(100 μmol/L)預(yù)處理12 h后，接受模擬缺血再灌注(SIR)損傷(缺血45 min，再灌注4 h)，采用CCK-8法和TUNEL法分別檢測細(xì)胞活力和凋亡率，使用酶活性測定法檢測細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的釋放量，使用Western blot法檢測細(xì)胞膜PKCε、細(xì)胞質(zhì)PKCε、Bcl-2、Bax、Caspase-3和gp91phox蛋白的表達(dá)情況，并使用PKCε特異性阻斷劑εV1-2觀察PKCε信號通路在這一過程中發(fā)揮的作用。結(jié)果 經(jīng)SIR處理后，H9C2細(xì)胞活力顯著降低，凋亡率明顯增加，PKCε膜轉(zhuǎn)位減少，Bcl-2/Bax比例下調(diào)，Caspase-3與gp91phox蛋白表達(dá)量增加，細(xì)胞中MDA含量上升，SOD活力下降。Mel預(yù)處理可顯著提高SIR處理后H9C2細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率，促進(jìn) PKCε膜轉(zhuǎn)位，上調(diào)細(xì)胞中SOD活性及降低MDA含量，并可降低Caspase-3與gp91phox蛋白表達(dá)量。而使用εV1-2阻斷PKCε信號通路可逆轉(zhuǎn)Mel的上述保護(hù)作用(均P<0.05)。 結(jié)論 Mel可通過激活PKCε保護(hù)性信號通路減輕SIR引起的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷與凋亡。

褪黑素；缺血再灌注損傷；蛋白激酶C epsilon；氧化應(yīng)激；凋亡

缺血性心臟病嚴(yán)重危害人類健康，其首要治療策略是及時恢復(fù)缺血心肌的血流灌注，然而血流再灌注易加重心肌組織結(jié)構(gòu)損傷及能量代謝障礙，誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI)[1-2]。這種損傷可導(dǎo)致血流障礙、心功能異常、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、心肌細(xì)胞壞死和凋亡，是由多種觸發(fā)物、媒介物和效應(yīng)器共同參與的復(fù)雜生物反應(yīng)過程[3-4]。褪黑素(melatonin，Mel)是由松果體分泌的一種激素，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Mel具有抗氧化應(yīng)激進(jìn)而減輕I/R損傷的作用，成為心肌保護(hù)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5]，然而其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。有研究報道，激活PKCε信號通路可顯著減輕MI/RI，降低氧化應(yīng)激水平[6]，然而其是否介導(dǎo)Mel的心肌保護(hù)效應(yīng)尚未見報道。同時，H9C2細(xì)胞系是來源于大鼠胚胎心臟組織的亞克隆細(xì)胞株，被廣泛用于模擬心肌細(xì)胞進(jìn)行心肌保護(hù)的藥理學(xué)研究。本研究采用H9C2細(xì)胞系模擬缺血再灌注(simulated ischemia reperfusion，SIR)損傷模型，旨在研究Mel抗SIR損傷引發(fā)的氧化應(yīng)激作用及其與PKCε信號通路的關(guān)系，并進(jìn)一步探討其潛在的心肌保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 H9C2細(xì)胞系(深圳百恩維公司)；褪黑素，DAPI染液(Sigma-Aldrich公司)，原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測試劑盒(Roche公司)；質(zhì)膜分離試劑盒(Thermo scientific公司)；CCK-8細(xì)胞毒性檢測試劑盒(七海生物公司)；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒和丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Anti-PKCε和Anti-gp91phox(Santa Cruz公司)；Anti-Bcl-2、Anti-Bax、Anti-Caspase-3抗體(Cell Signaling公司)；Anti-β-actin抗體(CMCTAG公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備儀器廠)；激光掃描共聚焦顯微鏡、倒置顯微鏡(Olympus公司)；細(xì)胞用低速離心機(jī)(Saitexiangyi公司)；Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜及發(fā)光成像設(shè)備(Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(SpectraMax公司)。

1.3 方法

1.3.1 H9C2細(xì)胞的培養(yǎng)及SIR模型的建立 H9C2細(xì)胞的培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；SIR損傷通過模擬缺血液實(shí)現(xiàn)。缺血液配方為KCl 12 mmol/L、NaCl 137 mmol/L、CaCl2·2H2O 0.9 mmol/L、MgCl20.49 mmol/L、 HEPES 4 mmol/L、連二亞硫酸鈉0.75 mmol/L、脫氧葡萄糖10 mmol/L、乳酸鈉20 mmol/L，pH值調(diào)至6.5。加入缺血液的細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶置于5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)45 min，缺血完成后更換正常DMEM在5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中再灌注繼續(xù)孵育4 h。

1.3.2 實(shí)驗分組及CCK-8法細(xì)檢測各組H9C2細(xì)胞活力 實(shí)驗一：為探究Mel在SIR模型中的作用，將實(shí)驗分為4組，分別為①Con組；②SIR組；③Mel+SIR組；④Mel+Con組，每組n=8，在SIR損傷前，Mel藥物(100 μmol/L)預(yù)處理時間為12 h。實(shí)驗二：為觀察蛋白激酶C epsilon(PKCε)信號通路是否介導(dǎo)Mel抗SIR損傷的作用，在Mel處理前用PKCε特異性阻斷劑εV1-2預(yù)處理1 h以阻斷PKCε通路，實(shí)驗分組如下：①SIR組；②Mel +SIR組；③εV1-2+Mel+SIR組；④εV1-2+SIR組，觀察εV1-2對Mel抗H9C2細(xì)胞SIR損傷的影響，εV1-2濃度為10 μmol/L(已證實(shí)該濃度本身對SIR后細(xì)胞活力無明顯影響)。各組處理后將培養(yǎng)液棄掉，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，再加入100 μl無血清培養(yǎng)液和10 μl CCK-8檢測液，避光置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標(biāo)儀(波長為450 nm)檢測各孔OD值。

1.3.3 細(xì)胞凋亡的TUNEL法檢測 各組細(xì)胞處理后用PBS小心振蕩洗滌3遍， 5 min/次。用0.1%的Triton X-100打孔5 min后再用PBS洗滌3遍，5 min/次。按照TUNEL檢測試劑盒說明，將1號和2號液按照1∶9混合配制，避光37℃孵育1 h后用PBS振蕩洗滌3遍，5 min/次。DAPI染細(xì)胞核避光37℃孵育5 min，PBS振蕩洗滌3遍，5 min/次。激光掃描共聚焦顯微鏡照像。以發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)占藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)的百分比(%)表示細(xì)胞的凋亡率(apoptotic index)。

1.3.4 細(xì)胞中SOD活力及MDA含量檢測 各組處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，用PBS作為勻漿介質(zhì)破碎后離心取上清，按照南京建成生物公司檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測細(xì)胞中SOD活性及MDA含量。

1.3.5 Western blot法檢測細(xì)胞PKCε通路及相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化 ①細(xì)胞總蛋白的提取：各組細(xì)胞處理結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS小心洗滌1遍，用細(xì)胞刮刮下并收集細(xì)胞，加入含有PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟)的細(xì)胞裂解液，置于冰上作用30 min，隨后以12 000 r/min離心20 min，取上清液用BCA(Bicinchoninic Acid，二辛可酸)法測定蛋白濃度進(jìn)行蛋白定量，并調(diào)整至一致。②細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)蛋白的提?。簠⒄誘hermo公司質(zhì)膜分離試劑盒的方法進(jìn)行，分別提取H9C2細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜蛋白，用BCA方法測定蛋白濃度進(jìn)行蛋白定量，并調(diào)整至一致。各組蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別孵育在PKCε(1∶500)、gp91phox(1∶500)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、β-actin(1∶2000)中，4℃過夜孵育。TBST(Tris Buffered Saline,with Tween-20)洗脫3次后加入對應(yīng)1∶5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗脫3次，通過Bio-Rad照相系統(tǒng)采集照片，用Image Lab軟件對其進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，分別檢測胞膜PKCε、胞質(zhì)PKCε、gp91phox、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 Mel對SIR損傷后H9C2細(xì)胞活力、凋亡率的影響 與Con組相比，SIR處理顯著降低了H9C2細(xì)胞活力，且凋亡率明顯增加(P<0.05)，而Mel預(yù)處理顯著提高了SIR損傷后H9C2的細(xì)胞活力，且凋亡率明顯減少(P<0.05)。見圖1、、?。

2.2 Mel對SIR損傷后H9C2細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的影響 與Con組相比，SIR損傷后H9C2釋放的SOD的活性顯著下降，而MDA含量顯著上升(P<0.05)。給予Mel預(yù)處理后，一定程度上減少了SIR損傷后MDA的釋放，提高了SOD活性(P<0.05)。見圖1，。

2.3 Mel對SIR損傷后H9C2細(xì)胞PKCε蛋白及凋亡、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與Con組相比，SIR處理顯著降低了PKCε的膜轉(zhuǎn)位水平，同時降低了抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)了凋亡蛋白Bax、Caspase-3及氧化應(yīng)激標(biāo)志蛋白gp91phox表達(dá)(P<0.05)。與SIR組相比，Mel預(yù)處理顯著上調(diào)了PKCε的膜轉(zhuǎn)位水平，同時增加了抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，下調(diào)了凋亡蛋白Bax、Caspase-3及氧化應(yīng)激標(biāo)志蛋白gp91phox表達(dá)(P<0.05)。見圖2。

2.4 Mel與εV1-2共處理對SIR損傷后H9C2細(xì)胞的影響 給予PKCε阻斷劑后檢測細(xì)胞活力值發(fā)現(xiàn)，與Mel+SIR組相比，εV1-2+Mel+SIR組細(xì)胞活力顯著下降，凋亡率明顯增加(P<0.05)；并且細(xì)胞中MDA含量明顯增多，SOD活力顯著下降(P<0.05)。與SIR組相比，εV1-2+SIR組對H9C2細(xì)胞活力、凋亡率及細(xì)胞中MDA含量、SOD活力均沒有顯著影響(P>0.05)。見圖3。

2.5 Mel與εV1-2共處理對SIR損傷后H9C2細(xì)胞的影響 Western blot結(jié)果顯示：與Mel+SIR組相比，εV1-2+Mel+SIR組PKCε的膜轉(zhuǎn)位顯著下降，氧化應(yīng)激標(biāo)志蛋白gp91phox表達(dá)顯著增加(P<0.05)；同時抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降，凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)增加(P<0.05)。與SIR組相比，εV1-2+SIR組未引起各蛋白表達(dá)顯著變化(P>0.05)。見圖4。

3 討 論

缺血性心臟病嚴(yán)重危害人類的健康，其治療核心是重新恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)[4]，然而，在恢復(fù)血流再灌注后，早期缺血心肌損傷加重，引起更多心肌細(xì)胞凋亡，心肌梗死面積變大，進(jìn)一步損害心功能[7-8]。MI/RI損傷的機(jī)制復(fù)雜，鈣超載、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧自由基損傷、能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡自噬等均參與MI/RI損傷的發(fā)生發(fā)展過程[9-11]。其中氧化應(yīng)激損傷在MI/RI損傷中扮演重要角色。Mel是松果體分泌的一種吲哚類激素，研究發(fā)現(xiàn)Mel對心血管系統(tǒng)的生理和病理作用具有明確的調(diào)節(jié)作用，尤其是具有顯著抗MI/RI損傷的作用，且沒有外源性藥物的毒性和致突變性[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)Mel對MI/RI損傷和血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有明確的拮抗作用[12-13]。因此，有效抗MI/RI損傷的策略之一是減輕再灌注誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷。

PKC作為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要遞質(zhì)，迄今發(fā)現(xiàn)至少有12種以上的亞型。PKC在細(xì)胞內(nèi)分布為胞質(zhì)和胞膜兩部分，生理條件下胞質(zhì)PKC沒有活性，當(dāng)受到一定條件的刺激后，胞質(zhì)PKC轉(zhuǎn)位到胞膜，作為酶活化的標(biāo)志。其中，PKCε在眾多亞型中發(fā)揮抗心肌缺血損傷的作用很明顯。有研究報道，活化后的PKCε可由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜ATP依賴的鉀通道(K-ATP)的開放，從而減少M(fèi)I/RI[14]。另有研究稱激活的PKCε能維持線粒體功能，減少細(xì)胞死亡[15-16]。PKCε可被外膜移位酶20(TOMM20)和熱休克蛋白90(HSP90)誘導(dǎo)入線粒體，受G蛋白偶聯(lián)受體、Akt或活性氧簇等刺激，PKCε能直接促使細(xì)胞色素C氧化酶等磷酸化，減少缺血預(yù)適應(yīng)時ATP水解，保證呼吸鏈能量供應(yīng)[17]。并且該信號通路同Bax和Bcl-2凋亡信號通路密切相關(guān)，可增加Bcl-2/Bax比例，最終抑制凋亡的發(fā)生[18]。

注： *與Con組相比P<0.05；#與SIR組相比P<0.05；$與Mel+SIR組相比P<0.05；Bcl-2、Bax、Caspase-3、gp91phox各蛋白表達(dá)量均以β-actin作為內(nèi)參；PKCε轉(zhuǎn)位以胞膜蛋白表達(dá)量與胞質(zhì)蛋白表達(dá)量的比值為參照。圖2 Mel對SIR處理的H9C2細(xì)胞胞質(zhì)PKCε、胞膜PKCε、Bcl-2、Bax、Caspase-3、gp91phox等蛋白表達(dá)的影響

注： εV1-2+Mel+SIR：先阻斷PKCε通路后，再進(jìn)行藥物處理及模擬缺血再灌注損傷組；εV1-2+ SIR：單純阻斷PKCε通路后，進(jìn)行模擬缺血再灌注損傷組；εV1-2：PKCε特異性阻斷劑；#與SIR組相比P<0.05；$與Mel+SIR組相比P<0.05；&與εV1-2+Mel+SIR組相比P<0.05。圖3 εV1-2與Mel共處理對SIR處理后的H9C2細(xì)胞活力、凋亡率、SOD及MDA的影響

在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)H9C2細(xì)胞SIR處理后細(xì)胞活力下降，凋亡率增加，PKCε膜轉(zhuǎn)位減少，Bcl-2/Bax比例下調(diào)，Caspase-3、gp91phox蛋白表達(dá)量上升，細(xì)胞中MDA含量上升，SOD活性下降。Mel處理后可以逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)的發(fā)生，保護(hù)SIR損傷后的H9C2細(xì)胞。并且Mel的保護(hù)效應(yīng)可以被PKCε阻斷劑εV1-2抵消，進(jìn)一步肯定了PKCε信號通路介導(dǎo)Mel對H9C2細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上，本研究證實(shí)了Mel可以保護(hù)H9C2細(xì)胞抵抗MI/RI，其機(jī)制是激活PKCε保護(hù)性信號通路，減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制H9C2細(xì)胞的凋亡。

注： #與SIR組相比P<0.05；$與Mel+SIR組相比P<0.05；&與εV1-2+Mel+SIR組相比P<0.05；Bcl-2、Bax、Caspase-3、gp91phox各蛋白表達(dá)量均以β-actin作為內(nèi)參；PKCε轉(zhuǎn)位以胞膜蛋白表達(dá)量與胞質(zhì)蛋白表達(dá)量的比值為參照。圖4 εV1-2與Mel共處理對SIR處理后的H9C2細(xì)胞胞質(zhì)PKCε、胞膜PKCε、Bcl-2、Bax、Caspase-3、gp91phox等蛋白表達(dá)的影響

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Melatonin protects H9C2 cells against ischemia-reperfusion injury via protein kinase C epsilon signaling pathway

Zhang Bin, Zhai Meng-en, Li Bu-ying, Liu Zhen-hua, Chen Zheng-xi, Yu Peng-fei, Yu Li-ming,Liang Hong-liang, Duan Wei-xun, Jin Zhen-xiao, Yu Shi-qiang

DepartmentofCardiovascularSurgery，XijingHospital，F(xiàn)ourthMilitaryMedicalUniversity,Shaan’xiXi’an710032,China

YuShi-qiang,Email:yushiq@fmmu.edu.cn

Objective To investigate the underlying mechanisms of the protective effect of melatonin (Mel) on simulated ischemia/reperfusion (SIR) injury in H9C2 cells and the role of PKC epsilon (PKCε) signaling pathway in this process. Methods The cultured H9C2 cells were pretreated with Mel (100 μmol/L) for 12 h and then subjected to SIR (45 min ischemia, 4 h reperfusion). Cell viability and apoptotic index were detected by CCK-8 and TUNEL methods, and the intracellular malondialdehyde (MDA) content and superoxide dismutase (SOD) activity were assessed by specialized kits. The translocation of protein kinase C epsilon (PKCε) and the expression levels of Bcl-2, Bax, Caspase-3 and oxidative stress marker gp91phoxwere detected by Western blotting. PKCε specific inhibitor εV1-2 was used to study the role of PKCε in this process. Results We found that SIR treatment reduced cell viability and increased apoptotic index, inhibited PKCε translocation and reduced the Bcl-2/Bax ratio. Mel pretreatment significantly increased cell viability and reduced apoptotic index, down-regulated the MDA content and up-regulated the SOD activity. In addition, Mel pretreatment significantly increased PKCε translocation and Bcl-2/Bax ratio and decreased the expression levels of Caspase-3 and gp91phox. However, these protective effects of Mel mentioned above were largely abolished by εV1-2 administration. Conclusion Mel pretreatment may protects H9C2 cells against SIR injury via attenuating oxidative stress and apoptosis in a PKCε-dependent manner.

Melatonin; Ischemia reperfusion injury; Protein kinase C epsilon; Oxidative stress; Apoptosis

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.02.13

國家自然科學(xué)基金(81570230，81470415，81570231)

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科

俞世強(qiáng) Email: yushiq@fmmu.edu.cn

2017-02-14)

2017-03-22)