張曉陽，路麗明，李 欣

·臨床研究·

調(diào)節(jié)性T細胞和輔助性T細胞與體外循環(huán)后肺損傷相關(guān)性的研究

張曉陽，路麗明，李 欣

目的 研究臨床體外循環(huán)后出現(xiàn)不同程度肺損傷的患者的外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和輔助性T細胞17(Th17)分別占CD4+T細胞的比例、Treg/Th17比值以及Treg和Th17細胞相關(guān)的細胞因子水平的變化，并探討該現(xiàn)象的臨床意義。方法 選取56例在體外循環(huán)下行心臟瓣膜置換術(shù)或成形術(shù)的風(fēng)濕性心臟瓣膜病患者，收集入組患者術(shù)前的基本資料、術(shù)中體外循環(huán)情況，并抽取患者在麻醉誘導(dǎo)前(T1)、魚精蛋白中和后30 min(T2)以及進入ICU后24 h(T3)、術(shù)后第三天(T4)的外周血，通過流式細胞技術(shù)檢測不同時間點外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg和Th17細胞占CD4+T細胞的比例以及Treg/Th17的比值。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術(shù)檢測血漿中白介素(IL)-10和IL-17A水平；以入組患者進入ICU 24 h后的氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)將患者分為肺損傷無、輕、中三組。結(jié)果 相較于未發(fā)生或輕度肺損傷的患者，中度肺損傷組的患者T1和T2后的CD4+CD25+CD127lowTreg在CD4+T細胞中的比例較低(P=0.007，P=0.001)，麻醉誘導(dǎo)前的Treg/Th17的比例較低(P=0.001)，血漿中IL-17A濃度較高(P<0.001)。Pearson相關(guān)性分析顯示，T1和T2時的CD4+CD25+CD127lowTreg在CD4+T細胞中的比例與PaO2/FiO2成正比(r=0.428，P<0.02；r=0.549，P<0.001)。做T1和T2時的CD4+CD25+CD127lowTreg在CD4+T細胞中的比例和Treg/Th17比值與術(shù)后肺損傷的ROC曲線，結(jié)果顯示Treg T1的曲線下面積(AUC)為0.722(95%CI 0.557～0.888)，Treg T2的AUC為0.787(95%CI 0.639～0.934)，Treg/Th17 T1的AUC為0.751(95%CI 0.593～0.919)，P<0.05，Treg/TH17 T2的AVC為0.551(95%CI0.366～0.735，P=0.587)。結(jié)論 接受體外循環(huán)下心臟瓣膜替換術(shù)的患者，進入ICU 24 h時發(fā)生肺損傷程度越重，其T1以及T2外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細胞的比例越低，Treg/Th17比值越低，IL-17A濃度越高；但Th17占CD4+T細胞的比例與患者肺損傷程度沒有明顯相關(guān)性。筆者推測術(shù)前以及魚精蛋白中和30 min后的Treg比例及Treg/Th17比值降低能夠?qū)Ψ螕p傷的發(fā)生有潛在的預(yù)測意義。

體外循環(huán)；炎癥反應(yīng)；肺損傷；Treg細胞；Th17細胞

對于接受心臟外科體外循環(huán)患者，術(shù)后肺損傷是最常見的并發(fā)癥之一。體外循環(huán)后肺損傷發(fā)生的嚴重程度表現(xiàn)不一，從無明顯低氧，僅有炎性因子增高的亞臨床狀態(tài)到發(fā)生嚴重的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。雖然僅有2%～3%的患者發(fā)生ARDS，但是一旦發(fā)生，死亡率可高達15%～50%[1-2]。體外循環(huán)過程引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)和肺缺血再灌注損傷是術(shù)后發(fā)生肺部并發(fā)癥的兩大原因，其中炎癥反應(yīng)的激活以及級聯(lián)放大是最主要的原因。由于所有心臟輸出的血液均流經(jīng)肺臟，手術(shù)過程中缺血導(dǎo)致的肺血管內(nèi)皮損傷以及中性粒細胞在肺血管內(nèi)的聚集等原因，使肺成為對炎癥反應(yīng)最敏感的器官[2-3]。

隨著免疫學(xué)研究的深入，對于炎癥反應(yīng)的機制有了新的認識——炎癥反應(yīng)的嚴重程度與患者個體免疫應(yīng)答有著密切的關(guān)系，而患者機體促炎和抗炎反應(yīng)的平衡在炎癥反應(yīng)的進展中發(fā)揮重要作用。輔助性T細胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是兩個不同于Th1和Th2的CD4+T細胞亞群，在免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中是一對非常重要的相互制衡因素。在膿毒癥相關(guān)ARDS的研究中，重度肺損傷[氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)<100 mm Hg)]的患者表現(xiàn)有Th17/Treg的比例增高，但是機制不明確[4]。通常認為體外循環(huán)后和膿毒癥后肺損傷具有相似的發(fā)生機制[5]，本研究旨在觀察CD4+CD25+CD127lowTreg和Th17細胞對體外循環(huán)后肺損傷嚴重程度的相關(guān)性，同時探討二者在體外循環(huán)后肺損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2015年10月至2016年6月上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院心外科收治的56例風(fēng)濕性心臟病體外循環(huán)下行心臟瓣膜置換術(shù)或成形術(shù)的成年患者進行研究?；颊叩哪挲g33～74(57.78±11.29)歲，其中男性30人，女性26人。入組標準：風(fēng)濕性心臟病擬在體外循環(huán)下行心臟瓣膜置換術(shù)的患者，18≤年齡≤75歲，肺功能正常。排除標準：術(shù)前和術(shù)后24 h左室射血分數(shù)(LVEF)<35%，合并糖尿病、臟器功能不全、腫瘤或者免疫系統(tǒng)疾病，急診手術(shù)，感染急性期或合并冠狀動脈旁路移植術(shù)的患者。參照柏林標準[6]關(guān)于ARDS嚴重程度的分級標準對入組患者進行分組：PaO2/FiO2>300 mm Hg,無肺損傷；200 mm Hg < PaO2/FiO2≤ 300 mm Hg，輕度肺損傷；100 mm Hg < PaO2/FiO2≤ 200 mm Hg，中度肺損傷； PaO2/FiO2<100 mm Hg，重度肺損傷。根據(jù)進入ICU 24 h的氧合指數(shù)，患者被分為未發(fā)生、輕度和中度肺損傷三組。

1.2 體外循環(huán)方法 使用Stockert C5或S5型人工心肺機(意大利索林)，美敦力膜肺。淺低溫(33～35℃)，流量2.2～2.8 L /(min·m2)。開胸后全身肝素化(3 mg/kg)，體外循環(huán)過程中維持激活凝血時間(ACT)>480 s。采用高鉀含血停搏液。停機后按照1～1.5∶1以魚精蛋白中和肝素。

1.3 研究方法 分別在麻醉誘導(dǎo)前(T1)、魚精蛋白中和后30 min(T2)、進入ICU后24 h(T3)、術(shù)后第三天(T4)抽取患者外周血5 ml(肝素抗凝)，離心后將血漿-80℃保存用于ELISA檢測血漿中細胞因子白介素(IL)-10和IL-17A濃度。將剩余血液用Ficoll密度梯度離心分離單個核淋巴細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，調(diào)整PBMC密度值2×106/ml，用PBS洗滌后，重懸于RPMI1640(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和0.1%鏈霉素)。一半的PBMC加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)抗人CD3單克隆抗體(mAb)，APC抗人CD8mAb，PE抗人IL17AmAb，用流式細胞儀檢測Th17占CD4+T細胞的比例;另一半加入FITC抗人CD4mAb，PE抗人CD127mAb，APC抗人CD25mAb，用于檢測CD4+CD25+CD127lowTreg在CD4+T細胞的比例。

1.4 臨床數(shù)據(jù)收集 收集患者術(shù)前的基本資料，記錄術(shù)中體外循環(huán)時間、主動脈阻斷時間和輔助循環(huán)時間、體外循環(huán)中患者最低紅細胞比容(Hct)以及輸血情況，術(shù)后記錄患者的ICU停留時間，機械通氣時間，以及進入ICU后24 h患者的PaO2/FiO2。

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床基本資料組間比較 將發(fā)生三種不同程度肺損傷(無、輕、中)的患者術(shù)前的基本資料以及術(shù)中術(shù)后的情況進行比較，發(fā)現(xiàn)術(shù)前患者年齡越大(P=0.014)，LVEF越低(P=0.002)，患者術(shù)后發(fā)生肺損傷的程度越重。見表1。

2.2 CD4+CD25+CD127lowTreg和Th17細胞與術(shù)后肺損傷的相關(guān)性

2.2.1 不同時間點CD4+CD25+CD127lowTreg和Th17細胞比例組間比較 T1外周血的CD4+CD25+CD127lowTreg和T2的CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例增高，則患者術(shù)后的肺損傷表現(xiàn)較輕。同時發(fā)現(xiàn)，術(shù)前Treg/Th17較高的患者，術(shù)后肺損傷較輕。中度肺損傷組的血漿中的IL-17A濃度在術(shù)后明顯增高(表2)。

2.2.2 Treg和Th17相關(guān)細胞因子 通過ELISA測

得患者圍手術(shù)期CD4+CD25+CD127lowTreg和Th17細胞相關(guān)的細胞因子IL-10和IL-17含量變化(圖1)。發(fā)現(xiàn)：IL-10濃度在T2時明顯增高，隨后逐漸下降，在T4時基本下降至術(shù)前水平；同時發(fā)現(xiàn)IL-10濃度的增加和CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細胞的比例的增加是成正比的(r=0.349，P<0.037)。而IL-17濃度在術(shù)后呈緩慢上升。

圖1 患者不同時間點外周血中Treg和Th17細胞占 CD4+T細胞比例以及相關(guān)細胞因子濃度變化

2.2.3 相關(guān)性比較 將T1和T2的CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例和T4時的患者的PaO2/FiO2做Person相關(guān)性分析(圖2)，結(jié)果表明患者的Treg(T1,T2)與PaO2/FiO2成正比(r=0.428，P<0.02；r=0.549，P<0.001)。說明患者麻醉誘導(dǎo)前和魚精蛋白中和后的CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例越高，患者術(shù)后24 h肺功能越好。

表1 術(shù)后24 h肺損傷不同等級患者的組間比較±s)

注：BMI(body mass index)體重指數(shù)；EuroScoreⅡ：歐洲心臟手術(shù)風(fēng)險評分系統(tǒng)。

表2 Treg和Th17占比、比例及相關(guān)細胞因子濃度組間比較

注：與無肺損傷組比較*P<0.05。

圖2 CD4+CD25+CD127lowTreg(T1,T2)占CD4+T細胞的比例和進入ICU 24 h的PaO2/FiO2相關(guān)性

2.2.4 ROC曲線 繪制Treg(T1,T2)以及Treg/Th17(T1,T2)與肺損傷的ROC曲線(圖3)，得到相關(guān)的曲線下面積(area under the curve, AUC)。Treg(T1)為0.722(95%CI 0.557～0.888，P=0.005)，Treg(T2)為0.787(95%CI 0.639～0.934，P=0.002)，Treg/Th17(T1)為0.751(95%CI 0.593～0.909，P=0.007)，Treg/Th17(T2)為0.551(95%CI 0.366～0.735，P=0.587)。

圖3 CD4+CD25+CD127lowTreg和Th17細胞占CD4+T細胞的比例與肺損傷程度的ROC曲線

3 討 論

關(guān)于體外循環(huán)后肺損傷，已有的研究認為與體外循環(huán)直接相關(guān)的有兩種機制:炎癥反應(yīng)和缺血再灌注損傷[7]，兩者機制相互交聯(lián)。首先，體外循環(huán)引起的炎癥反應(yīng)的最主要的特點是在早期大量炎性細胞因子的釋放、補體系統(tǒng)的激活,引發(fā)了炎性細胞反應(yīng)級聯(lián)放大效應(yīng)，一方面造成肺泡上皮細胞水腫、血漿和蛋白質(zhì)間質(zhì)滲出以及肺毛細血管內(nèi)紅細胞、血漿和細胞碎片阻塞等；另一方面促使肺毛細血管床上皮細胞表達大量黏附分子，使中性粒細胞聚集在上皮細胞表面，活化的中性粒細胞通過釋放活性氧自由基和蛋白酶引起血管內(nèi)皮損傷繼而組織損傷。其次，由于肺在體外循環(huán)過程中處于相對缺血狀態(tài)，再灌注之后產(chǎn)生大量的活性氧自由基，進一步加劇炎癥反應(yīng)引起組織損傷。

免疫細胞通過對機體炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)在肺損傷的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。Treg細胞是CD4+T細胞的亞型之一，在健康人發(fā)揮免疫抑制及維持免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的作用[7]，而在一些自身免疫病[8]、炎癥性疾病[9]、腫瘤[10]等疾病中均發(fā)現(xiàn)Treg細胞數(shù)量和功能的異常。研究中常用外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞來代表具有功能的Treg，在健康人的外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細胞的(6.35±0.26)%。CD4+CD25+CD127lowTreg細胞通過細胞直接接觸或者釋放抗炎性的細胞介質(zhì)(如IL-10，轉(zhuǎn)化生長因子)來發(fā)揮免疫抑制作用[11]。筆者通過對體外循環(huán)患者進行研究發(fā)現(xiàn)，麻醉誘導(dǎo)前和魚精蛋白中和30 min后的CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例較高的患者，進入ICU后24 h的氧合指數(shù)也較高，結(jié)合之前的相關(guān)研究似乎可以推測CD4+CD25+CD127lowTreg對肺功能有一定的保護作用。同時根據(jù)CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例和肺損傷的ROC曲線表明，麻醉誘導(dǎo)前和魚精蛋白中和后30 min患者外周血Treg細胞比例的降低對于進入ICU后24 h的肺損傷的發(fā)生似乎有潛在的預(yù)測作用。D'Alessio等在急性肺損傷的小鼠和患者的肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)有Treg細胞的增高[12]。進一步研究證實，進入肺泡的Treg細胞可促進中性粒細胞的凋亡，同時增加抑炎的細胞因子的釋放，有利于局部炎癥的控制，在肺損傷中發(fā)揮保護性作用[13]。根據(jù)這些結(jié)果筆者推測術(shù)前自身的免疫抑制功能較強的患者，術(shù)后發(fā)生肺損傷的程度會降低。這似乎可以解釋為什么術(shù)前情況相似的患者經(jīng)歷了相同的手術(shù)過程，術(shù)后肺損傷發(fā)生的程度卻不同。但由于病例數(shù)有限，需要進一步實驗證實。

Th17細胞是一種具有促炎作用的CD4+T細胞，在很多研究中發(fā)現(xiàn)Th17細胞能夠?qū)共≡⑸锏那忠u，而在自身免疫性疾病和炎性疾病中起推動加劇作用[14]。Th17細胞主要通過分泌細胞因子IL-17來發(fā)揮作用。IL-17能促進促炎因子、趨化因子、金屬基質(zhì)蛋白酶的合成，造成局部組織因子浸潤，組織損傷；同時還參與中性粒細胞的增殖、趨化和成熟，促進樹突狀細胞的成熟，協(xié)同T細胞的活化，從而發(fā)揮促炎作用。有研究表明ARDS患者的肺泡灌洗液和外周血中IL-17A含量的增高和ARDS的嚴重程度呈正相關(guān)[15]。通過研究證實在ARDS[15]、哮喘[16]和慢性阻塞性肺病(COPD)[17]等急慢性炎癥性疾病中，IL-17A引起肺損傷與它促進大量中性粒細胞在氣道內(nèi)聚集密切相關(guān)[18]。在本實驗中筆者發(fā)現(xiàn)肺損傷嚴重的患者血漿中IL-17明顯增高，說明炎性細胞因子IL-17A在體外循環(huán)后肺損傷中同樣發(fā)揮重要作用。但是患者外周血中的IL-17A的濃度和Th17細胞的比例沒有相關(guān)性，IL-17A含量逐漸增加，而Th17細胞占CD4+T細胞的比例在術(shù)后減少。筆者推測由于IL-17A不僅由Th17細胞分泌，還有其它細胞比如γδT細胞、自噬細胞等[19]可以產(chǎn)生，所以Th17細胞在體外循環(huán)后造成的肺損傷中的作用有限。

CD4+CD25+CD127lowTreg和Th17細胞一個促進免疫耐受，一個促進免疫應(yīng)答，在功能上相互拮抗，而在分化上密切相關(guān)。Th17和CD4+CD25+CD127lowTreg細胞由初始CD4+T細胞接受不同信號刺激和細胞因子作用分化而來，在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化[20]。初始T淋巴細胞在TGF-β作用下誘導(dǎo)分化為CD4+CD25+CD127lowTreg，而在IL-6和TGF-β作用下初始T淋巴細胞被誘導(dǎo)分化為Th17，IL-23具有使Th17細胞功能維持和放大的作用。在生理狀態(tài)下CD4+CD25+CD127lowTreg和Th17維持著相對平衡。在炎性環(huán)境中，隨著外周細胞因子的含量變化，CD4+CD25+CD127lowTreg分化為分泌IL-17并且同時表達維A酸孤獨相關(guān)受體γt(RORγt)和叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3(FOXP3)的Th17細胞，而Th17也能分化為CD4+CD25+CD127lowTreg[21-22]， Treg/Th17的平衡會被打破。Treg/Th17的平衡在ARDS[4]以及腫瘤[23]等中起著重要作用。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)患者術(shù)前體內(nèi)CD4+CD25+CD127lowTreg細胞數(shù)量占優(yōu)勢時，術(shù)后發(fā)生肺損傷的程度會有所減輕。

綜上所述，作為免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，Treg細胞所介導(dǎo)的免疫抑制和Th17細胞所介導(dǎo)的免疫激活均參與了體外循環(huán)后肺損傷的發(fā)生和發(fā)展。在術(shù)后肺損傷較輕的患者體內(nèi)有較高的Treg細胞比例，在術(shù)后早期出現(xiàn)Treg細胞數(shù)量的增加，保護機體免受過度炎癥反應(yīng)帶來的損傷。但是關(guān)于兩種細胞在體外循環(huán)后肺損傷發(fā)生中的作用機制需要進一步研究。

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The relation between Treg/Th17 and lung injury in patients undergoing cardiopulmonary bypass

Zhang Xiao-yang, Lu Li-ming, Li Xin

ShanghaiChestHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200030,China

LiXin,E-mail:leex21@hotmail.com

Objective To observe the change of the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg and Th17 of CD4+T cells and the ratio of Treg/Th17 in patients who developed vary degree of lung injury after cardiopulmonary bypass during the perioperative period. Methods A total of 56 patients planned for the selected valves surgery were recruited in this study. Each patient's demographic as well perioperative laboratory and clinical data were collected. Patients' perioperative lab experiment results and variables including total bypass time, incubated time, length of intensive care unit stay, and PaO2/FiO2were also recorded. The blood samples were taken for the test of Treg and Th17 cells with flow cytometrybefore anesthetization(T1), 30min after heparin neutralization (T2)and at day 1(T3)and 3(T4) after surgery. The stored plasma was analyzed for IL-10 and IL-17Aby enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The patients were divided into three groups(no, mild, moderate lung injury) according to the oxygenation index at 24 hours after admissionto ICU. Results Compared with the no or mild lung injury groups, the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg and Th17 of CD4+T cells at T1 and T2 were lower(P=0.007,P=0.001), the ratio of Treg/Th17 at T1 was lower(P=0.001)and the concentration of IL-17A in the plasm was higher(P=0.001) in moderate lung injury group. The percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg of CD4+T cells at T1 and T2 was correlated with PaO2/FiO2(r=0.428,P<0.02；r=0.549,P<0.001). The area under the curve(AUC) of the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg of CD4+T cells and the ratio of Treg/Th17 at T1 and T2 was 0.722 (95%CI 0.557-0.888), 0.787(95%CI 0.639-0.934), 0.751(95%CI 0.593-0.919), 0.551(95%CI 0.366-0.735，P=0.587) respectively. Conclusions Severe lung injury at 24 h after valves replacement is associated with lower levelsof CD4+CD25+CD127 low Treg of CD4+T cells, decreased ratio of Treg/Th17 at T1 and T2 and higher concentration of IL-17A after surgery. But there is no significant relation between the level of Th17 cells with the degree of lung injury. We speculate decrease of the percentage of Treg in CD4+T cellsand the ratio of Treg/Th17 may be the potential predictors for lung injury aftercardiopulmonary bypass.

Cardiopulmonary bypass; Inflammatory response; Lung injury; Treg cell; Th17 cell

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.02.05

上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)類項目(09419966000)

200030 上海，上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院[張曉陽(研究生)]；200020 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海市免疫研究所 (路麗明)；200032 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心外科(李 欣)

李欣，E-mail: leex21@hotmail.com

2016-12-05)

2017-03-24)