于在林，富巖

更優(yōu)生物創(chuàng)新藥
——長效重組人血清白蛋白融合蛋白

于在林，富巖

更優(yōu)生物藥是指治療用生物制品蛋白質(zhì)藥物，其可通過生物藥經(jīng)化學(xué)分子修飾、或蛋白質(zhì)與小分子藥物化合價偶聯(lián)，形成新的物理結(jié)構(gòu)或改善構(gòu)象，或通過生物藥物與蛋白質(zhì)、生物藥物之間的基因融合以達(dá)到延長生物藥物在體內(nèi)半衰期、或達(dá)到生物藥物可定向作用于藥靶為目的所研制的創(chuàng)新生物藥。白蛋白與生物藥形成的融合蛋白，抗體、抗體片段（Fc）與生物藥形成的融合蛋白的研制都屬于更優(yōu)生物藥研發(fā)領(lǐng)域。生物藥基因融合形成二聚體融合蛋白，白蛋白-紫杉醇偶聯(lián)以及聚乙二醇修飾的生物藥則也可歸類于更優(yōu)生物藥，但它們不屬于藥物分子結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新，而是屬于化學(xué)修飾類藥物創(chuàng)新。

最為有發(fā)展前景之一的應(yīng)該是白蛋白作為藥物輸送載體平臺技術(shù)。主要可分為：由基因工程表達(dá)或血源的白蛋白與小分子化學(xué)藥物偶合形成藥物、與低分子量多肽或大分子蛋白質(zhì)藥物化學(xué)偶聯(lián)形成藥物、與小分子化合物、具生物活性蛋白質(zhì)共同封裝成納米顆粒藥物，以及更進(jìn)一步，低分子量多肽和大分子蛋白質(zhì)功能基因與白蛋白基因融合，形成重組白蛋白融合蛋白更優(yōu)生物創(chuàng)新藥（圖 1）[1-3]。為此，本文僅就該白蛋白融合蛋白領(lǐng)域的進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述（其他類別的更優(yōu)生物創(chuàng)新藥，例如 Fc 融合蛋白、化學(xué)修飾生物類似藥則不在本文贅述）。

1 白蛋白融合蛋白作為更優(yōu)生物創(chuàng)新藥發(fā)展的軌跡

人血清白蛋白在人體血液中為最大單一組分蛋白質(zhì)，血液中的含量約為 50 g/L，占血漿總蛋白的 40% ～ 60%，半衰期長達(dá) 20 d。白蛋白以其穩(wěn)定的惰性在人體血液中起著不可替代的血容量平衡、輸送維持生命物質(zhì)在血液中運(yùn)轉(zhuǎn)的載體功能外，近年來又在臨床治療藥物研發(fā)中扮演著越來越重要的角色。

依據(jù)白蛋白可在固體腫瘤中形成積累的基本原理，形成以白蛋白作為基礎(chǔ)的腫瘤靶向系統(tǒng)藥物遞送載體。臨床上，甲氨蝶呤-白蛋白共價結(jié)合藥物，白蛋白與多柔比星前體藥物，即阿霉素衍生物的偶聯(lián)藥物，以及白蛋白-紫杉醇納米顆粒已完成了臨床評價，被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌，年銷售額可達(dá) 10 億美元以上[3]；將一種治療性多肽或蛋白質(zhì)與白蛋白偶聯(lián)或以物理性吸附與白蛋白結(jié)合，可提高治療性多肽和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和大大延長藥物的半衰期；利用白蛋白作為注射用難溶性化學(xué)藥物的載體也獲得重視和研究[4]，已被應(yīng)用于鎮(zhèn)痛、降血糖、抗腫瘤、抗病毒活性藥物的研發(fā)。諾和諾德公司的胰島素十四酸衍生物偶聯(lián)到白蛋白多肽上的脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)，形成的新藥 Levemir 已被批準(zhǔn)用于糖尿病的治療，并且成為治療小兒糖尿病的特效藥物。

鑒于白蛋白是所有血液蛋白質(zhì)中半衰期最長，具有非糖基化、穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì)特征，開展與低分子量多肽和大分子蛋白質(zhì)基因融合，使得白蛋白作為嶄新的藥物長效化載體給藥系統(tǒng)的研究就非常具有理論上的可行性和實(shí)際的藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)價值。白蛋白融合蛋白由歐洲科學(xué)家率先報道，白蛋白-CD4 蛋白質(zhì)基因融合后在酵母菌中表達(dá)，用于 HIV 的抑制和治療[5]。2008 年石屹峰和邊蕾[6]，2015 年 Rogers等[7]分別以人血清白蛋白為載體的長效蛋白質(zhì)藥物研究進(jìn)展為題做出過綜述。本文就重組人血清白蛋白融合蛋白的研究內(nèi)容、研究方向、發(fā)展歷程、融合蛋白成藥性等做出進(jìn)一步的論述。

2000 年底美國人類基因組科學(xué)公司（HGS）以 1.2 億美元通過并購 Principa 公司獲得了長效化白蛋白融合蛋白藥物開發(fā)的權(quán)利。HGS 此后陸續(xù)提交了數(shù)十個相關(guān)的專利申請[8]。由此，長效化研發(fā)進(jìn)入實(shí)際的創(chuàng)新藥物研究新階段。1994 年，作者在美國費(fèi)城天普大學(xué)和湯姆斯杰弗遜大學(xué)醫(yī)學(xué)院主持蛋白質(zhì)表達(dá)實(shí)驗(yàn)室工作時獨(dú)立啟動了白蛋白融合蛋白用于表達(dá)人類基因產(chǎn)物的研究，隨后獲得美國湯姆斯杰弗遜大學(xué)專利技術(shù)實(shí)施授權(quán)書，獨(dú)立持有白蛋白融合蛋白相關(guān)發(fā)明和提交專利申請權(quán)和專利實(shí)施權(quán)利的所有權(quán)，并創(chuàng)辦美國福源集團(tuán)，作為發(fā)明人獨(dú)立開展“no-linker 白蛋白融合蛋白藥物長效化技術(shù)平臺”建設(shè)并形成完整的系列發(fā)明專利申請[9-19]，啟動了一系列白蛋白融合蛋白長效化創(chuàng)新藥的原創(chuàng)原研工作。

HGS 在 2004 年將具有長效作用的重組人血清白蛋白與 2 個串聯(lián)的修飾了第 8 位氨基酸的 GLP-1（glucagon like peptide-1，Ala8Gly）類似肽形成的胰高糖素類肽-12-白蛋白融合蛋白（阿必魯肽）藥物權(quán)利以 4.5 億美元許可給GSK 制藥集團(tuán)。2013 年 1 月，阿必魯肽完成了 2 型糖尿病患者為受試者的 III 期臨床試驗(yàn)研究，并于 2014 年3 月和 4 月分別獲得歐洲和美國 FDA 的市場銷售許可，成為世界上第一個獲得上市銷售許可的白蛋白融合蛋白創(chuàng)新藥。其凍干粉針劑，獨(dú)特的一次性包裝又賦予該新藥以創(chuàng)新制劑劑型，適于需要終身用藥的 2 型糖尿病患者自我注射給藥。每周 1 針的長效性，較市場上的暢銷藥利拉魯肽每天 1 針具有更為顯著的優(yōu)勢，成為真正的更優(yōu)生物創(chuàng)新藥的代表。

HGS 公司自接手 Principa 公司的白蛋白融合蛋白技術(shù)后繼續(xù)支持和開展白蛋白-干擾素 α2b 融合蛋白在丙型肝炎患者的臨床試驗(yàn)研究。2006 年 6 月完成具長效性重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白（rHSA/IFNα2b）的慢性病毒性丙型肝炎適應(yīng)證 II 期臨床試驗(yàn)研究并以 5.07 億美元許可給諾華制藥集團(tuán)。諾華在開展 rHSA/IFNα2b 的III 期臨床試驗(yàn)期間將啟動方案的給藥劑量由 1200 μg 降低為 900 μg，并于 2010 年順利完成 III 期臨床試驗(yàn)，成功達(dá)到該適應(yīng)證臨床試驗(yàn)評價的所有主要和次要終點(diǎn)。諾華向 EMA 和 FDA 分別提交市場準(zhǔn)入申請，同年 3 月諾華制藥集團(tuán)負(fù)責(zé)專利實(shí)施許可律師向天津溥瀛生物技術(shù)有限公司發(fā)出希望獲得中國發(fā)明專利（公開號：CN1583795A，即中國發(fā)明專利號：ZL200410042814.8）的全球?qū)＠麑?shí)施許可的律師函。

2005 年 12 月杭州九源基因工程有限公司與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院合作獲得中國藥監(jiān)局的《藥物臨床試驗(yàn)批件》，批準(zhǔn)直接開展“重組人血清白蛋白-干擾素 α2b 融合蛋白注射液”的 I 期和 II 期臨床試驗(yàn)。在該融合蛋白的分子結(jié)構(gòu)中，白蛋白與干擾素 α2b 兩個蛋白質(zhì)之間額外設(shè)有 1 個連接肽。2006 年 3 月 – 2008 年 9 月完成了在健康人作為受試者的單次和多次給藥的 I 期臨床試驗(yàn)研究，隨后開展和完成了慢性病毒性乙型肝炎適應(yīng)證的 II 期臨床試驗(yàn)研究工作。

圖 1 重組人血清白蛋白融合蛋白技術(shù)平臺用于研發(fā)更優(yōu)生物創(chuàng)新藥的優(yōu)勢及特點(diǎn)

Novozyme 公司在 2008 年將白蛋白技術(shù)特別許可給美國 CSL Behring 公司，開展白蛋白與各種凝血因子形成的一系列融合蛋白藥物的研究。CSL Behring 公司在 2016年 2 月成功完成注射用重組人血清白蛋白/凝血因子-IX融合蛋白在 91 例血友病 B 患者（先天缺乏凝血因子-IX）作為受試者的臨床試驗(yàn)后，隨即獲得美國 FDA 批準(zhǔn)該創(chuàng)新藥的上市銷售。為需終身用藥的血友病 B 兒童和成人患者預(yù)防或控制出血和減低出血發(fā)作的頻數(shù)提供了每周給藥1 次就可獲得更好療效的藥物（現(xiàn)有藥物需要每天給藥）。該新藥成為另一個更優(yōu)生物創(chuàng)新藥的成功案例。

HGS 公司在 2008 年 1 月 22 日將擁有長效重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）的分拆公司 Cogenesys 公司整體作價 4 億美元賣給了 Teva制藥集團(tuán)。2013 年順利完成臨床試驗(yàn) III 期研究，向歐洲EMA 和美國 FDA 分別提交了市場準(zhǔn)入申請。2013 年5 月美國福源集團(tuán)在中國的子公司天津溥瀛生物技術(shù)有限公司和北京美福源生物醫(yī)藥科技有限公司與美國發(fā)明專利US7,422,833 的發(fā)明人于在林和富巖共同達(dá)成數(shù)千萬人民幣的“非獨(dú)家”專利實(shí)施許可授權(quán)。協(xié)議約定許可 Teva 在美國及其屬地生產(chǎn)銷售創(chuàng)新藥 rHSA/GCSF，但不得進(jìn)入中國；同時不影響專利人在中國獨(dú)立原創(chuàng)原研的“注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白”創(chuàng)新藥 2 年后進(jìn)入美國開展臨床試驗(yàn)和生產(chǎn)銷售的權(quán)利。

天津溥瀛生物技術(shù)有限公司在 2009 年 10 月向國家藥監(jiān)局提交了“注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白”的治療用生物制品國家 1 類創(chuàng)新藥的臨床試驗(yàn)注冊申請。2011 年10 月獲得《藥物臨床試驗(yàn)批件》；2010年又提交了“注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白”的臨床試驗(yàn)注冊申請；2012 年獲得《藥物臨床試驗(yàn)許可批件》；2012 年又通過北京美福源生物醫(yī)藥科技有限公司提交了“注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白”的臨床試驗(yàn)注冊申請，2015 年 9 月獲得《藥物臨床試驗(yàn)批件》。2016 年 7 月天津溥瀛生物技術(shù)有限公司提交了“注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白”治療用生物制品國家 1 類創(chuàng)新藥的臨床注冊申請，獲得受理通知書。美國福源集團(tuán)將白蛋白融合蛋白在中國的創(chuàng)新藥研發(fā)業(yè)務(wù)完整轉(zhuǎn)移給中美福源生物技術(shù)（北京）有限公司。天津福盈生物制藥有限公司在天津計(jì)劃投資 2 億元，啟動了“注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白”的 GMP生產(chǎn)基地一期建設(shè)。2015 年天津溥瀛生物技術(shù)有限公司獲得天津市科委認(rèn)定成立了中國第一個“天津市長效重組融合蛋白企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”，專業(yè)從事重組人血清白蛋白融合蛋白創(chuàng)新藥原創(chuàng)原研工作。

HGS 公司在 2014 年以 160 億美元價格整體從納斯達(dá)克退市，由 GSK 制藥集團(tuán)私有化。糖尿病藥物重組人血清白蛋白/GLP-1 融合蛋白的后續(xù)市場分成和 HGS 其他創(chuàng)新藥品種（非白蛋白融合蛋白）權(quán)利一并轉(zhuǎn)移給 GSK 所有。由此看來 HGS 公司和美國福源集團(tuán)分別與相關(guān)藥企藥物品種合作和企業(yè)間并購重組，都使得白蛋白融合蛋白創(chuàng)新藥研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化有了做大做強(qiáng)的可能，也成為更優(yōu)生物創(chuàng)新藥研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的趨勢。

圖 2 GSK 公司上市銷售的 Tanzeum 一次性皮下給藥注射用凍干粉針劑產(chǎn)品包裝示意圖

2 白蛋白融合蛋白創(chuàng)新藥主要品種

2.1 注射用重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽-1 融合蛋白

當(dāng)人體血液中的糖含量維持高水平而不能被正常代謝的現(xiàn)象，稱為高血糖癥，是 2 型糖尿病患者的典型癥狀。全球有至少 2 億名 2 型糖尿病患者。為控制高血糖，患者需要終身用藥。GLP-1 由胰高血糖素原基因表達(dá)，在胰島α 細(xì)胞中，胰高血糖素原基因的主要表達(dá)產(chǎn)物是胰高血糖素肽。而在腸黏膜的 L 細(xì)胞中，前激素轉(zhuǎn)換酶（PC1）將胰高血糖素原剪切為其羧基端的肽鏈序列，即 GLP-1。GLP-1有兩種生物活性形式，分別為 GLP-1(7-37)和 GLP-1(7-36)，兩者僅有一個氨基酸序列不同，GLP-1 約 80% 的生物活性來自 GLP-1(7-36)。GLP-1 具有葡萄糖濃度依賴性降糖作用，即只有在血糖水平升高的情況下，GLP-1 才發(fā)揮降糖作用，而在血糖水平正常時，則不會使其進(jìn)一步降低。GLP-1 的這種葡萄糖濃度依賴性降糖特性是其臨床應(yīng)用安全性的基礎(chǔ)與保障，從而免除了人們對現(xiàn)有糖尿病治療藥物及方案可能造成患者嚴(yán)重低血糖的擔(dān)心。多種 GLP-1 相關(guān)蛋白質(zhì)藥物的開發(fā)受到極大重視。

白蛋白與 GLP-1 融合蛋白是 HGS 公司開展的一系列長效重組人血清白蛋白融合蛋白中的一個。其藥物分子結(jié)構(gòu)是將 GLP-1 的第 8 位氨基酸突變（8Gly）后串聯(lián)，直接融合在人血清白蛋白成熟肽的 N-端。在 S.cerevisiae 酵母菌中表達(dá)分泌，經(jīng)分離純化得到阿必魯肽。在 2012 年4 月 3 日，GSK 公司公開阿必魯肽于 2 型糖尿病患者中進(jìn)行的 52 周 8 項(xiàng) III 期臨床試驗(yàn)結(jié)果。此 8 項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果系以餐前用藥的長效胰島素、每天 1 針的利拉魯肽等作為對照用藥，實(shí)現(xiàn)了非劣性的臨床終點(diǎn)。2014 年 3 月和4 月注射用重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽-1 融合蛋白（商品名：Tanzeum）分別獲得 EMA 和 FDA 的批準(zhǔn)，可在歐洲和美國上市銷售。阿必魯肽是一種 GLP-1 受體激動劑，臨床上適用 2 型糖尿病成年患者血糖控制。這是世界上第一個被批準(zhǔn)的白蛋白融合蛋白長效化蛋白質(zhì)創(chuàng)新藥物，劑型為凍干粉針劑，規(guī)格有 30 和 50 mg/支，均為凍干粉和注射用水分別裝填成型在 1 個一次性注射器上（圖 2），設(shè)計(jì)新穎，十分便于患者自己給藥。而每周 1 針又大大優(yōu)于現(xiàn)有市場銷售中的每天 1 針的利拉魯肽，成為真正意義的更優(yōu)創(chuàng)新生物藥典范。

鑒于人源（內(nèi)源性）的 GLP-1 多肽在人體的半衰期極為短暫（1.5 ～ 2 min），市場上已經(jīng)成藥的 GLP-1都是經(jīng)過氨基酸變異為類似肽。通過氨基酸改構(gòu)可延長 GLP-1 在體內(nèi)的降糖功能，其中，利拉魯肽通過改構(gòu)，半衰期可達(dá) 13 h。國內(nèi)數(shù)個大學(xué)和研究所都投入精力開展了白蛋白和 GLP-1融合蛋白的研究[24-28]。江蘇泰康生物醫(yī)藥科技有限公司2013 年 8 月提交 rGLP-1/HSA 融合蛋白臨床試驗(yàn)申報；中美福源生物技術(shù)（北京）股份有限公司正在開展重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白的臨床前研究工作，子公司北京美福源生物醫(yī)藥科技有限公司提交了“具持續(xù)控制血糖濃度功能的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白”[29]發(fā)明專利申請，描述了 3 種不同結(jié)構(gòu)的白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白（圖 3），分別是 r(GLP-1)2/HSA、rHSA/(GLP-1)2和 (GLP-1)2/HSA/(GLP-1)2。在人血清白蛋白成熟肽的 N 端和 C 端分別各有 1 個串聯(lián)的 GLP-1（7-36，Ala8Gly）類肽，該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示出比阿必魯肽（每周給藥 1 次，劑量為 30 ～ 50 mg/針）具有更優(yōu)的血液半衰期（2 周給藥 1 次）或者每周 1 次但可使用更低的劑量（15 ～ 25 mg/針）。

幾乎所有 GLP-1 類似物藥物還都具有抑制體重和減肥的功效。接受 GLP-1 類似物治療組與陽性對照藥胰島素、胰島素類似物藥物相比，體重一般減輕 20% 左右，這也是胰高糖素類肽藥物的一大亮點(diǎn)。因此，重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白每 2 周給藥 1 次將具有極為顯著的臨床優(yōu)勢，成為更優(yōu)生物創(chuàng)新藥的代表。

2.2 重組人血清白蛋白/凝血因子-IX 融合蛋白

美國 CSL Behring 公司專業(yè)從事血液相關(guān)因子藥物的研發(fā)和生產(chǎn)銷售。在獲得 Novozyme 的血液因子相關(guān)的白蛋白融合技術(shù)許可后，針對多種凝血因子開展重組人血清白蛋白/凝血因子 VIIa 融合蛋白、凝血因子-VIII 融合蛋白以及白蛋白/凝血因子-IX 融合蛋白長效化的研究[30]。商品名Idelvion 則是該公司在世界上第一個被批準(zhǔn)的凝血因子類的注射用重組人血清白蛋白/凝血因子-IX 融合蛋白產(chǎn)品，這也是世界上首個使用 CHO 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)和制備并上市銷售的創(chuàng)新藥。適用于患有血友病 B 的兒童和成年人（先天性凝血因子-IX 缺乏）：①出血發(fā)作的按需控制和預(yù)防；②出血的圍手術(shù)處理；③常規(guī)預(yù)防或減少出血發(fā)作的頻數(shù)。Idelvion 不適用那些有免疫耐受性誘導(dǎo)型的血友病B 患者。給藥方法為凍干粉復(fù)溶后經(jīng)靜脈給藥。CSL 公司正在開展其他數(shù)個凝血因子的白蛋白融合蛋白長效化創(chuàng)新藥研發(fā)。預(yù)計(jì)還將有血友病 A 治療和預(yù)防用藥白蛋白-凝血因子-VIII 融合蛋白創(chuàng)新藥也將陸續(xù)完成臨床試驗(yàn)進(jìn)入市場準(zhǔn)入申報階段。

在國內(nèi)也已經(jīng)有數(shù)家制藥企業(yè)投入到血液因子的長效藥研發(fā)中。中美福源生物技術(shù)（北京）股份有限公司子公司天津溥瀛生物技術(shù)有限公司利用自有知識產(chǎn)權(quán)和白蛋白融合蛋白專利技術(shù)平臺，已經(jīng)啟動了包括注射用重組人血清白蛋白/凝血因子-VIII 融合蛋白和注射用重組人血清白蛋白/凝血因子-IX 融合蛋白創(chuàng)新藥在內(nèi)的臨床前研究。

2.3 重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白

重組粒細(xì)胞刺激因子 2010 年的全球銷售額大于 50 億美元，美國市場產(chǎn)品主要是 Amgen 公司的 Neupogen?和Neulasta?，以及 Schering AG 的 Leukine?。由 HGS 公司啟動注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）的臨床前研究，發(fā)表了在鼠和獼猴中的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)研究[31]。2007 年 1 月 HGS 的分拆公司 CoGenesys（僅擁有 rHSA/GCSF 融合蛋白單一在研新藥）在歐洲啟動了命名為 Neugranin 的注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白的 I-IIa 期臨床試驗(yàn)。隨即對入組的 60 例乳腺癌患者開展多中心雙盲的安全性和清除速率研究。2008 年 Teva Pharmaceutic（在 HGS 被 GSK私有化之前），以 4 億美元收購了 CoGenesys 公司后，又將 Neugranin 繼續(xù)帶入和成功完成臨床 II 期和 III 期試驗(yàn)，獲得與陽性對照藥 Neulasta（PEG 化 G-CSF）幾乎完全相同的臨床試驗(yàn)療效[32-34]，并且適用于兒童。

Teva 公司于 2013 年分別向歐洲和美國申請市場準(zhǔn)入許可，商品名 Balugrastim。2014 年 Volovat 等[35]公布了 III期臨床試驗(yàn)研究結(jié)果，獲得非劣于 PEG-G-CSF 陽性對照藥的臨床療效和安全性。Pfeil 等[36]于 2015 年詳細(xì)比較了白蛋白融合蛋白 G-CSF 和 PEG 化 G-CSF 在臨床上的有效性和安全性。

圖 3 更優(yōu)生物創(chuàng)新藥胰高糖素類肽藥物分子結(jié)構(gòu)[29][A：人血清白蛋白（HSA）；B：阿必魯肽，串聯(lián)的 (GLP-1)2處于 HSA的 N 端；C：新藥物分子結(jié)構(gòu)，串聯(lián)的 (GLP-1)2處于 HSA 的 C 末端；D：新的藥物分子結(jié)構(gòu)在 HSA 成熟肽的 N 端和 C 端都各有 1 個串聯(lián)的 (GLP-1)2]

美國福源集團(tuán)的白蛋白融合蛋白技術(shù)在 2002 年完成重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白表達(dá)酵母工程菌基因構(gòu)建，在中國的全資公司陸續(xù)開展成藥性研究、藥學(xué)研究和臨床前動物實(shí)驗(yàn)研究[37-38]。2009 年天津溥瀛生物技術(shù)有限公司申報原創(chuàng)原研的新藥“注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白”注冊申請。2011 年獲得CFDA 批準(zhǔn)開展 I ～ II 期臨床試驗(yàn)的許可批件。目前正在II 期臨床試驗(yàn)階段。

江蘇泰康生物醫(yī)藥有限公司將人血清白蛋白與突變了1 個氨基酸后的人 G-CSF 形成了融合蛋白。2014 年 12 月完成了 50、150、300、400、500、600 μg/kg 供試藥劑量組（即相當(dāng)于 60 kg 體重給藥劑量 3、9、18、24、30、36 mg）單次給藥的 I 期臨床試驗(yàn)。

2.4 重組人血清白蛋白/干擾素 α 融合蛋白

由 HGS 公司率先啟動的注射用重組人血清白蛋白/干擾素-α2b 融合蛋白（rHSA/IFNα2a 和 rHSA/IFNα2b）治療慢性病毒性丙型肝炎適應(yīng)證的臨床試驗(yàn)，2002 年以 5.07 億美元許可給諾華制藥集團(tuán)。2010 年成功完成了針對丙型肝炎患者的 III 期臨床試驗(yàn)，900 μg 劑量組每 2 周給藥1 次，所有指標(biāo)均優(yōu)于每周給藥 1 次的陽性對照藥美國羅氏制藥集團(tuán)的派羅欣（Pegasys，PEG 化干擾素 α2a）[39-40]。Subramanian 等[40]2007 在 Nature Biotechology 上撰文以圖 4 展示了白蛋白融合蛋白優(yōu)勢。2010 年申報市場準(zhǔn)入后，歐洲和美國均針對該臨床 III 期方案和劑量安全性的問題提出疑問，要求補(bǔ)充資料說明。這源于在開展 III 臨床試驗(yàn)方案中是供試藥以 1200 μg 每 2 周給藥 1 次和陽性對照藥派羅欣每周給藥 1 次進(jìn)行比較，在入組 1/3 的受試者后供試藥出現(xiàn) 1 例 SAE（嚴(yán)重不良事件）；隨后研究者為了滿足安全性的要求，將給藥劑量降低到 900 μg 劑量，完成了 III 期臨床試驗(yàn)，獲得了 900 μg 劑量 2 周給藥 1 次非劣于陽性對照藥的結(jié)果。但對比 II 期臨床試驗(yàn)中的900 μg 與 600 μg 劑量組在 2 周給藥 1 次與陽性對照藥派羅欣的 1 周給藥 1 次，在藥效和安全性指標(biāo)無顯著差異。那么因?yàn)榘踩远鴮⒔o藥劑量從 1200 μg下降到 900 μg，是否 600 μg 的給藥劑量在滿足療效的前提下，安全性會更優(yōu)于 900 μg劑量？理論上這時應(yīng)再有一個 600 μg 劑量的受試者樣本放大的臨床試驗(yàn)（III 期），補(bǔ)充試驗(yàn)比較其與900 μg 劑量的有效性和安全性。此時，美國吉利德公司的丙肝口服片劑小分子新藥 Silvefa 已經(jīng)接近完成 III 期臨床試驗(yàn)，公開的數(shù)據(jù)顯示了其具成藥性，并且其是丙肝可治愈新藥。諾華制藥集團(tuán)如果重新啟動新的臨床試驗(yàn)，預(yù)計(jì)需要 2 年完成，在時間上，也正是吉利德丙肝新藥上市之時。這樣在丙肝適應(yīng)證的治療療效上，就不具有可比優(yōu)勢，為此不得不放棄提交補(bǔ)充資料，放棄爭取上市銷售的機(jī)會。

需要指出的是，2010 年 4 月諾華制藥集團(tuán)給天津溥瀛生物技術(shù)有限公司發(fā)出了律師函請求獲得其擁有的中國發(fā)明專利（公開號：CN1583795A）的實(shí)施許可授權(quán)。其后由于諾華放棄長效重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白上市申請后，雙方停止了在丙肝適應(yīng)證上的專利實(shí)施許可授權(quán)談判。但雙方表達(dá)了希望今后能繼續(xù)尋求在慢性病毒性乙型肝炎這個適應(yīng)證上的合作。其依據(jù)是作為重大感染性疾病，慢性病毒性乙型肝炎（DNA 病毒）在中國的發(fā)生率和需要藥物治療的患者數(shù)量幾近上億，是個重大人類疾病適應(yīng)證而決定的。

杭州九源生物工程有限公司在 2004 年申報了“重組人血清白蛋白-干擾素 α2b 融合蛋白注射液”的臨床試驗(yàn)注冊，申報的臨床適應(yīng)證是慢性病毒性乙型肝炎。2005 年獲得藥物臨床試驗(yàn) I-II 期批件。2005 年底進(jìn)入臨床試驗(yàn)，并由徐道振和謝堯教授主持開展和完成了臨床 I 期和II 期研究，但未能獲得臨床 III 期許可。

作者帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)在世界上率先開展了“注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白”的臨床前研究[11,13,41-42]，2012 年獲得臨床試驗(yàn)許可批件。現(xiàn)在已經(jīng)完成“在健康志愿者中單次給藥、劑量遞增的耐受性、藥代動力學(xué)和藥效學(xué)臨床試驗(yàn)”的 Ia 期臨床研究和“評價注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白多劑量的單次和多次給藥在慢性乙型肝炎患者中的耐受性、藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的單中心、隨機(jī)、陽性對照的 Ib 期臨床試驗(yàn)”。2015 年“注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白”也獲得CFDA 批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，現(xiàn)結(jié)束了臨床 Ia 期健康人為受試者的研究階段，正開展乙型肝炎患者的單次和多次給藥在慢性乙型肝炎患者中的耐受性、藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的單中心、隨機(jī)、陽性對照的 Ib 期臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)中的對照藥采用的是美國羅氏公司的派羅欣。

齊魯制藥有限公司和中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2014 年獲得藥物臨床試驗(yàn)批件，共同開展了重組人血清白蛋白-干擾素 α2a 融合蛋白注射液單次給藥、劑量遞增的耐受性、藥動學(xué)和藥效學(xué) Ia 期臨床試驗(yàn)。

2.5 注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白

于在林 2002 年提交了重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白（rHSA/EPO）的創(chuàng)新分子結(jié)構(gòu)及用途的美國發(fā)明專利申請[9]，其后又在中國提交了發(fā)明專利申請[10]。中國發(fā)明專利在 2006 年獲得授權(quán)，美國發(fā)明專利申請則于 2008 年獲得授權(quán)[12]。利用 CHO 細(xì)胞表達(dá)和制備“不設(shè)有連接肽”的重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白，經(jīng)過 10 余年的研究，2016 年 7 月完成了詳盡的臨床前藥學(xué)研究[43]和動物藥效學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)的藥效學(xué)和安全評價研究[44]，提交了創(chuàng)新藥臨床注冊申請，獲得了 CFDA 新藥注冊申報受理通知書。國內(nèi)和韓國的科學(xué)家也在文獻(xiàn)中公開報道構(gòu)建重組人血清白蛋白-促紅素融合蛋白的研究結(jié)果，但他們都是在人血清白蛋白與促紅素蛋白質(zhì)之間設(shè)有一個長度不等的氨基酸連接肽，構(gòu)成白蛋白-促紅素融合蛋白[45-47]。本文作者的研究表明設(shè)有這個連接肽是沒有必要的，在臨床上很可能會帶來較為潛在的免疫原性反應(yīng)，但卻回避了作者在先公開的 no-linker 白蛋白-促紅素融合蛋白的發(fā)明專利。

2.6 正在臨床前研究階段的幾個具有成藥性的注射用重組人血清白蛋白融合蛋白

2.6.1 重組人血清白蛋白/生長激素融合蛋白 美國 HGS公司 2002 年報道了在大鼠和猴中開展的重組人血清白蛋白/生長激素融合蛋白（albutropin，rHSA/GH）藥代動力學(xué)和藥效學(xué)研究。與重組人生長激素相比，albutropin 皮下注射給藥大鼠后，血漿半衰期增加了 4 倍；清除率降低了2 倍。皮下注射給藥猴（0.3 mg/kg），則在血漿半衰期延長6 倍，血液清除率下降了 8 倍。單次皮下注射給藥albutropin（0.3、1.5、4 mg/kg）后，增加血液中的胰島素生長因子（IGF-1）水平長達(dá) 7 d。連續(xù) 7 d 每天給藥 rhGH（0.3 mg/kg）與單次給藥 albutropin（4 mg/kg）誘導(dǎo)增加的IGF-1 水平相當(dāng)。Albutropin 以 1 ～ 20 μg/(kg·d)，隔天或每4 天給藥一次都能與相當(dāng)分子摩爾劑量的 rhGH 相同，可顯著增加大鼠體重和增加切除垂體的大鼠脛骨骨骺生長板的寬度[48]。天津溥瀛生物技術(shù)有限公司與中美福源生物技術(shù)（北京）股份有限公司的重組人血清白蛋白/生長激素融合蛋白已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究階段。國內(nèi)其他研究者也獲得了相近的研究結(jié)果[49-50]。

2.6.2 重組人血清白蛋白/白介素-11 融合蛋白 作者研究發(fā)明的人血清白蛋白和白介素-11（rHSA/IL-11）兩個蛋白質(zhì)之間不設(shè)有連接肽的融合蛋白分子結(jié)構(gòu)獲得了中國和美國發(fā)明專利授權(quán)[10,16]，目前正在臨床前試驗(yàn)階段。江南大學(xué)也開展了重組人血清白蛋白/白介素-11 融合蛋白的研究[51]。

2.6.3 重組人血清白蛋白/尿酸氧化酶融合蛋白 作者正在開展臨床前研究工作的重組人血清白蛋白/尿酸氧化酶融合蛋白（rHSA/UO）中的尿酸氧化酶為來自酵母菌的尿酸氧化酶基因和修飾后的人源尿酸氧化酶。初步的臨床前研究工作顯示來自酵母菌的尿酸氧化酶生物活性要顯著高于人源尿酸氧化酶。由此，進(jìn)入臨床前動物實(shí)驗(yàn)安全性評價工作，較大可能是使用來自酵母菌的尿酸氧化酶。

2.6.4 重組人血清白蛋白/白介素-2 融合蛋白 作者研究發(fā)明的人血清白蛋白和白介素-2（rHSA/IL-2）兩個蛋白質(zhì)之間不設(shè)有連接肽的融合蛋白分子結(jié)構(gòu)獲得了中國和美國發(fā)明專利授權(quán)[10]。在人血清白蛋白和白介素-2 中間設(shè)有連接肽的重組融合蛋白則由軍科院提交了中國發(fā)明專利申請和獲得授權(quán)[52]。金光澤等[53]將人血清白蛋白與人白介素-2基因 DNA 序列給予突變后（C125A；半胱氨酸 125 丙氨酸）直接連接，之間不設(shè)有連接肽，獲得在畢赤酵母中較好的表達(dá)量和融合蛋白具有典型的 IL-42 生物活性。

2.7 重組人血清白蛋白/皮膚生長因子融合蛋白外用藥和滴眼液的研究

作者首先公開了重組人血清白蛋白融合蛋白作為藥物的外用給藥的可能性研究工作，試驗(yàn)驗(yàn)證了含有人血清白蛋白（HSA）與多種不同的人皮膚細(xì)胞生長因子，如表皮生長因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、角質(zhì)細(xì)胞生長因（KGF）、血小板衍生因子（PDGF）、類胰島素生長因子（IGF）等，形成的融合蛋白所構(gòu)成的各種護(hù)膚品，具有比僅含有細(xì)胞生長因子單體、或僅含有人血清白蛋白的護(hù)膚品有更好的使用效果。融合后的細(xì)胞因子在體內(nèi)和體外具有更長的半衰期和更好的持續(xù)作用效果。當(dāng)復(fù)合使用由 HSA 和不同生長因子形成的融合蛋白（HSA/GF）組合構(gòu)成的護(hù)膚品，可具有同時刺激多種皮膚細(xì)胞的修復(fù)和具協(xié)同增效作用。這種新型的護(hù)膚品廣泛應(yīng)用在保健、美容、除皺、祛斑、增白和創(chuàng)傷或燒傷的治療[15,54-61]。

世界上第一個在植物（煙草）中獲得高效表達(dá)的重組人血清白蛋白融合蛋白是重組人血清白蛋白/表皮生長因子融合蛋白（rHSA/EGF），由韓國科學(xué)家在 2006 年通過美國發(fā)明專利申請公開[62]。

2.8 重組人血清白蛋白融合蛋白口服制劑的研究

口服給藥因給藥方便而依從度高，成為一種最理想的給藥方式。但是蛋白質(zhì)藥物經(jīng)口服給藥的生物利用度不高。本文作者開展了尋找適宜于重組人血清白蛋白融合蛋白的口服制劑配方的拓展性研究，達(dá)到更方便使用，成本低廉的制劑形式，獲得有益的改善人體健康狀態(tài)形成新的保健產(chǎn)品和具有臨床療效的新藥物制劑[63]。特別是不以臨床上治療所要求的“要嚴(yán)格確認(rèn)進(jìn)入血液系統(tǒng)的藥物劑量”的情況下，口服融合蛋白可以達(dá)到改善身體狀態(tài)，微調(diào)身體機(jī)能的目的?？诜苿┡浞街兄亟M人血清白蛋白融合蛋白含量可為1% ～ 5%。制劑產(chǎn)品形式可以是口腔含片，置于舌下溶解和吸收；也可以人工或機(jī)械方式灌注腸溶膠囊中，經(jīng)口服進(jìn)入食道、胃最終進(jìn)入小腸中溶解、釋放和吸收。初步的實(shí)驗(yàn)證明重組人血清白蛋白融合蛋白（分子量大于 70 kD）這種大分子蛋白質(zhì)能經(jīng)由特定的制劑，如同小分子代表多肽一樣，通過口服進(jìn)入體內(nèi)血液循環(huán)系統(tǒng)，顯示出相應(yīng)的生物活性功能?？诜苿┙?jīng)口服給予（藥）動物后，在血液中均可檢測到功能性蛋白質(zhì)分子的存在，確認(rèn)融合蛋白進(jìn)入血液中。這個技術(shù)可用于 rHSA/GH 和 rHSA/EPO 的口服給藥，可分別達(dá)到促生長，治療矮小癥以及改善和治療貧血癥的目的。

3 目前國內(nèi)外正在研究中的白蛋白融合蛋白創(chuàng)新藥品種

我們以簡要的列表方式展示國內(nèi)外正在開展研究的部分重組白蛋白融合蛋白研究，功能性蛋白質(zhì)可分為有臨床藥物研究方向或具有生物學(xué)功能的白蛋白融合蛋白、功能性蛋白質(zhì)也可以是人源或動物源的重組白蛋白融合蛋白。這些融合蛋白使用的表達(dá)系統(tǒng)有酵母菌、CHO 細(xì)胞、細(xì)菌或植物。表 1 中列出了相關(guān)文獻(xiàn)來源。據(jù)作者不完全統(tǒng)計(jì)，約有 60 多個治療用重組蛋白質(zhì)藥物或者功能性蛋白質(zhì)與人血清白蛋白形成的融合蛋白分別獲得表達(dá)，部分已經(jīng)進(jìn)入成藥性研究階段。

4 問題與展望

重組人血清白蛋白融合蛋白在過去的 10 年里研發(fā)進(jìn)展較快，現(xiàn)在世界上已經(jīng)有 2 個進(jìn)入生產(chǎn)和市場銷售階段，作者預(yù)計(jì)在隨后的 10 年應(yīng)該有 6 ～ 10 個重組人血清白蛋白融合蛋白創(chuàng)新藥進(jìn)入市場銷售。在中國研發(fā)成本相對較低，大約是美國同類創(chuàng)新藥研發(fā)成本的 1/25，臨床受藥患者數(shù)量為全球單一市場人數(shù)最多，生物類似藥市場成功率較高，值得研發(fā)機(jī)構(gòu)的資金投入。當(dāng)隨著重組人血清白蛋白融合蛋白創(chuàng)新藥更多成功進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段、進(jìn)入生產(chǎn)銷售階段，會有更多白蛋白融合蛋白進(jìn)入制藥企業(yè)的研發(fā)線。

隨著創(chuàng)新藥審批提速、上市許可人制度等重要政策陸續(xù)落地，大大縮短藥企創(chuàng)新藥上市時間，為企業(yè)贏得更多利潤；鼓勵科學(xué)家創(chuàng)新，尤其是高校、科研院所的創(chuàng)新成果能夠轉(zhuǎn)化為實(shí)際的經(jīng)濟(jì)效益，將極大促進(jìn)對創(chuàng)新藥的研發(fā)熱情。創(chuàng)新藥的定義是指國內(nèi)外沒有上市銷售、藥物分子結(jié)構(gòu)為原創(chuàng)，藥物質(zhì)量控制技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)為世界原研、臨床上具有更優(yōu)于現(xiàn)有同類藥物的新藥，當(dāng)然生產(chǎn)成本更低也是屬于創(chuàng)新藥研發(fā)的范疇。長效白蛋白融合蛋白創(chuàng)新藥都滿足了這些條件和要求，特別是長效創(chuàng)新藥使給藥頻次大大降低、依從度更高、治療效果更優(yōu)、醫(yī)療費(fèi)用更低、生產(chǎn)成本更廉，研發(fā)成功率更高，而必然成為更受藥企和社會醫(yī)保系統(tǒng)歡迎的“綠色藥物”。

志謝 尹婭鳳碩士、常宗平博士在本文的文獻(xiàn)整理工作上曾給予幫助，在此表示誠摯的感謝。

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2017-03-17