魏東，謝安平，陳成，王國治

金黃色葡萄球菌噬菌體效價測定方法的建立

魏東，謝安平，陳成，王國治

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人類及動物化膿性感染的常見致病細菌，是引起燒傷患者創(chuàng)面感染的主要病原體。對于金黃色葡萄球菌感染的治療藥物，人們一直在努力探索。自從 1928 年 Fleming 發(fā)現(xiàn)青霉素，20 世紀 40 年代用于治療金黃色葡萄球菌后不久，即出現(xiàn)耐青霉素的金黃色葡萄球菌。20 世紀 50 年代，Beecham發(fā)現(xiàn)了耐青霉素酶的 β-內酰胺類藥物甲氧西林，但僅僅幾年后，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（methicillin-resistan Staphylococcus aureus，MRSA）就相繼在歐洲和美國出現(xiàn)[1]。20 世紀 80 年代以后，MRSA 感染呈現(xiàn)上升趨勢，甚至引起醫(yī)院的暴發(fā)流行[2-3]。萬古霉素曾被譽為抗感染治療領域的“最后一道防線”，但從 1996 年至今，全球范圍內已報道多例對萬古霉素耐藥的病例，引起醫(yī)學界的高度重視[4-5]。目前，需要一種不同于抗生素的新型金黃色葡萄球菌感染治療方法。

與傳統(tǒng)治療方法相比，噬菌體治療可避免抗生素的副作用及過敏反應[6-7]。隨著 MRSA 等耐藥菌在醫(yī)院和社區(qū)的流行傳播，噬菌體的藥用價值再次受到人們的重視，將噬菌體的臨床研究帶入了一個新的階段[8]。對于金黃色葡萄球菌的噬菌體類治療用生物制品，其效價直接影響著制品的有效性。為此，本研究建立了金黃色葡萄球菌噬菌體效價的測定方法，為噬菌體制劑的質量控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 噬菌體及菌種 金黃色葡萄球菌（編號：CMCC(B) 26554）、金黃色葡萄球菌噬菌體（編號：CMCC(B)26554-P1）為中國食品藥品檢定研究院保存。

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心瓊脂培養(yǎng)基由中國食品藥品檢定研究院培養(yǎng)基室提供；標準細菌比濁管由中國食品藥品檢定研究院提供；氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl2）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）、明膠購于國藥集團化學試劑有限公司；硫酸鎂（MgSO4·7H2O）購于上海美興化工有限公司。

1.1.3 實驗儀器 DH6000AB 培養(yǎng)箱購自天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法的比較 單層瓊脂培養(yǎng)法，取 100 μl 金黃色葡萄球菌菌液與 100 μl 適當稀釋度的噬菌體混合，室溫吸附，混合液中加入 10 ml 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（含 0.75% 瓊脂），混勻后傾注平皿，每個稀釋度設 3 個重復，同時以宿主菌作對照。待瓊脂凝固后置37 ℃ 培養(yǎng) 16 ～ 24 h 后計數(shù)空斑，計算噬菌體原液效價，即 1 ml 原液樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數(shù)。噬菌體效價（pfu/ml）= 噬菌斑平均數(shù) × 稀釋倍數(shù)。

雙層瓊脂培養(yǎng)的下層為營養(yǎng)瓊脂（含 1.5% 瓊脂），取100 μl 金黃色葡萄球菌菌液與 100 μl 適當稀釋度的噬菌體混合，室溫吸附，混合液中加入 3 ml 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（含0.5% 瓊脂），混勻后將其均勻鋪滿下層營養(yǎng)瓊脂平板表面，培養(yǎng)及計數(shù)同單層瓊脂培養(yǎng)法。

1.2.2 培養(yǎng)基中氯化鈣濃度對噬菌體效價的影響 采用雙層瓊脂培養(yǎng)法，一種體系的培養(yǎng)基中不含 CaCl2，另一種體系的培養(yǎng)基鋪板之前加入 1 mol/L 的 CaCl2溶液（終濃度為 400 μg/ml），比較兩種體系中氯化鈣對噬菌體效價的影響。

1.2.3 培養(yǎng)基的選擇 采用雙層瓊脂培養(yǎng)法，一種體系使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，另一種體系使用腦心瓊脂培養(yǎng)基，比較兩種培養(yǎng)基體系對噬菌體效價測定結果的影響。

1.2.4 菌液濃度的選擇 采用雙層營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)法，將金黃色葡萄球菌菌液稀釋成 5 × 109、1.5 × 109、5 × 108及1.5 × 108/ml 濃度，分別與適當稀釋的噬菌體混合后，測定噬菌體效價。

1.2.5 吸附時間的選擇 采用雙層營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)法，將金黃色葡萄球菌菌液稀釋成 5 × 108/ml，與適當稀釋的噬菌體混合，分別于室溫吸附 0、15 及 30 min 后，測定噬菌體效價。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 Minitab 16 統(tǒng)計軟件，將噬菌體效價取以 10 為底的對數(shù)后進行 t 檢驗，以 P ＜ 0.05 視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法的比較

單層瓊脂培養(yǎng)法測定的噬菌體原液效價均值為 5.5 ×107pfu/ml，雙層瓊脂培養(yǎng)法測定的噬菌體原液效價均值為2.6 × 108pfu/ml，雙層瓊脂培養(yǎng)法的測定結果高于單層瓊脂培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.001），見圖 1。因此，選擇雙層瓊脂培養(yǎng)法進行噬菌體效價測定。

2.2 培養(yǎng)基中氯化鈣濃度對噬菌體效價的影響

不含 CaCl2培養(yǎng)基所測定的噬菌體效價的對數(shù)均值為（8.42 ± 0.02）與含 CaCl2培養(yǎng)基結果（8.37 ± 0.12）接近，差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.535）。因此，選擇不含 CaCl2的培養(yǎng)基進行噬菌體效價測定。

2.3 培養(yǎng)基的選擇

使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基測定的噬菌體效價的對數(shù)均值結果為（8.42 ± 0.02）與腦心瓊脂培養(yǎng)基結果（8.37 ± 0.08）基本一致，差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.397）。因此，選擇較為經濟的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行噬菌體效價測定。

2.4 菌液濃度的選擇

噬菌體分別與 4 種濃度的金黃色葡萄球菌菌液混合所測定的效價結果基本一致，任何濃度組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05），見圖 2。菌液濃度過高時，所形成的噬菌斑較小，菌液濃度過低時，背景顏色過淺，均不便于觀察計數(shù)。菌液濃度為 5 × 108/ml 時，噬菌斑大小及背景顏色均適于計數(shù)。因此，選擇菌液濃度為 5 × 108/ml。

圖 1 單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法效價測定結果比較（***P ＜ 0.001）

圖 2 菌液濃度對噬菌體效價的影響

2.5 吸附時間的選擇

結果顯示，吸附 0、15 及 30 min，所測得的效價結果差異無顯著意義，見表 1。因此，選擇中間時間點，確定吸附時間為 15 min。

表 1 不同吸附時間對噬菌體效價的影響

3 討論

噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細菌病毒的總稱，具有抗感染治療的天生潛質。噬菌體有溶菌作用和嚴格的種型特異性，可利用噬菌體作細菌的鑒定和分型，亦可用于防治某些傳染病[9]，特別是在耐藥細菌感染治療方面具有廣闊前景[10-11]。

本研究選取一株具有廣譜裂解特性的金黃色葡萄球菌噬菌體，建立噬菌體效價測定的標準化方法。首先，比較了單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法對噬菌體效價測定結果的影響。單層瓊脂培養(yǎng)法具有操作簡便的特點[12]，但試驗結果表明，單層瓊脂培養(yǎng)法測定結果明顯低于雙層瓊脂培養(yǎng)法。因此，選擇雙層瓊脂培養(yǎng)法進行金黃色葡萄球菌噬菌體效價測定。氯化鈣有增加細胞膜通透性的作用，有些噬菌體在制備過程及效價測定時均需要添加氯化鈣，但本研究中氯化鈣對所選取噬菌體株的效價測定無任何影響。本文還分析了可能影響噬菌體效價測定的其他因素，結果顯示培養(yǎng)基種類、菌液濃度以及吸附時間對噬菌體效價無明顯影響。

本文建立了金黃色葡萄球菌噬菌體效價的測定方法，為金黃色葡萄球菌噬菌體相關生物制品的質量控制奠定了基礎。

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我會常務理事謝恬教授獲何梁何利基金科學與技術創(chuàng)新獎

我會常務理事謝恬教授獲得 2016 年度何梁何利基金科學與技術創(chuàng)新獎。這也是我國中醫(yī)學、中西醫(yī)結合學界在此次頒獎大會上唯一的獲獎者。

何梁何利基金由香港愛國金融家何善衡、梁銶琚、何添、利國偉于 1994 年創(chuàng)立，旨在獎勵中國杰出科學家，促進科學技術進步與創(chuàng)新，下設科學與技術成就獎、科學與技術進步獎和科學與技術創(chuàng)新獎，有“中國的諾貝爾獎”之稱。20 多年來，何梁何利基金共表彰了 1147 位杰出科技工作者，以其公正性和權威性成為社會力量設立科技獎的杰出代表，中青年人才和海外歸國人員成為創(chuàng)新主要力量。

謝恬教授團隊研發(fā)成功具有自主知識產權的中西醫(yī)結合抗癌新藥欖香烯脂質體以及瀕危珍稀中藥材石斛人工繁育栽培技術，并實現(xiàn)產業(yè)化推廣。該團隊設計建成全球首條脂質體靶向制劑產業(yè)化生產線，首次把第四代藥物制劑的代表脂質體運用于中藥并成功產業(yè)化。評委會認為，“謝恬教授團隊取得了具有原創(chuàng)性的重大研究成果”，“對醫(yī)藥產業(yè)及中醫(yī)、中西醫(yī)結合創(chuàng)新發(fā)展具有重要意義?！?/p>

據(jù)了解，欖香烯脂質體正式投產后已使國內外 70 多萬癌癥患者受益，目前平均每年國內有 3 萬名左右患者使用該藥。中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院、中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院、首都醫(yī)科大學北京中醫(yī)院等國內多家腫瘤醫(yī)院已通過臨床研究證明，欖香烯脂質體的療效不亞于化療，而且沒有化療藥的毒副作用。

2013 年，欖香烯脂質體榮獲中國優(yōu)秀發(fā)明專利獎，謝恬教授團隊還歷經 8 年多時間在美國、英國、法國、德國、荷蘭、意大利等歐美國家成功獲得了欖香烯脂質體發(fā)明專利。接下來，他們還準備在這些國家做研究注冊新藥，造福全世界更多癌癥患者。（信息來源：杭州師范大學）

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.014

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院結核病疫苗室/衛(wèi)生部生物技術檢定方法及其標準化重點實驗室

王國治，Email：vaccine2012@126.com

2017-03-07