包訓(xùn)迪 王超 闞曉紅 王慶

分子線性探針雜交方法用于耐多藥結(jié)核病耐藥性分析的應(yīng)用研究

包訓(xùn)迪 王超 闞曉紅 王慶

目的 評(píng)價(jià)分子線性探針雜交方法(LPA)在快速檢測耐多藥結(jié)核病人耐藥性的應(yīng)用價(jià)值。方法 利用分子線性探針雜交方法檢測415例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，同時(shí)使用常規(guī)藥敏方法對(duì)樣本進(jìn)行抗結(jié)核藥物敏感性測試。結(jié)果 線性探針雜交法檢測415例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株RFP和INH耐藥性的靈敏度、特異性分別為91.43%、94.20%和75.68%、95.89%，兩種檢測方法的kappa值分別為0.830、0.731；線性探針雜交法檢出MDR的敏感度和特異度分別為75.44%、95.25%，兩種檢測方法的kappa值為0.692。線性探針雜交法檢測的耐藥株中RFP常見的突變型主要分布在WT7、WT8和MUT3(S531L)。結(jié)論 線性探針雜交法在結(jié)核病耐藥分析中能夠快速、準(zhǔn)確的鑒定出RFP和INH的耐藥性以及常見耐藥基因型，能夠大幅縮短藥敏試驗(yàn)時(shí)間，便于及時(shí)用藥治療，對(duì)控制耐藥結(jié)核病的傳播有重要意義。

分子線性探針雜交；異煙胼；利福平；耐藥

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是威脅全球公共衛(wèi)生的常見感染性疾病。近年來隨著國家加大對(duì)結(jié)核病的防控力度，結(jié)核病得到了一定程度的遏制；但耐藥結(jié)核病卻成了結(jié)核病的三大難題之一，耐藥結(jié)核病的控制面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，細(xì)菌學(xué)檢查仍是耐藥結(jié)核病診斷的主要手段，但由于傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法耗時(shí)較長，一般需要2-3個(gè)月才能最終診斷為耐藥結(jié)核病，這為耐藥結(jié)核病的防控提出了巨大挑戰(zhàn)。因此，耐藥結(jié)核病的早期診斷和及時(shí)治療對(duì)耐藥結(jié)核病的防控具有重要意義。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)方法在耐藥結(jié)核病診斷中的應(yīng)用，極大縮短了耐藥結(jié)核病的診斷時(shí)間，為耐藥結(jié)核病的早期診斷方法的提供依據(jù)。線性探針技術(shù)(簡稱LPA)是近年來國家在全國推廣的耐多藥結(jié)核病快速診斷方法之一，我省已在16個(gè)市進(jìn)行推廣。為評(píng)價(jià)這種方法的應(yīng)用效果，本研究組在2015年度對(duì)安徽省胸科醫(yī)院415例培養(yǎng)陽性肺結(jié)核患者進(jìn)行快速檢測耐多藥肺結(jié)核，并與傳統(tǒng)結(jié)核菌培藥敏試驗(yàn)作對(duì)照分析，結(jié)果如下。

資料與方法

一、材料和試劑

2015年我院培養(yǎng)陽性的415例臨床肺結(jié)核患者標(biāo)本。試劑采用MTBDR-Plus Kit(Hain life science．Germany)，高保真熱啟動(dòng)酶(HotStar Taq酶) ，按試劑盒說明書操作。

二、研究方法

1. 采用病例對(duì)照方法 對(duì)所有病人培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)和線性探針技術(shù)檢測，臨床標(biāo)本的藥敏試驗(yàn)參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[1]

2. 核酸提取 挑取1接種環(huán)菌，加500μL無菌蒸餾水中，充分混懸沉淀，85℃金屬浴20 min滅活。13000g離心5min棄上清，加500μL無菌蒸餾水重懸，13000g離心5min棄上清，加100μL無菌蒸餾水，95℃金屬浴20 min， 37kHz 80W超聲15 min，13000g離心5 min后；將上清轉(zhuǎn)移到另一管。5μL用于PCR擴(kuò)增，剩余-20℃保存?zhèn)溆?/p>

3. PCR擴(kuò)增和雜交 準(zhǔn)備含有DNA聚合酶的擴(kuò)增體系45μL,加5μL提取的DNA模板。上機(jī)擴(kuò)增：95℃ 15 min；95℃ 30s，58℃ 2 min，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 25s，53℃ 40s，70℃ 40s，20個(gè)循環(huán)；70℃ 8min；4℃ 1h。直接取擴(kuò)增產(chǎn)物2μL進(jìn)行化學(xué)變性后，與帶有探針固化的試紙條在GT48全自動(dòng)雜交儀進(jìn)行顯色反應(yīng)。

三、結(jié)果分析

結(jié)果判定(見圖1)。RFP和INH突變檢測圖示，其中有4個(gè)質(zhì)控探針，23個(gè)檢測探針。當(dāng)任一基因的野生位點(diǎn)出現(xiàn)顯色缺失，或者突變位點(diǎn)有顯色時(shí)，判定為耐藥：野生位點(diǎn)未缺失，突變位點(diǎn)未顯色，判定為敏感。如果質(zhì)控探針或tub對(duì)照條帶缺失，需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 RFP和INH突變示意圖

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)兩種方法檢測結(jié)果一致性的Kappa值進(jìn)行判別，若Kappa值≥0.75，表示兩種方法取得相當(dāng)滿意的一致性，0.75> Kappa值≥0.4，表示兩種方法的一致性比較滿意，若Kappa值<0.4，表示兩種方法的一致性不夠理想。

結(jié) 果

一、線性探針技術(shù)檢測利福平和異煙肼耐藥性的性能以絕對(duì)濃度法藥敏結(jié)果為準(zhǔn)。線性探針技術(shù)檢測利福平和異煙肼的靈敏度為91.43%和75.68%，利福平和異煙肼的特異性分別為94.20%和95.89%，兩種方法檢測RFP和INH耐藥性的kappa值分別為0.830和0.731，(見表1、2)。

二、線性探針技術(shù)檢測耐多藥的性能以絕對(duì)濃度法藥敏結(jié)果為準(zhǔn)。線性探針技術(shù)的靈敏度為75.44%，特異性分別為95.25%，兩種方法檢測MDR-TB的kappa值為0.692(見表3)；兩種方法用于MDR的檢測無顯著性差異，(見表3)。

表1 兩種方法檢測415例患者RFP耐藥情況

表2 兩種方法檢測415例患者INH耐藥情況

表3 兩種方法檢測415例患者耐多藥情況

三、通過線性探針技術(shù)檢測出的rpoB耐藥基因80%以上的突變主要分布在WT7、WT8和MUT3(S531L)[2-3](見表4)。

討 論

我國2007-2008年結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查和第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示[4-5]，結(jié)核病耐藥性已經(jīng)成為目前結(jié)核病防治中的難題，根據(jù)WHO公布的數(shù)據(jù)，我國耐藥結(jié)核病的控制仍有巨大提升空間，耐藥結(jié)核病已成為我國結(jié)核病的控制難題，國家結(jié)核病防治在“十三”期間已將耐藥結(jié)核病列為三大難點(diǎn)之一。有研究顯示，耐藥結(jié)核病的流行病學(xué)主要是通過人群之間傳播[6]；因此耐藥結(jié)核病的早期診斷和治療對(duì)控制傳播有重要意義。

表4 rpoB耐藥基因分布

目前，我國基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室對(duì)于耐藥結(jié)核病的診斷主要仍依賴細(xì)菌學(xué)診斷，傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)花費(fèi)時(shí)間較長，一般需要4周時(shí)間才能得到藥敏結(jié)果，在耐多藥肺結(jié)核患者的早期診斷上無法發(fā)揮作用，滿足不了臨床需求。隨著分子生物學(xué)方法的發(fā)展，近年來涌現(xiàn)出很多基于PCR原理的方法用于結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測，線性探針方法是其中之一，該方法可以直接檢測涂陽痰標(biāo)本，可在8小時(shí)左右完成結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢惻，極大的縮短了耐藥性檢測時(shí)間，能夠及時(shí)為臨床診斷提供科學(xué)依據(jù)[7-9]。

本研究采用臨床結(jié)核病人的培養(yǎng)物作為標(biāo)本，經(jīng)過提取核酸DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，通過反相雜交方法檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的突變。研究結(jié)果顯示，線性探針方法檢測利福平和異煙肼的靈敏度分別為91.43%和75.68%，特異性分別為94.20%和95.89%，與李強(qiáng)等研究結(jié)果相似[10-11]，可以較大限度的發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核病人。在兩種方法的一致性分析中可以看出，HAIN在檢測RFP的耐藥性有著相當(dāng)滿意的一致性，在檢測INH和發(fā)現(xiàn)MDR病人是有著比較滿意的一致性。

此外，LPA方法檢測耐多藥結(jié)核病的陽性率達(dá)到14.46%、傳統(tǒng)藥敏法是13.73%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究顯示LPA方法檢測耐多藥結(jié)核病的陽性率略高于傳統(tǒng)方法，經(jīng)復(fù)做兩項(xiàng)檢測后，HAIN的重復(fù)性很高。與傳統(tǒng)方法比較，傳統(tǒng)方法可能存在技術(shù)方面的缺陷，受各方面因素的影響，而LPA方法比較直觀，按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序操作，可將影響因素控制在一定范圍以內(nèi)。此外，LPA方法的檢測報(bào)告時(shí)間大為縮短，可作為耐藥結(jié)核病快速檢測的理想方法，可以為耐多藥結(jié)核病人的早期診斷和治療提供了技術(shù)保證。

有研究提示，耐RFP的患者約有70%是耐多藥病人[12-13]，WHO建議通過檢測RFP來完成對(duì)耐多藥病人的快速篩查。本研究顯示，我院RFP耐藥的rpoB基因主要突變位點(diǎn)在WT8、WT7和MUT3，如表4所示，說明我院RFP的主要耐藥基因的突變位點(diǎn)可能存在于526-533位，最常見是H526Y 和S531L突變。這些主要基因突變位點(diǎn)的分布，可為以后的基因檢測方法的選擇提供參考，可以據(jù)此選擇有針對(duì)性的方法來進(jìn)行耐多藥病人的快速篩查[14]。

綜上所述，線形探針技術(shù)具有時(shí)間短、靈敏度高、特異度好的特點(diǎn)，能夠?yàn)槟投嗨幗Y(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供診斷依據(jù)。但由于線性探針檢測技術(shù)需要特殊設(shè)備和環(huán)境，操作技術(shù)和防污染措施要求嚴(yán)格，實(shí)驗(yàn)室必須是經(jīng)過衛(wèi)生部臨檢中心驗(yàn)收過的基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室才能開展臨床檢測工作，檢測人員同樣需要經(jīng)過培訓(xùn)、嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行操作，按照基因擴(kuò)正實(shí)驗(yàn)室的要求，儀器設(shè)備和耗材要做到專區(qū)專用，避免交叉污染，只有滿足以上要求，線性探針技術(shù)才能作為耐多藥結(jié)核病的快速診斷技術(shù)，才能更加有效的保護(hù)健康人群，在控制耐多藥結(jié)核病疫情等方面才具有重大意義[15]。

[1] 中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)．結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M]．北京：中國教育文化出版社，2006．

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Application of LPA method in analysis of multi-drug resistant TB

BAOXun-di,WANGChao,KANXiao-hong,WANGQing.

DepartmentofLabrtory,AnhuiChestHospital,Hefei,Anhui230022,China

Objective To evaluate the application of molecular linear probe hybridization method (LPA) in rapid detection of multi-drug resistant tuberculosis. Methods It used LPA to detect 415 cases of mycobacterium tuberculosis clinical isolates. At the same time, it also used conventional DST method to detect the samples. Results The sensitivity and specificity of RFP and INH clinical isolates was 91.43% and 94.2%, and 75.68% and 95.89% respectively by LPA method, and the value of kappa was 0.830 and 0.731 for the two methods. The sensitivity and specificity of MDR by PLA method was 75.44% and 95.25% respectively, and the kappa value was 0.692. The mutant resistant strains of RFP mainly distributed in WT7, WT8 and MUT3 (S531L). Conclusion LPA method can detect RFP and INH drug resistance and other common resistant genes rapidly and accurately, which means it can sharply reduce the susceptibility test time for timely clinical drug treatment.

LPA; INH; RFP; drug resistance

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.002

安徽省衛(wèi)計(jì)委課題(No 15tb011)；安徽省胸科醫(yī)院課題(No xk2015010)

230022 安徽 合肥，安徽省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科

王慶，E-mail：ahtbwangqing@163.com

2017-03-04]