楊穎溪 柴立民 晏軍 高偉華 吳甜甜 朱紫亨 余佳駿 徐昉

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·論著·

補腎益肺消癥方對α-SMA及SP-C蛋白對肺纖維化大鼠病變肺組織分布及表達的影響

楊穎溪 柴立民 晏軍 高偉華 吳甜甜 朱紫亨 余佳駿 徐昉

目的 探討補腎益肺消癥方干預(yù)肺纖維化大鼠α-SMA及SP-C蛋白在病變肺組織中分布及表達的作用機制。方法 以博來霉素致大鼠肺纖維化的動物模型，以吡非尼酮作為陽性對照藥物，補腎益肺消癥方分別于模型過程中、造模后及實驗全程進行干預(yù)，觀察動物活動及體重變化，免疫組化檢測病變肺組織中α-SMA、SP-C蛋白表達。結(jié)果 大鼠體重顯示，模型組體重較正常組明顯減輕(P<0.05)，中藥防治組體重較模型組明顯升高(P<0.05)。免疫組化、免疫熒光結(jié)果顯示，模型組病變肺組織中α-SMA、SP-C蛋白表達較正常組明顯升高(P<0.05)，陽性組和中藥組α-SMA、SP-C蛋白表達較模型組明顯減低(P<0.05)。結(jié)論 補腎益肺消癥方可以通過減少α-SMA的表達及成熟SP-C蛋白沉積，減少成纖維灶的形成，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，延緩特發(fā)性肺纖維化的病理進程，從而達到治療的目的。

補腎益肺消癥方； 特發(fā)性肺纖維化； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； α-平滑肌肌動蛋白； 肺泡表面活性蛋白C

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的病理改變主要為彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，最終可導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化。IPF最初病理表現(xiàn)為肺泡炎，隨疾病進展，出現(xiàn)成纖維細胞和膠原纖維增生，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，最后呈現(xiàn)彌漫性肺纖維化，形成“蜂窩肺”。成纖維灶是肺纖維化的特征性表現(xiàn)，其核心是活化的肌成纖維細胞，而α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是肌成纖維細胞的特征性標志物[1]。“蜂窩肺”的形成，主要是由于Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells Ⅱ，AECⅡ)過度凋亡，不能及時修補破壞的Ⅰ型肺泡上皮細胞，而被支氣管或內(nèi)皮細胞所代替[2]。近年來有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可導(dǎo)致AECⅡ凋亡，肺泡表面活性蛋白C(surfactant proteins C，SP-C)分泌減少。本實驗以博萊霉素(bleomycin，BLM)致大鼠肺纖維化為動物模型，觀察補腎益肺消癥方對α-SMA及SP-C蛋白在肺纖維化大鼠肺組織中分布及表達的影響，探討其調(diào)控病變肺組織肌成纖維細胞及細胞ERS的作用靶點，研究該方治療特發(fā)性肺纖維化的效應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠60只，雄性，體重(200±20)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號：11400700045968。飼養(yǎng)于東直門醫(yī)院屏障級實驗動物中心。

1.2 實驗藥物

造模用鹽酸博萊霉素(15 mg/瓶，購自日本化藥株式會社)，批號：730342；補腎益肺消癥方組成：當歸、熟地黃、陳皮、法半夏、浙貝母、水蛭、炙甘草，(4∶5∶3∶3∶4∶2∶2)，為中藥全成分免煎顆粒，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供；吡非尼酮膠囊(100 mg/粒)，批號：140101，購自北京康蒂尼藥業(yè)有限公司。Rabbit anti-SP-C購自Santa CRUZ生物公司,Mouse anti-α-SMA、Cy3-goat anti-rabbit IgG購自博士德公司。

1.3 分組及造模

60只大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥物組、中藥預(yù)防組、中藥治療組、中藥防治組，每組10只。3.25%水合氯醛麻醉大鼠，除正常組外，其余大鼠經(jīng)氣管插管以5 mg/kg緩慢注入博萊霉素[3]，藥物注入后將動物直立旋轉(zhuǎn)，使藥物分布均勻，正常組注入等量生理鹽水。造模后中藥預(yù)防組、中藥防治組以12.68 g/(kg·d)灌胃給藥，正常組和模型組予等量生理鹽水，每周稱量大鼠體重，觀察其活動及毛色變化。給藥至28天后(模型成功后)處死中藥預(yù)防組動物，并開始陽性組和中藥治療組給藥，陽性對照組以53.5 mg/(kg·d)予吡非尼酮，中藥治療組、中藥防治組以12.68 g/(kg·d)予中藥顆粒劑，正常組和模型組仍給予等量生理鹽水，繼續(xù)給藥28天，觀察大鼠體重和活動狀況。1.4 取材

分別于28天、56天，取動物病變肺組織。快速分離出肺臟，用生理鹽水洗凈血液。取病變肺組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，備免疫組化、免疫熒光檢測。

1.5 免疫組化

取石蠟組織切片，脫蠟復(fù)水，檸檬酸修復(fù)液抗原修復(fù)，血清室溫封閉，加Mouse anti-α-SMA孵育過夜。biotin-goat anti-rabbit、SABC室溫孵育后DAB顯色，流水沖洗后蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。應(yīng)用IPP 6.0軟件對圖片進行平均光密度值測定，每組8個樣本，每個樣本測量兩次取平均值。

1.6 免疫熒光

組織切片脫蠟復(fù)水及抗原修復(fù)同α-SMA染色，Rabbit anti-SP-C孵育過夜。Cy3-goat anti-rabbit IgG避光孵育后DAPI復(fù)染核，PBS沖洗，水封片后熒光顯微鏡拍照。應(yīng)用IPP 6.0軟件對圖片進行平均光密度值測定，每組8個樣本，每個樣本測量兩次取平均值。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的體重及活動狀態(tài)變化

正常組大鼠肌肉豐滿，皮毛光澤，攝食及日?；顒诱?；模型組及治療各組大鼠從造模后第2、3天即出現(xiàn)精神不振，氣喘搔鼻，皮毛暗淡干枯，體型消瘦，其中又以模型組動物最為明顯。經(jīng)藥物干預(yù)，造模后3周，模型組及治療各組體重均較正常組低，其中模型組體重明顯減輕(P<0.05)，造模后7周，中藥防治組體重接近正常組，明顯高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠體重變化對比±s)

注： 與正常組比，aP<0.05；與模型組比，bP<0.05。

2.2 補腎益肺消癥方對大鼠病變肺組織中α-SMA表達的影響

α-SMA免疫組化結(jié)果顯示：正常組大鼠肺組織中可見少量包漿呈棕黃色染色的α-SMA陽性細胞。與正常組相比，模型組病變肺組織中α-SMA表達明顯增多，染色涂片平均光密度值顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，治療各組陽性細胞數(shù)量均較模型組明顯減少，染色涂片平均光密度值降低(P<0.05)，其中陽性組及中藥防治組降低明顯。見圖1、表2。

2.3 補腎益肺消癥方對大鼠病變肺組織中SP-C表達的影響

SP-C免疫熒光結(jié)果顯示：正常組中可見少量紅色SP-C蛋白沉積，與正常組相比，模型組中SP-C蛋白沉積明顯增多，染色涂片平均光密度值顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，除中藥治療組外，其余各組陽SP-C蛋白沉積染色面積均減小，染色涂片平

均光密度值降低(P<0.05)。見圖2、表3。

表2 各組大鼠肺組織α-SMA染色平均密度值±s)

注： 與正常組比，aP<0.05；與模型組比，bP<0.05。

表3 各組大鼠肺組織SP-C染色平均密度值±s)

注： 與正常組比，aP<0.05；與模型組比，bP<0.05。

3 討論

目前西醫(yī)對IPF的治療多使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑，長期使用依從性差，毒副反應(yīng)多。筆者根據(jù)多年呼吸系統(tǒng)疾病的臨床防治經(jīng)驗和科學研究，形成了對本病的系統(tǒng)認識，提出“肺絡(luò)微型癥瘕”的中醫(yī)病機理論[4]，以補肺通絡(luò)、化痰消癥為治則， 方用補腎益肺消癥方， 在臨床上加減治療特發(fā)性肺纖維化。方中熟地黃、當歸滋陰養(yǎng)血，補肺腎之不足，陳皮、半夏、浙貝母、水蛭理氣祛痰消癥，炙甘草調(diào)和諸藥，共奏滋陰養(yǎng)血，健脾祛痰之功。

注：A：正常組；B：模型組；C：陽性組；D：中藥預(yù)防組；E：中藥治療組；F：中藥防治組 箭頭所指處即為α-SMA陽性細胞

圖1 大鼠病變肺組織α-SMA免疫組化染色結(jié)果(×100)

注：A：正常組；B：模型組；C：陽性組；D：中藥預(yù)防組；E：中藥治療組；F：中藥防治組 箭頭所指處即為SP-C蛋白沉積

圖2 大鼠病變肺組織SP-C免疫熒光染色結(jié)果(×100)

肺纖維化的病理過程通常伴隨細胞外基質(zhì)的沉積和成纖維灶的形成。肌成纖維細胞(Myofibroblast，MF)是細胞外基質(zhì)的主要來源，它是由成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化而來，其超微結(jié)構(gòu)介于成纖維細胞和平滑肌細胞之間[5]。α-SMA是肌成纖維細胞的表型標志[6]，表達陽性的肌成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)的能力較正常成纖維細胞明顯增強。α-SMA可以反映平滑肌數(shù)量及收縮能力的改變，是平滑肌細胞收縮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，促進Ⅰ型膠原的沉積，進而形成纖維化[7]。

肺泡Ⅱ型上皮細胞有合成、分泌和循環(huán)利用肺泡表面活性物質(zhì)的功能，表面活性蛋白SP-B、SP-C和磷酸雙磷脂是表面活性物質(zhì)的重要組成部分[8]。AECⅡ中內(nèi)含豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以合成表面活性蛋白。在肺纖維化疾病的進展過程中，肺泡表面活性蛋白SP-C的突變與AECⅡ慢性損傷和凋亡相關(guān)。成熟的SP-C蛋白具有攻擊細胞的特點，在AECⅡ中表達后可導(dǎo)致細胞死亡，因此，SP-C蛋白在AECⅡ內(nèi)以蛋白前體的形式存在，最后與脂質(zhì)共同分泌出細胞膜。但是突變的SP-C前體在AECⅡ中不能被進一步加工，最終會沉積在細胞內(nèi)，與正常的SP-C聚集形成凝聚體[9],并引起未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，啟動ERS,引起細胞壞死，最終導(dǎo)致AECⅡ凋亡、肺部慢性間質(zhì)炎癥及肺纖維化[10-11]。

實驗研究結(jié)果顯示，補腎益肺消癥方對特發(fā)性肺纖維化有較好的治療效果。大鼠體重變化顯示，經(jīng)過西藥及中藥干預(yù)，大鼠體重均較模型組增加，其中中藥防治組體重接近正常組，明顯高于模型組(P<0.05)。病變肺組織中α-SMA免疫組化結(jié)果顯示，模型組肺組織中α-SMA表達明顯增多，中西藥治療組均較模型組表達減少，以陽性組和中藥防治組最為明顯。病變肺組織中SP-C蛋白免疫熒光結(jié)果顯示，模型組中有大量SP-C蛋白沉積，陽性組及中藥防治組較模型組明顯減少。因此筆者認為該方可以通過降低α-SMA在肺組織肌成纖維細胞中的表達，抑制成熟SP-C蛋白的合成，從而減少細胞外基質(zhì)的沉積和成纖維灶的形成，減輕細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，延緩和抑制特發(fā)性肺纖維化的病理改變進程，以達到治療目的，這可能是該方治療特發(fā)性肺纖維化的作用機制之一。

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(本文編輯： 禹佳)

Influences ofBushenYifeiXiaozhengdecoction on the distribution and expression of α-SMA and SP-C protein in IPF rat

YANGYingxi，CHAILimin，YANJun，etal.

GeriatricsDepartment，ZhengzhouHospitaloftraditionalChineseMedicine，Henan100700，China

YANJun,E-mail:dzmyyyj@126.com

Objective To investigate the mechanism ofBushenYifeiXiaozhengdecoction in the distribution and expression of α-SMA、SP-C protein of pulmonary fibrosis rats.Methods IPF rat model were induced by Bleomycin. Rats were treated with pirfenidone andBushenYifeiXiaozhengdecoction respectively before modeling. To observe the changes of activity and the weight of rats during the modeling, after modeling and the whole experiment. The expression of α-SMA and SP-C protein of lung tissue was detected by immunohistochemical staining method. Results The weight of model group was lighter than the normal group(P<0.05), and the Chinese medicine group gained more weight than the model group(P<0.05). Compared with the model group，the expression of α-SMA and SP-C were decreased significantly in the treatment group(P<0.05). ConclusionBushenYifeiXiaozhengdecoction can reduce the expression of α-SMA and the deposition of the mature SP-C，release the endoplasmic reticulum stress，then to achieve the purpose of treatment.

BushenYifeiXiaozhengdecoction； Idiopathic pulmonary fibrosis； Endoplasmic reticulum stress； α-SMA； SP-C

國家自然科學基金(81373589)

450006 河南省鄭州市中醫(yī)院分院老年病科[楊穎溪(碩士研究生)]；中醫(yī)內(nèi)科學教育部和北京市重點實驗室(柴立民)；北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院呼吸科[晏軍、高偉華、吳甜甜、朱紫亨、余佳駿、徐昉(碩士研究生)]

楊穎溪(1990- )，女，2013級在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治肺系疾病。E-mail：yangyingxi04@163.com

晏軍(1968- )，博士，主任醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)藥防治肺系疾病。E-mail：dzmyyyj@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.005

2016-03-18)