董笑克 鄧?yán)?白穎 洪明昭 秦靈靈 孫文 郭璇 吳麗娟 許光遠(yuǎn) 劉銅華

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·論著·

陽和湯對自身免疫性甲狀腺炎大鼠甲狀腺結(jié)構(gòu)及甲狀腺自身抗體的影響

董笑克 鄧?yán)?白穎 洪明昭 秦靈靈 孫文 郭璇 吳麗娟 許光遠(yuǎn) 劉銅華

目的 觀察陽和湯對自身免疫性甲狀腺炎模型大鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)及甲狀腺自身抗體的影響。方法 選取Lewis大鼠30只，正常組10只，其余20只大鼠采用高碘飲食聯(lián)合豬甲狀腺球蛋白皮下注射的方法建立自身免疫性甲狀腺炎動物模型，造模成功大鼠分為模型組和中藥組，干預(yù)8周后采用放免法檢測大鼠甲狀腺功能及甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TGAb)，采用酶聯(lián)免疫吸附測定檢測甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)，甲狀腺組織石蠟包埋切片，HE染色。結(jié)果 與正常組相比，模型組及中藥組大鼠促甲狀腺激素(TSH)明顯降低，血清游離甲狀腺素(FT4)及TPOAb、TGAb明顯升高，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組大鼠相比，中藥組大鼠TPOAb、TGAb降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；中藥組大鼠TPOAb治療前后差值，與正常組及模型組相比均具有明顯差異(P<0.01)；中藥組大鼠甲狀腺組織切片與模型組相比，淋巴細(xì)胞浸潤程度及甲狀腺濾泡細(xì)胞破壞均減少。結(jié)論 陽和湯可降低自身免疫性甲狀腺炎大鼠甲狀腺自身抗體，減少甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤程度，保護甲狀腺濾泡細(xì)胞等作用。

陽和湯； 自身免疫性甲狀腺炎； 血清甲狀腺過氧化物酶抗體

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)亦稱慢性淋巴細(xì)胞浸潤性甲狀腺炎、橋本氏病，是一種器官特異性自身免疫病，其特征性改變是甲狀腺內(nèi)有大量的淋巴細(xì)胞浸潤，血清甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)和/或甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TGAb)水平升高，甲狀腺功能可以正?；蚩哼M、亞臨床甲減和臨床甲減。目前對AIT尚無任何確切有效的治療方法，僅能對已經(jīng)發(fā)生甲減的患者給予甲狀腺激素替代治療。西醫(yī)治療多使用免疫調(diào)節(jié)藥物糖皮質(zhì)激素(地塞米松[1-2]、潑尼松[3])、免疫抑制劑(雷公藤多苷[4]、甲氨蝶呤[5])、硒制劑[6-7]、維生素D3[8]等，但上述藥物療效尚不理想，且存在較多的不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用較少。中藥因其治療自身免疫性甲狀腺炎具有療效確切，不良反應(yīng)小、禁忌證少等優(yōu)點，目前在臨床上應(yīng)用越來越廣泛[9]。本病后期可出現(xiàn)畏寒肢冷、少氣懶言、疲乏無力、水腫等一派陽虛癥狀，研究表明溫陽化痰法治療自身免疫性甲狀腺炎，可使甲狀腺嗜酸性病變細(xì)胞下降，提示陽和湯也有修復(fù)或幫助修復(fù)小鼠病變甲狀腺細(xì)胞的功能[10]。本研究以Lewis大鼠為對象，探究陽和湯對自身免疫性甲狀腺炎模型大鼠自身抗體及甲狀腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Lewis雌性大鼠30只，7周齡，體重(120±10)g，由維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-0001。動物飼料選用普通大鼠生長繁殖飼料，由維通利華提供。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房，5只/籠，保證正常光照節(jié)律、溫度適度、環(huán)境安靜。

1.2 實驗藥物及試劑

陽和湯配方顆粒組成：熟地黃30 g、肉桂3 g、麻黃2 g、鹿角膠9 g、白芥子6 g、姜炭2 g、生甘草3 g，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒藥房，生產(chǎn)廠家：北京康仁堂有限公司。

豬甲狀腺球蛋白(pTg)(貨號：T1126)、完全弗氏佐劑(CFA)(貨號：F5506)、不完全弗氏佐劑(IFA)(貨號：F5881)，均購自美國SIGMA公司。大鼠甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(貨號：CSB-E11199R，武漢華美生物工程有限公司)。碘化鈉(批號：20039818，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。弗氏(完全/不完全)佐劑的配制方法：取適量pTg與溶于PBS配制2 mg/mL的溶液，并與等體積的弗氏(完全/不完全)佐劑完全混勻，充分乳化，完全乳化標(biāo)準(zhǔn)為：滴一滴乳化劑于水面上，半小時內(nèi)仍呈球狀，不散開為乳化成功標(biāo)志，乳化劑中抗原含量為1 mg/mL。高碘水配置方法：0.64 g水溶于1 L去離子水中。

1.3 實驗儀器

4℃低溫高速離心機(型號：3K15，德國sigma公司)；電子讀數(shù)分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；光學(xué)顯微鏡(型號：L340099，Olympus公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Tecan)；恒溫箱(Sanyo)；普通手術(shù)器械、體質(zhì)量秤等。

1.4 動物模型的建立

30只大鼠于室溫18～22℃環(huán)境下適應(yīng)1周，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。將大鼠隨機分為兩組，空白對照組10只，實驗組20只。1周后實驗組大鼠開始造模，第1周于周二、周六一周兩次皮下注射0.1 mL完全佐劑與pTg乳化劑，pTg含量為100 μg，分三點：腹部兩點，頸背部一點皮下注射。后于每周二同一時間腹部、頸背部三點皮下注射不完全佐劑與pTg乳化劑，pTg含量為100 μg/次，共注射4周。造模期間實驗組大鼠飲用高碘水；空白對照組大鼠喂以普通飼料、飲水，正常條件下飼養(yǎng)，與實驗組相同時間頸背部、腹部三點皮下注射等量生理鹽水。4周后20只大鼠用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，麻醉劑量為4 mg/100 g，眶靜脈取血，1 mL/只，血清4℃下以3000 r/min離心15分鐘，每個標(biāo)本分裝2管，1管采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清TPOAb水平，檢測造模是否成功，另一管-20℃凍存?zhèn)溆?。造模成功?biāo)準(zhǔn)：TPOAb血清滴度高于60 IU/mL為造模成功大鼠。

1.5 分組及給藥

將造模成功大鼠隨機分為兩組：模型組、陽和湯組，每組各10只，空白對照組10只，所有大鼠灌胃量均為1 mL/100 g大鼠質(zhì)量。陽和湯組予陽和湯配方顆粒灌胃，按人鼠等效劑量換算(體表面積折算法)，每毫升所含生藥藥量為0.5 g。模型組及空白對照組予生理鹽水灌胃。大鼠每周稱重一次，按照體質(zhì)量給藥，三組連續(xù)灌胃6周。所有大鼠試驗期間均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境內(nèi)合籠飼養(yǎng)，室溫18～22℃，相對濕度50%，顆粒飼料自由擇食，正常飲水，保持每天光照14小時。

1.6 標(biāo)本的采集與處理

連續(xù)灌胃8周后，所有大鼠禁食12小時，稱重，予1%戊巴比妥鈉4 mg/100 g腹腔注射麻醉，打開腹腔，腹主動脈取血，3000 r/min離心15分鐘，分離血清，-20℃凍存?zhèn)溆谩＜谞钕俳M織帶臨近氣管取下，4%的多聚甲醛液固定，由雪邦技術(shù)公司石蠟包埋、切片、HE染色。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

正常組大鼠實驗過程中一般狀況及進食量良好，行為及體征未見明顯變化。部分模型組及中藥組大鼠頸背部皮下注射處，可見潰爛，流出黃綠色膿液，膿液流出后3～5天皮膚可愈合，大鼠狀態(tài)良好。模型組大鼠及中藥組大鼠各有一只于造模期間死亡，考慮為造模相關(guān)腹腔感染所致。

2.2 對大鼠甲狀腺功能及甲狀腺自身抗體影響

與正常組大鼠相比，模型組、中藥組大鼠促甲狀腺激素(TSH)明顯降低，血清游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、血清游離甲狀腺素(FT4)明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，模型組與中藥組相比，甲狀腺功能三項無差異；與正常組大鼠相比，模型組、中藥組大鼠TPOAb、TGAb明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，中藥組大鼠TPOAb、TGAb明顯降低(P<0.01)；3組大鼠TPOAb治療前后差值對比，中藥組明顯高于正常組及模型組(P<0.01)。

2.3 大鼠甲狀腺石蠟切片

正常組大鼠甲狀腺結(jié)構(gòu)完整，濾泡大小一致，濾泡腔內(nèi)胞質(zhì)飽滿，濾泡上皮細(xì)胞排律較規(guī)整，間質(zhì)內(nèi)無或僅有少量淋巴細(xì)胞，無纖維結(jié)締組織增生。模型組甲狀腺濾泡大小不一，濾泡破壞明顯，甲狀腺內(nèi)完整濾泡個數(shù)減少，濾泡腔內(nèi)胞質(zhì)減少，80%～100%間質(zhì)存在淋巴細(xì)胞浸潤，可見纖維結(jié)締組織增生。中藥組濾泡細(xì)胞相對較完整，濾泡個數(shù)多于模型組，濾泡腔內(nèi)胞質(zhì)飽滿，30%～50%甲狀腺組織存在淋巴細(xì)胞浸潤，間質(zhì)少量纖維結(jié)體組織增生。

注：A：正常組；B：模型組；C：中藥組

圖1 各組大鼠甲狀腺組織石蠟切片HE染色(×200) 表1 各組大鼠甲狀腺功能、甲狀腺抗體結(jié)果±s)

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01。

3 討論

本實驗?zāi)Ｐ徒M飼養(yǎng)8周后TPOAb抗體滴度無下降趨勢，提示該方法建立的自身免疫性甲狀腺大鼠模型較為穩(wěn)定。與正常組相比，造模成功大鼠出現(xiàn)甲狀腺功能亢進的血清學(xué)表現(xiàn)，可進一步研究該模型甲狀腺功能的變化與時間曲線，探究該模型后期是否可出現(xiàn)與人類橋本氏病一致的甲狀腺功能減退。

陽和湯出自《外科證治全生集》，由熟地黃、肉桂、麻黃、鹿角膠、白芥子、炮姜炭、生甘草七味藥組成，為治療陰疽的名方，具有溫陽散寒、活血化痰、通絡(luò)散結(jié)的功效，現(xiàn)用來治療腫瘤、甲狀腺功能減退、甲狀腺結(jié)節(jié)、慢性淋巴結(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女乳腺小葉增生、痛經(jīng)、骨結(jié)核等40余種疾病的陽虛寒凝證[11]。研究表明，陽和湯具有調(diào)節(jié)免疫[12]、清除過多自由基[13]和激素樣作用[14]。本研究表明，陽和湯具有降低自身免疫性甲狀腺炎大鼠血清抗體及改善甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤、保護甲狀腺組織的功能，對于甲狀腺功能亢進大鼠，使用陽和湯治療8周后對大鼠的甲狀腺功能亢進無影響。

自身免疫性甲狀腺炎在全球范圍內(nèi)都是常見的甲狀腺疾病，自身免疫性甲狀腺炎動物模型現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于動物實驗[15]，而自T淋巴細(xì)胞免疫失調(diào)被認(rèn)為是身免疫性甲狀腺炎的導(dǎo)致甲狀腺病理損傷的主要因素[16]。目前，自身免疫性甲狀腺炎較為一致的認(rèn)識是本病的發(fā)生與遺傳因素和環(huán)境因素綜合作用相關(guān)，免疫、炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等與本病的病情發(fā)展密切相關(guān)。免疫學(xué)研究表明，HT主要是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，甲狀腺維持自身耐受的能力受損，無法抑制自身抗原的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞對自身的過度免疫?，F(xiàn)代研究表明，AT的免疫失調(diào)與Th1/Th2平衡偏移相關(guān)，Th1免疫亢進，引起以細(xì)胞免疫為主的甲狀腺病理損傷。同樣，Th17/Treg的平衡偏移同樣影響甲狀腺的自身免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在HT患者中IL-17過表達，其水平與TgAb及TPOAb呈正相關(guān)[17]，提示Th17細(xì)胞及其炎性細(xì)胞因子可能參與甲狀腺組織的破壞。陽和湯是否通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群平衡，改善甲狀腺自身免疫，尚待進一步研究。

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(本文編輯： 董歷華)

Effect ofYanghedecoction on thyroid structure and thyroid autoantibodies of autoimmune thyroiditis rats

DONGXiaoke，DENGLi，BAIYing，etal.

SecondClinicalMedicalSchool，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China

LIUTonghua，E-mail：thliu@vip.163.com

Objective To observe the effects ofYanghedecoction on thyroiditis structure and thyroid autoantibodies of autoimmune thyroiditis rats. Methods 30 Lewis rats were selected, 10 rats in the normal group, the remaining 20 rats were fed with high iodine diet combine with subcutaneous injection with porcine thyroglobulin to establish autoimmune thyroiditis model. The successful model rats were divided into model group and traditional Chinese medicine(TCM) group, after 8 weeks of intervention, the thyroid function and thyroid globulin antibody (TGAb) were detected by radioimmunoassay (RIA), enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect thyroid peroxidase antibody (TPOAb), thyroid tissue was embedded in paraffin and stained with HE. Results Compared with normal group,TSH of model group and TCM group were significantly decreased while the FT4, TPOAb，TGAb were increased, the results had statistically significant (P<0.01); compared with model group,TPOAb and TGAb og TCM group was lower，the results had statistical significance (P<0.01)；D-value of TPOAb in before and after the treatment of TCM group had obvious difference compared with the normal group and the model group (P<0.01); compared with the model group, the degree of lymphocyte infiltration and the destruction of thyroid follicle cells were decreased in the thyroid tissue sections of the TCM group. ConclusionYanghedecoction can reduce thyroid autoantibodies and the degree of thyroid lymphocyte infiltration, and can protect the thyroid follicular cells in autoimmune thyroiditis rats.

Yanghedecoction; Autoimmune thyroiditis; TPOAb

國家國際科學(xué)合作專項(2015DFA30910)；教育部大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃(201510026002)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院[董笑克(碩士研究生)、白穎(碩士研究生)、洪明昭(碩士研究生)、郭璇(博士研究生)、許光遠(yuǎn)(博士研究生)]；滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院東院區(qū)瘡瘍脈管病科(鄧?yán)?；北京中醫(yī)藥大學(xué)科技處(秦靈靈)；北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點實驗室(孫文)；北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院(劉銅華)；成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院[吳麗娟(博士研究生)]

董笑克(1992- )，女，2015級在讀碩士研究生。研究方向：糖尿病及甲狀腺疾病的中醫(yī)藥防治。E-mail：1025399335@qq.com

劉銅華(1963- )，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：糖尿病及甲狀腺疾病的中醫(yī)藥防治。E-mail：thliu@vip.163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.004

2016-11-13)