翁潔玲， 湯濤， 彭俊玲， 張曉， 張旭， 王芳*

（1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 病理科，廣東 廣州510260；2中山大學(xué)腫瘤防治中心 分子診斷科，廣東 廣州510060）

HPV陽性患者基因分型及病毒負(fù)載量分析

翁潔玲1， 湯濤2， 彭俊玲2， 張曉2， 張旭2， 王芳2*

（1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 病理科，廣東 廣州510260；2中山大學(xué)腫瘤防治中心 分子診斷科，廣東 廣州510060）

目的 研究廣州地區(qū)宮頸人乳頭狀瘤病毒 （HPV）的感染狀況及基因型分布，并探討病毒負(fù)載量與宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的關(guān)系。方法 收集中山大學(xué)腫瘤防治中心2013年7月至2015年10月收治的1 105名女性的宮頸刷取物標(biāo)本，采用表面等離子體諧振技術(shù) （SPR）檢測HPV型別及負(fù)載量，同時(shí)行宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查 （LCT）。細(xì)胞學(xué)檢查陽性患者加做陰道鏡及病理活檢。結(jié)果 共檢測出HPV陽性標(biāo)本210例，感染率為19.00%。共檢出23個(gè)基因型，包括16個(gè)高危型 （HR-HPV）和7個(gè)低危型 （LR-HPV）。單一高危型169例 （15.29%），平均負(fù)載量為 （170.59±85.91）m°；單一低危型20例 （1.81%），平均負(fù)載量為 （111.75±37.39）m°；HPV多重感染21例 （1.90%）。單一HR-HPV陽性患者的平均病毒負(fù)載量顯著高于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Z＝-3.256，P＝0.001）。結(jié)論 SPR和LCT聯(lián)合檢測有助于宮頸癌前病變的診斷，對(duì)進(jìn)一步臨床治療有指導(dǎo)意義。

人乳頭狀瘤病毒；基因型；宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變；表面等離子體諧振；液基細(xì)胞學(xué)檢測

繼乳腺癌和結(jié)直腸癌之后，宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤［1］。 流行病學(xué)研究［2］已證明， 宮頸癌的發(fā)生與高危型人乳頭狀瘤病毒 （HR－HPV）感染和宮頸癌篩查的缺乏有關(guān)。與其他癌癥相比，宮頸癌的篩查是最有成效的。目前最常用的兩種篩查方法是宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查 （LCT）和HPV－DNA檢測。本研究采用表面等離子體諧振法 （SPR）對(duì)HPV進(jìn)行基因分型并對(duì)病毒負(fù)載量進(jìn)行檢測，同時(shí)對(duì)患者行LCT，旨在探討HRHPV病毒負(fù)載量與宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集中山大學(xué)腫瘤防治中心2013年7月至2015年10月期間收治的1 105名女性的宮頸刷取物標(biāo)本。其中HPV陽性患者210名，年齡20～72歲，平均年齡 （43.42±10.08）歲。

1.2 方法

1.2.1 宮頸脫落細(xì)胞采集和處理

采用美國BD公司SUREPATH專用采樣刷收集宮頸鱗柱交界處脫落細(xì)胞，用于HPV分型及LCT檢測。

1.2.2 HPV基因分型檢測

使用北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司的 SPR技術(shù)及配套W2600型生物傳感閱讀儀進(jìn)行HPV基因分型及負(fù)載量檢測。反應(yīng)體系包括89 μL擴(kuò)增混合液、1 μL Taq酶及10 μL DNA樣本，PCR反應(yīng)條件：50℃2 min，94℃4 min；94℃30 s，48℃45 s，72℃20 s，28個(gè)循環(huán)；94℃30 s，65℃45 s，72℃20 s，25個(gè)循環(huán)；4℃終止。向每管擴(kuò)增產(chǎn)物中加入60 μL雜交緩沖液，95℃變性3 min，與SPR生物傳感芯片反應(yīng)，通過軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析判讀。該檢測包括24個(gè)HPV亞型，其中高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81。低危型包括 6、11、40、42、43、44、54、70。結(jié)果檢測值≥40 m°則為陽性。陽性結(jié)果提示該樣本的病毒檢測量>1 pg／μL標(biāo)準(zhǔn)品 （相當(dāng)于>106／mL樣本病毒質(zhì)?？截悢?shù)）。

1.2.3 宮頸液基細(xì)胞學(xué)

LCT結(jié)果按照子宮頸細(xì)胞學(xué)2001版TBS分為無上皮內(nèi)病變或惡性病變 （NILM）、不能明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）、不除外高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀上皮細(xì)胞 （ASC－H）、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變 （LSIL）、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變 （HSIL）及鱗狀細(xì)胞癌 （SCC）。除NILM外，其他病例均屬于LCT陽性患者。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料的比較采用Mann－Whitney U方法，多組計(jì)量資料的比較采用Kruskal－Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染陽性率

受檢的1 105例女性標(biāo)本中，HPV感染陽性共210例，陽性率為19.00% （見表1）。共檢測出23個(gè)HPV亞型，包括16個(gè)高危型 （HR－HPV）和7個(gè)低危型 （LR－HPV）。單一高危型共169例，占全部陽性標(biāo)本的80.48%，其中前三位為HPV52、16、53，分別為27例、26例、15例。單一低危型20例，占全部陽性標(biāo)本的9.52%，其中前三位為HPV54、70、6，分別為7例、7例、3例。HPV多重感染共21例，占全部陽性標(biāo)本的10.00%，其中18例為雙重感染。雙重感染患者中15例為同時(shí)感染2種高危型，3例為高危及低?；旌细腥尽?/p>

表1 HPV單一及多重感染陽性檢出率比較

2.2 LCT結(jié)果及病理活檢結(jié)果

210例HPV陽性患者中，有155例經(jīng)LCT診斷為NILM；LCT陽性共55例，包括16例ASC－US、2例ASC－H、19例LSIL、16例HSIL和2例SCC。LCT陽性患者病理活檢結(jié)果顯示有3例為慢性宮頸炎，30例為CINⅠ級(jí)，20例為CINⅡ／Ⅲ級(jí)，2例為低分化鱗狀細(xì)胞癌 （見表2）。30例CINⅠ級(jí)共檢出11種高危型 （其中檢出9例HPV66和5例HPV52）和2種低危型。20例CINⅡ／Ⅲ級(jí)患者共檢出7種高危型，其中6例為HPV16（5例單一型及1例合并HPV58）。2例SCC患者均為HPV16（1例單一型，另1例合并HPV81）。

表2 LCT陽性患者HPV基因分型及宮頸病理活檢結(jié)果

2.3 高危型HPV負(fù)載量與LCT及病理活檢結(jié)果的相關(guān)性

NILM組及 LCT陽性組患者的平均病毒負(fù)載量分別為159.64 m°和198.19 m°，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Z＝－3.118，P＝0.002）。ASC組、LSIL組和HSIL組患者的平均病毒負(fù)載量分別為200.27 m°、209.33 m°和184.43 m°，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2＝0.885，P＝0.643）。將經(jīng)LCT診斷為NILM的155例患者和病理活檢為慢性宮頸炎的3例患者均歸入陰性組。病理陽性組、CINⅠ級(jí)組及CINⅡ／Ⅲ級(jí)組患者的平均病毒負(fù)載量分別為200.41 m°、197.63 m°和204.90 m°，均高于陰性組的

159.77 m°（Z值分別為－3.256、－2.441和－2.337，對(duì)應(yīng)的P值分別為0.001、0.015和0.019）。而CINⅠ級(jí)組與CINⅡ／Ⅲ級(jí)組的平均病毒負(fù)載量比較，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Z＝－0.178，P＝0.859）。

3 討論

在人類所有的癌癥中，15%的癌癥是由病毒感染引起的，宮頸癌是其中之一［3］。1977年，Harald zur Hausen首次提出HPV與宮頸鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)［2］，并因此榮獲2008年度諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。HPV屬于乳頭狀瘤病毒科，是雙鏈DNA病毒，長約8 000個(gè)堿基對(duì)，目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定出100多種亞型，其中40余種與人類生殖器皮膚黏膜病變相關(guān)。HPV主要感染皮膚和黏膜，并引起感染部位上皮的增生，增生的上皮或乳頭狀瘤在某些情況下具有癌變的可能。根據(jù)致癌風(fēng)險(xiǎn)的高低不同，HPV的型別大致可分為高危型 （HR－HPV）和低危型 （LR－HPV）。HR－HPV是幾乎所有宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要非充分條件［4］。其中HPV16最具致癌風(fēng)險(xiǎn)，全世界55%～60%的宮頸癌病例［5］為HPV16感染者。HPV感染的類型及各類型所占比例因地域或人種的差異而有所不同。本研究中我院體檢的總體HPV感染陽性率為19.00%，居于中間水平。不同地區(qū)感染率的差異，可能與不同地區(qū)的經(jīng)濟(jì)水平、開放程度以及不同的研究人群有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HPV多重感染占HPV陽性例數(shù)的10.00%，明顯低于Bachtiary等[6]報(bào)道的43.7%，亦低于成都地區(qū) （24.3%）及廈門地區(qū) （19.2%），且多重感染仍以二重感染為主。本研究檢出的210例HPV陽性患者中共有23個(gè)亞型，包括16個(gè)高危型和11個(gè)低危型。其中52型、16型和53型是最常見的三種高危型，與萬敏等［7］的報(bào)道具有一致性。本研究中的2例SCC患者均感染HPV16，且20例CINⅡ／Ⅲ級(jí)患者中有6例感染HPV16。

浸潤性宮頸癌存在前驅(qū)病變［8］，高級(jí)別的宮頸上皮內(nèi)病變一般需要3～7年的時(shí)間才發(fā)展成浸潤性宮頸癌［9］。學(xué)者們?cè)噲D找出使宮頸癌前病變發(fā)展成為宮頸癌的各種影響因素，其中HPV病毒負(fù)載量與宮頸癌發(fā)展過程的組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系目前仍然存在爭議。楊娟等［10］的研究提出，CINⅠ級(jí)組、CINⅡ／Ⅲ級(jí)組及SCC組與HPV病毒負(fù)載量呈正相關(guān)。Shen等［11］采用半定量的方法得出宮頸病變程度與HPV病毒負(fù)載量呈正相關(guān)。宮頸炎組、宮頸上皮內(nèi)瘤變 （CIN）組和宮頸癌組的HPV病毒負(fù)載量呈上升趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，單一HR-HPV陽性患者的平均病毒負(fù)載量均顯著高于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而CINⅠ級(jí)組與CINⅡ／Ⅲ級(jí)組的平均病毒負(fù)載量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。何惠華等［12］對(duì)孝感地區(qū)的7 780名婦女同時(shí)行 TCT及 HPV聯(lián)合檢測，結(jié)果表明，隨著HPV平均病毒負(fù)載量的增大，患者的宮頸病變程度越嚴(yán)重。本研究的LCT結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)ASC組、LSIL組和HSIL組的HPV平均病毒負(fù)載量存在類似關(guān)系。

HPV陽性、LCT陰性的患者大部分為一過性感染，加強(qiáng)隨訪更有利于了解病情的轉(zhuǎn)歸?；颊吒敢膺x擇觀察隨訪而非做陰道鏡加病理活檢的有創(chuàng)性檢查。本研究均為常規(guī)體檢患者，鱗狀細(xì)胞癌例數(shù)較少，因此不單獨(dú)列出一組進(jìn)行討論。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，HPV病毒負(fù)載量與宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的發(fā)生具有相關(guān)性，而對(duì)于病變的發(fā)展無預(yù)測作用。SPR和LCT聯(lián)合檢測有助于宮頸癌前病變的診斷，對(duì)臨床進(jìn)一步治療有指導(dǎo)意義。

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（責(zé)任編輯：常海慶）

Analysis on Genotypes and Viral Load of Patients with Human Papillomavirus

WENG Jieling1,TANG Tao2,PENG Junling2,ZHANG Xiao2,ZHANG Xu2,WANG Fang2*
(1Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510260,China;2Department of Molecular Diagnosis,Sun Yat-sen University Cancer Center,Guangzhou 510060,China;*

WANG Fang,E-mail:wangfang@sysucc.org.cn)

ObjectiveTo study the infection and genotype distribution of uterine cervix human papillomavirus(HPV)in Guangzhou, and to explore the relationship between viral load and cervical squamous intraepithelial lesion.Methods 1 105 cases of women admitted to the Sun Yat-sen university cancer center from July 2013 to October 2015 were selected,and their cervical specimens were collected.The HPV genotypes and viral load were detected by surface plasmon resonance(SPR)and liquid-based cytology test(LCT).Patients with positive cytology test then

colposcope and cervical biopsy.Results 210 cases of positive HPV specimens were detected and the infection rate was 19.00%.23 genotypes were detected,including 16 high-risk HPV(HR-HPV)genotypes and 7 low-risk HPV(LR-HPV) genotypes.Among 1 105 cases,169 cases(15.29%)were single HR-HPV genotypes and the average viral load was(170.59±85.91)m°;20 cases(1.81%)were single LR-HPV genotypes and the average viral load was(111.75±37.39)m°;21 cases(1.90%)had multiple HPV infection.The average viral load of patients with positive single HR-HPV was significantly higher than that of negative patients,with statistical difference(Z=-3.256,P=0.001).Conclusions SPR combined with LCT can help for diagnosis of cervical precancerous lesions, which has guiding significance for further clinical treatment.

Human papillomavirus(HPV);Genotype;Cervical squamous intraepithelial lesion;Surface plasmon resonance(SPR); Liquid-based cytology test(LCT)

R737.33

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.05.0608

2016－10－21

2017-03-15

翁潔玲 （1981－），女，碩士學(xué)位，主治醫(yī)師，從事臨床病理診斷工作。

*通訊作者：王芳，病理主治醫(yī)師，E-mail：wangfang@sysucc.org.cn。