張海燕，孫 勇，夏 惠，王 鋒，王少康，邢新會，孫桂菊*，彭 景

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225000；2.東南大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，教育部環(huán)境醫(yī)學工程重點實驗室，南京 210009；3.清華大學化學工程系，工業(yè)生物催化教育部重點實驗室，北京 100084；4.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068)

研究報告

脫氧紫色桿菌素抑制結腸癌TH29細胞增殖及誘導凋亡作用與機制

張海燕1,2，孫 勇3,4，夏 惠2，王 鋒2，王少康2，邢新會3，孫桂菊2*，彭 景1*

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225000；2.東南大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，教育部環(huán)境醫(yī)學工程重點實驗室，南京 210009；3.清華大學化學工程系，工業(yè)生物催化教育部重點實驗室，北京 100084；4.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068)

目的 探討脫氧紫色桿菌素(Deoxyviolacein)對人結腸癌HT29細胞增殖抑制和誘導凋亡及其可能機制。方法 用不同濃度的脫氧紫色桿菌素處理HT29細胞，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法，檢測脫氧紫色桿菌素對HT29細胞的抑制率；流式細胞術檢測細胞周期和凋亡；Western Blot法檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和Caspase9表達的變化。結果 脫氧紫色桿菌素對HT29細胞有明顯的增殖抑制作用；可提高G0/G1期細胞比例，降低S期細胞比例；細胞凋亡率升高，Bax和Caspase9蛋白表達升高，Bcl-2蛋白的表達降低。結論 脫氧紫色桿菌素抑制結腸癌HT29細胞增殖并誘導凋亡，其凋亡機制可能作用于線粒體介導的內源性通路。

脫氧紫色桿菌素；HT29細胞；凋亡

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率和死亡率總體呈上升趨勢[1]，位列全球女性和男性常見惡性腫瘤的第二位和第三位[2]。目前，針對結腸癌的主要治療手段為手術切除，輔以放化療及生物治療等，但治療效果通常不理想，輔助治療產生的副作用大，預后較差[3]。脫氧紫色桿菌素作為一種藍紫色的微生物代謝產物，兼具抗腫瘤[4]、抗革蘭氏陽性菌[5]和抗植物致病菌[6]等活性，屬于低基因毒性物質[7]，在醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應用前景。已有文獻報道，紫色桿菌素和脫氧紫色桿菌素的混合物可以抑制人腫瘤細胞增殖[8, 9]，但對于脫氧紫色桿菌素單獨作用腫瘤細胞的研究很少，其抗腫瘤作用機制尚不明確。本實驗旨在研究脫氧紫色桿菌素對人結腸癌HT29細胞的抑制增殖與凋亡誘導作用，并進一步探索脫氧紫色桿菌素影響HT29細胞凋亡的可能分子機制。脫氧紫色桿菌素結構式如圖1所示。

圖1 脫氧紫色桿菌素的化學結構Fig.1 Structure of deoxyviolacein

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

Centrifude 5424R小型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；TDL-4臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；IX51倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；RT-6000酶標分析儀(美國雷杜公司)；FACSCantoⅡ流式細胞儀(美國BD (Becton, Dickinson)公司)；電泳儀、電泳槽、水平搖床(北京六一廠)；旋渦混勻器(江蘇海門其林貝爾公司)；半干轉膜儀(美國Bio-rad公司)；Image Master VDS凝膠自動成像儀(瑞典Pharmacia公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

結腸癌HT29細胞復蘇后于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)培養(yǎng)。

實驗分組：對照組：用McCoy’s 5A培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細胞；實驗組：分別用含脫氧紫色桿菌素濃度為1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 μmol/L的McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

1.2.2 細胞增殖抑制率檢測

采用MTT比色法。取對數生長期HT29細胞，以2×104/L濃度接種于96孔板，每孔接種150 μL，不同組別均設不加細胞、只加培養(yǎng)液的調零孔，培養(yǎng)24 h后吸棄上清，按照不同組別處理加入培養(yǎng)基，每孔150 μL，以培養(yǎng)12、24、36、48 h為檢測點，每孔加入MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清，加DMSO溶液150 μL，振蕩10 min。以對應的調零孔數值調零，在酶標儀上讀取每孔490 nm處的OD值，根據以下公式計算細胞增殖抑制率。

Progress and application of sub-step in vitro testing methods for skin whitening materials 1 1

增殖抑制率=(1-OD實驗/OD對照)×100%

1.2.3 細胞周期和凋亡檢測

采用流式細胞術。取對數生長期HT29細胞，以1×105/L濃度接種于6孔板，每孔接種2 mL，培養(yǎng)24 h后吸棄上清，加入脫氧紫色桿菌素濃度為0、2.4、9.6、38.4 μmol/L的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集細胞，按照試劑盒操作、染色，流式細胞儀檢測。

1.2.4 凋亡蛋白檢測

采用蛋白免疫印跡(Western-Blot)法。細胞培養(yǎng)處理同1.2.3，每孔加200 μL RIPA裂解液，提取蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，室溫下用含5%脫脂奶粉的TBS封閉2 h。加一抗4 ℃搖床孵育過夜，次日用TBS洗3次，每次10 min，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1 h，TBS洗膜3次，每次10 min，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)檢測雜交信號，以條帶灰度值比間接代表各蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

圖2 脫氧紫色桿菌素對HT29細胞增殖的抑制率Fig.2 Inhibition rate of deoxyviolacein on proliferation of HT29 cells

2 結果

2.1 脫氧紫色桿菌素對HT29細胞的增殖抑制作用

脫氧紫色桿菌素對結腸癌HT29細胞的增殖抑制作用與濃度及作用時間呈相關性，隨著脫氧紫色桿菌素濃度的增加、作用時間的延長，脫氧紫色桿菌素對HT29細胞的生長抑制作用增強(圖2)。當濃度為9.6 μmol/L的脫氧紫色桿菌素作用HT29細胞24 h后，抑制率可達26.0%，在作用時間不變的情況下，抑制率不再隨藥物濃度的增加而升高；濃度為38.4 μmol/L的脫氧紫色桿菌素作用HT29細胞48 h后，抑制率可高達到56.3%(圖2)。以上結果表明，脫氧紫色桿菌素在體外具有較好的抑制腫瘤細胞增殖的效果。

2.2 脫氧紫色桿菌素對HT29細胞周期的影響

流式細胞儀結果顯示，隨著脫氧紫色桿菌素濃度的增加，處于G0/G1期的細胞比例增加，處于S期細胞的比例減少。與對照組相比，2.4 μmol/L和38.4 μmol/L的脫氧紫色桿菌素作用HT29細胞48 h后，G0/G1期細胞比例顯著性增加(P< 0.05)；2.4～38.4 μmol/L的脫氧紫色桿菌素作用48 h后，可使處于S期的HT29細胞比例顯著降低(P< 0.05)(圖3)。以上結果說明，脫氧紫色桿菌素可使結腸癌HT29細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，使DNA復制受阻，從而抑制腫瘤細胞增殖。

2.3 脫氧紫色桿菌素對HT29細胞凋亡率的影響

通過Annexin V/PI雙染色檢測HT29細胞的凋亡程度，結果見圖4。與對照組相比，脫氧紫色桿菌素可顯著增加HT29細胞的凋亡率(P< 0.05)，且呈明顯的劑量相關性；濃度為38.4 μmol/L的脫氧紫色桿菌素作用48 h后，HT29細胞的凋亡率高達34.7%。以上結果表明，脫氧紫色桿菌素可以增加HT29細胞凋亡比例，誘導HT29細胞發(fā)生程序性死亡。

注：與對照組相比，*P < 0.05。圖3 脫氧紫色桿菌素作用HT29細胞48h后對周期的影響Note. Compared with the control group，*P < 0.05.Fig.3 Effect of deoxyviolacein on cell cycle of HT29 cells

注：與對照組相比，*P < 0.05。圖4 脫氧紫色桿菌素對HT29細胞的凋亡的影響Note. Compared with the control group，*P < 0.05.Fig.4 Effect of deoxyviolacein on apoptosis of HT29 cells

2.4 脫氧紫色桿菌素對HT29細胞凋亡相關蛋白表達的影響

經Western-Blot對HT29細胞內相關凋亡蛋白的表達水平分析，結果發(fā)現，隨著脫氧紫色桿菌素濃度的增加，Bax和Caspase9蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低。與對照組相比，濃度為38.4 μmol/L的脫氧紫色桿菌素可明顯增加凋亡蛋白Bax和Caspase9的表達水平(P< 0.05)；濃度為9.6 μmol/L和38.4 μmol/L的脫氧紫色桿菌素可顯著降低Bcl-2蛋白的表達水平(P< 0.05)，詳見表1。從上述結果可知，脫氧紫色桿菌素可以上調促凋亡蛋白Caspase9和Bax的表達，下調細胞存活促進因子Bcl-2的表達，從而促進HT29細胞的凋亡。

表1 脫氧紫色桿菌素對HT29細胞蛋白表達的影響

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group，*P< 0.05.

圖5 不同濃度脫氧紫色桿菌素Caspase9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響Fig.5 Effect of deoxyviolacein on expression of Caspase9, Bax and Bcl-2 in different concentration

3 討論

結直腸癌是由環(huán)境、飲食以及生活方式與遺傳因素等協(xié)同作用的結果[10-12]，近年來，隨著膳食結構和生活飲食習慣的改變，我國結腸癌的發(fā)病率也不斷上升。5-氟尿嘧啶(5-Fu)作為第一個用于治療結直腸癌的化療藥物，可降低術后結腸癌復發(fā)率，已被應用于結直腸癌化療領域20余年[13-15]。已有文獻報道顯示，192 μmol/L的5-Fu作用于HT29細胞24 h和48 h后，抑制率分別可達14.49%和27.79%[16]；而本研究通過MTT實驗發(fā)現，濃度僅為9.6 μmol/L的脫氧紫色桿菌素作用HT29細胞24 h和48 h后，就可以使HT29細胞的增殖抑制率分別高達26.0%和48.0%，顯然脫氧紫色桿菌素對結腸癌HT29細胞的增殖抑制效果要明顯高于常規(guī)化療藥物5-Fu。

細胞無限增殖及凋亡受阻是腫瘤發(fā)病的癥結所在。細胞增殖源于細胞周期的有序進行，受G1/S、G2/M兩個關鍵點的調控；細胞凋亡是由基因控制的細胞自主有序的主動死亡，腫瘤細胞減弱或失去了凋亡能力。干擾細胞周期的正常運轉以及誘導細胞凋亡的發(fā)生已經成為抗癌藥物作用的新靶點。本實驗以不同濃度的脫氧紫色桿菌素處理結腸癌HT29細胞，結果顯示脫氧紫色桿菌素可將HT29細胞阻滯在G0/G1期，使DNA合成受阻，不能進行有絲分裂，抑制結腸癌細胞的無限增殖。濃度在2.4～38.4 μmol/L的脫氧紫色桿菌素作用HT29細胞48 h后，可使早凋及中晚期凋亡的細胞比例均明顯增加，且凋亡比例隨濃度的升高而增加。由此可見，脫氧紫色桿菌素在體外對結腸癌HT29細胞的生長抑制作用，可能是通過阻滯細胞周期、誘發(fā)細胞凋亡來實驗的。

哺乳動物細胞凋亡主要有內部線粒體介導和外部死亡受體介導兩種途徑[17, 18]。為了進一步探索脫氧紫色桿菌素對HT29細胞的凋亡機制，選用Western-Blot法檢測內部線粒體途徑相關蛋白Caspase9、Bax和Bcl-2。Caspase9屬于半胱氨酸蛋白酶家族，是細胞凋亡的重要調節(jié)因子。Bax和Bcl-2屬于Bcl-2家族，通過調節(jié)線粒體通透性以及細胞色素C釋放介導細胞凋亡。其中，Bcl-2是最主要的抗凋亡蛋白，可以穩(wěn)定線粒體膜功能，阻止線粒體釋放細胞色素C等[19]；Bax是最早發(fā)現的促凋亡家族成員，主要存在于細胞質中，受到凋亡刺激后轉位到線粒體，引起細胞色素C的釋放。本實驗結果顯示隨著脫氧紫色桿菌素濃度升高，Caspase9和Bax蛋白表達隨之升高，而Bcl-2的蛋白表達隨之下降，認為脫氧紫色桿菌素可通過內部線粒體途徑誘導HT29細胞凋亡。

當前，結腸癌治療面臨轉移復發(fā)和對放化療產生抗性等主要問題[20]，進一步明確結腸癌細胞凋亡的分子機制，通過誘導癌變細胞凋亡是癌癥治療需要研究的熱點問題。本實驗的結果印證，脫氧紫色桿菌素可抑制結腸癌HT29細胞，并干擾細胞周期，誘發(fā)細胞凋亡，上調Caspase9和Bax蛋白表達、下調Bcl-2蛋白表達可能是其作用機制之一。接下來，我們將進一步觀察脫氧紫色桿菌素對結腸癌細胞其他凋亡通路的影響，為脫氧紫色桿菌素的未來臨床應用提供理論基礎。

[1] 李道娟,李倩,賀宇彤.結直腸癌流行病學趨勢[J].腫瘤防治研究,2015,42(3):305-310.

[2] Ferlay J,Soerjomatarem I,Dikshit R,etal.Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):E359-E386.[3] Laszlo L.Predictive and prognostic factors in the complex treatment of patients with colorectal cancer[J]. Magy Onkol,2010,54(4):383-394.

[4] Jiang PX,Wang HS,Xiao S,etal.Pathway redesign for deoxyviolacein biosynthesis in Citrobacter freundii and characterization of this pigment[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2012,94(6):1521-1532.

[5] Aruldass CA,Rubiyatno,Venil CK,etal.Violet pigment production from liquid pineapple waste by Chromobacterium violaceum UTM5 and evaluation of its bioactivity[J].Rsc Advances,2015,5(64):51524-51536.

[6] Wang HS,WANG FZ,Zhu XF,etal.Biosynthesis and characterization of violacein, deoxyviolaceiri and oxyviolacein in heterologous host, and their antimicrobial activities[J]. Biochemical Engineering Journal,2012,67:148-155.

[7] 孫勇,張金蘭,劉鴻儒,等.紫色桿菌素及脫氧紫色桿菌素的基因毒性評價[J].食品科學,2016,37(9):208-213.

[8] Rodrigues AL,Trachtmann N,Becker J,etal.Systems metabolic engineering of Escherichia coli for production of the antitumor drugs violacein and deoxyviolacein[J].Metab Eng,2013,20:29-41.

[9] Menezes CB, Silva BP, Sousa IM,etal.In vitro and in vivo antitumor activity of crude extracts obtained from Brazilian Chromobacterium sp isolates[J]. Braz J Med Biol Res,2013,46(1):65-70.

[10] Vargas AJ,Thompson PA.Diet and Nutrient Factors in Colorectal Cancer Risk[J]. Nutr Clin Pract,2012,27(5):613-623.

[11] 烏日麗其,宋華,李左軍,等.結直腸癌患病飲食相關危險因素病例對照研究[J].疾病監(jiān)測與控制,2016,10(1):70-72.

[12] 萬德森.結直腸癌流行趨勢及其對策[J].癌癥,2009,28(9):897-902.

[13] Pestalozzi BC，J?ger D，Knuth A.[Systemic therapy for colorectal cancer][J].Der Chirurg,2005,76(6):570-574.

[14] 蔣蔚茹,劉杰.結直腸癌化療進展[J].中國腫瘤,2011,20(3):200-203.

[15] Van Cutsem E,Rivera F,Berry S,etal.Safety and efficacy of first-line bevacizumab with FOLFOX, XELOX, FOLFIRI and fluoropyrimidines in metastatic colorectal cancer: the BEAT study[J].Ann Oncol,2009,20(11):1842-1847.

[16] 周萍.EGCG聯(lián)合5-FU抑制結腸癌HT-29細胞生長及其機制的實驗研究[D].蘇州大學,2008.

[17] 趙彥超,顧耘.細胞凋亡通路研究進展[J].現代醫(yī)學,2013,41(4):285-288.

[18] 劉曉婷,王延讓,張明.線粒體介導細胞凋亡的研究進展[J].環(huán)境與健康雜志,2013,30(2):182-185.

[19] Adams KW,Cooper GM.Rapid turnover of mcl-1 couples translation to cell survival and apoptosis[J]. J Biol Chem,2007,282(9):6192-6200.

[20] Zhang Q,Sha S,Xu B,etal.Prevalence of colorectal cancer in patients with ulcerative colitis: A retrospective, monocenter study in China[J]. J Cancer Res Ther,2015,11(4):899-903.

Effect of deoxyviolacein on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of colon cancer HT29 cells

ZHANG Hai-yan1,2,SUN Yong3，4,XIA Hui2,WANG Feng2,WANG Shao-kang2,XING Xin-hui3,SUN Gui-ju2*,PENG Jing1*

(1.College of Food Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225001,China; 2.Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering, Ministry of Education, Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009; 3.Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084,China; 4.China Meat Research Center, Beijing 100068)

Objective To evaluate the effect of deoxyviolacein on the apoptosis in HT29 cells and its possible mechanisms of anticancer effects. MethodsInvitro,human colon cancer HT29 cells were treated by deoxyviolacein in a series of concertrations.The absorbance value was detected by means of MTT assay and growth inhibition rate was calculate.Cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry.The expression of Bax,Bcl-2 and Caspase9 were analyzed by Western blotting.Results Deoxyviolacein could inhibit the growth of human colon cancer HT29 cells.The cells at period G0/G1and the apoptosis rates were significantly increased,and the cells at period S were significantly decreased.The expression of Bax,Caspase9 were upregulated and Bcl-2 was downregulated by deoxyviolacein at 48 hours.Conclusions Deoxyviolacein could inhibit the growth and induce apoptpsis of human colon cancer HT29 cells.The mechanism may be associated with up-regulation of Bax and Caspase9 and down-regulation of Bcl-2 expression.

Deoxyviolacein; HT29 cells; Apoptpsis

張海燕(1991-)，女，碩士研究生，研究方向:營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學。E-mail： zhyrita369@163.com

孫桂菊(1963-)，女，博士生導師，研究方向:植物化學物與食品功效。E-mail： gjsun@seu.edu.cn; 彭景(1962-)，女，副教授，研究方向:烹飪營養(yǎng)學。E-mail： yzupj@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0089-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.019

2017-01-18