陳 浩，楊振國，伍水龍，鄔永富，馮瑜菲，高曉霞，包仕廷*,張晶晶*

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023)

研究報告

Kruppel樣因子6對肝癌HepG2細胞的作用及其缺失對斑馬魚肝臟發(fā)育的影響

陳 浩1,2，楊振國1，伍水龍1，鄔永富1，馮瑜菲1，高曉霞1，包仕廷1,2*,張晶晶1,2*

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023)

目的 探討Kruppel樣因子6(KLF6)低表達對肝癌細胞凋亡及遷移能力的影響，并以斑馬魚作為動物模型，研究klf6基因沉默對肝臟發(fā)育的作用。 方法 構(gòu)建敲除KLF6基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染肝癌細胞(HepG2)及正常人肝細胞(L-02)，通過免疫印跡(WB)、凋亡及細胞周期測定、劃痕實驗檢測KLF6基因敲除后對HepG2細胞的影響；設(shè)計合成沉默KLF6基因的嗎啉代寡核苷酸(Morpholino)，顯微注射入轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(lfabp:eGFP)胚胎中，通過免疫熒光法觀察KLF6蛋白表達的變化以及對轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎肝臟發(fā)育表型的影響。 結(jié)果 體外實驗表明，L-02細胞中的KLF6蛋白的表達量明顯高于HepG2細胞；敲除KLF6基因后，HepG2細胞KLF6蛋白表達明顯減少、凋亡減弱、細胞周期主要集中于S期、遷移能力增強；體內(nèi)實驗表明，klf6基因沉默后，斑馬魚胚胎肝臟中的KLF6蛋白表達量減少，肝臟發(fā)育明顯遲緩。 結(jié)論KLF6基因低表達促進肝癌細胞的增殖和遷移能力，減少凋亡；且影響斑馬魚肝臟的正常發(fā)育。探討KLF6基因低表達及其功能，可為以后斑馬魚肝癌模型建立及藥物篩選提供理論基礎(chǔ)。

KLF6基因；HepG2細胞；斑馬魚；Morpholino

肝細胞癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)已成為最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤[1]，在世界上所有惡性腫瘤中現(xiàn)在排名第六，在所有癌癥死亡率中排第三位[2]。Kruppel樣因子6(KLF6)是Kruppel-like factor(KLF)家族基因編碼一系列蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在哺乳動物中KLF基因至少含有18種家族成員，其蛋白C端均含有“C2H2”鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。KLF家族成員在胚胎發(fā)育，細胞分化、增殖及凋亡等多種過程中均起著重要的作用[3]；且KLF6是一種有效的生長調(diào)節(jié)劑和抑癌基因[4]。

KLF6在斑馬魚中的同源基因為corepromoterelementbindingprotein(copeb)基因，是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子和抑癌基因。研究表明，在斑馬魚發(fā)育過程中，copeb在消化系統(tǒng)中具有很高的表達水平。利用嗎啉代寡核苷酸Morpholino特異性沉默了copeb基因后，肝、胰腺和小腸的發(fā)生及發(fā)育過程受到嚴重的影響[5]。

本文通過檢測KLF6基因的低表達對肝癌細胞的影響，進一步驗證KLF6基因的抑癌作用；并通過斑馬魚肝體內(nèi)實驗，驗證klf6基因缺失對斑馬魚肝發(fā)育的影響，為以后利用模式動物斑馬魚建立肝癌模型，進一步對KLF6基因進行研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(lfabp:eGFP)由廣東醫(yī)科大學(xué)斑馬魚模式動物平臺提供。

1.2 主要材料及試劑

肝癌細胞HepG2及正常人肝細胞L-02由廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科研究所提供。

KLF6多克隆抗體、DAPI、Hoechst抗體購自Sigma公司(美國)；Cy5、Cy3標記的山羊抗兔IgG抗體均購自Jackson公司(美國)；Rhodamine購自invitrogen公司(美國)；β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記羊抗兔、羊抗鼠IgG抗體均購自中杉金橋公司(北京)；Morpholino購自Gene Tools公司(美國)序列：5’-TGCACATTGGTAGAACATCCATT GC’-3；piLenti-shRNA-GFP質(zhì)粒購自恩晶公司(上海)；周期檢測試劑盒購自碧云天公司(上海)；DMEM、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

肝癌細胞HepG2及正常人肝細胞L-02，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)及傳代。將HepG2及L-02細胞以3×105/孔的密度接種至6孔板中，當細胞密度達到70%～90%時，利用EnoGeneFecTM2000(EGF2000)對敲除KLF6基因質(zhì)粒piLenti-shRNA-GFP進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染8 h后，換成含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h(sh-KLF6組)。同時設(shè)立未經(jīng)任何處理的空白對照組(Control組)及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(Control-sh)組。

1.3.2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚飼養(yǎng)及交配

轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(lfabp:eGFP)，在28 ℃循環(huán)水系統(tǒng)中培育，豐年蝦喂食，交配后，收集魚卵在胚胎水中培育，放入28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)[6]。

1.3.3 細胞免疫熒光

將HepG2及L-02細胞以3×105個接種共聚焦皿，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；冰浴下丙酮固定10 min；孵育一抗：將濃度為1 mg/mL的KLF6多克隆抗體以1∶200稀釋，并在每個共聚焦皿中加入200 μL，4 ℃ 過夜；孵育二抗：將濃度為1.5 mg/mL的Cy5標記的羊抗兔IgG(H+L)以1∶200稀釋，并于每個共聚焦皿中加入200 μL，37 ℃ 孵育90 min，4 ℃保存超過30 min；共聚焦顯微鏡下拍照(Leica，德國)，Image-pro Plus 6.0分析圖片數(shù)據(jù)，檢測KLF6蛋白在HepG2及L-02細胞系中的表達差異。

1.3.4 Western-blot檢測敲除KLF6基因后細胞KLF6蛋白的表達

參照1.3.1方法將piLenti-shRNA-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2、L-02細胞，并設(shè)立空白對照組(Control組)，24 h后，裂解細胞，4 ℃、12000 r/min 離心10 min；收取上清蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，以110 V、120 min將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的TBST中封閉2 h，分別孵育抗KLF6、β-actin抗體(1∶1000)，4 ℃搖床過夜，TBST洗3次，每次10 min，孵育辣根過氧化物酶標記羊抗兔、羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育120 min，TBST洗3次，每次10 min；GDEQ成像儀(Bio-Rad美國)曝光膠片，并用Quantity one軟件分析條帶。

1.3.5 HepG2細胞凋亡檢測

以1×105/孔的密度接種HepG2細胞到24孔板中，孔中放置已鋪collagen膠的細胞玻片，分為3組，Control組、Control-sh組及sh-KLF6組；轉(zhuǎn)染結(jié)束后(方法見1.3.1)，PBS洗3次，每次5 min，冰上丙酮固定10 min，冰浴75%乙醇洗脫丙酮，冰浴PBS洗2次，每次5 min，Blocking buffer(1%BSA+0.05% Tween20)常溫下放置15 min，按推薦的濃度加入抗體，并加入Hoechst(1∶200)室溫孵育90 min，Blocking buffer洗5次，每次5 min，封片；Leica熒光顯微鏡(德國)下拍照，并用Image-Pro Plus 6.0分析圖片。

1.3.6 HepG2細胞周期檢測

以3×105/孔的密度接種HepG2細胞到6孔板中，實驗分為3組，Control組、Control-sh組及sh-KLF6組，轉(zhuǎn)染結(jié)束后(方法見1.3.1)，用含有EDTA的0.25%的胰酶消化，1000 g離心5 min，棄上清，冰PBS重懸細胞，1000 g離心5 min，再次棄上清，加入70%乙醇固定超過12 h，冰PBS洗2次，每次5 min；染色，每個樣品：碘化丙啶(PI)25 μL，RNaseA(50×)10 μL，染色緩存液500 μL，室溫下避光30 min；細胞流式儀(BD FACS-CantoII細胞流式儀，美國)檢測HepG2細胞周期。

1.3.7 HepG2細胞遷移檢測

以3×105/孔的密度接種HepG2細胞到6孔板中，分為3組，Control組、Control-sh組及sh-KLF6組。轉(zhuǎn)染結(jié)束后(方法見1.2.1)，用10 μL槍頭，在6孔板上劃痕，每孔劃5道平行的劃痕，劃痕均勻間隔約0.5 cm，劃痕后PBS洗2次，換成無血清的DMEM培養(yǎng)，并在顯微鏡下于0、24、48 h觀察拍照；分別計算24 h及48 h的劃痕愈合率，計算方法：(0 h劃痕寬度-24 h/48 h劃痕寬度)÷ 0 h劃痕寬度。觀察劃痕后細胞遷移情況。

1.3.8klf6基因沉默后斑馬魚肝臟表型觀察

實驗分為2組，正常對照組(Control組)、注射沉默klf6基因Morpholino組(klf6-MO組)。轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(lfabp:eGFP)交配后，收集魚卵，在1～2個細胞期，將沉默klf6基因的Morpholino以300 mM的濃度顯微注射入胚胎卵黃囊中；將胚胎在胚胎水中28℃培養(yǎng)3 d(3 dpf)，5 d(5 dpf)，7 d(7 dpf)時，進行麻醉，再用1%低熔點瓊脂將2組的胚胎固定在玻底皿中，Leica熒光顯微鏡(德國)下拍照，并用Image-Pro Plus 6.0分析圖片，實驗完成后，將斑馬魚胚胎從低熔點瓊脂中回收繼續(xù)培育。

1.3.9 整體免疫熒光法檢測轉(zhuǎn)基因斑馬魚沉默klf6基因后蛋白表達

轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(lfabp:eGFP)交配后，收集魚卵，分為2組，Control組及klf6-MO組。klf6-MO組顯微注射Morpholino，濃度300 mM；胚胎水中28 ℃培養(yǎng)3 d(3 dpf)，室溫下用4%多聚甲醛固定胚胎魚2 h，室溫下PBST洗3次，每次5 min，室溫下50%甲醇-50% PBST、100%甲醇分別脫水5 min后，換成新的100%甲醇-20℃保存至少2 h；再在室溫下分別加入75%甲醇-25% PBST、50%甲醇-50% PBST、25%甲醇-75% PBST，各5 min，PBST洗5 min，室溫下加入蛋白酶K(Proteinase K，PK)(PK：PBST 1∶1000)消化3 dpf的魚18 min，PBDT洗5 min，加入4%多聚甲醛室溫下再次固定20 min，PBDT洗6次，每次20 min，封閉液(2%FBS+PBDT)封閉1～4 h，加入抗KLF6多克隆抗體(1∶200)，4℃過夜；PBDT洗6次，每次20 min，孵育Cy3標記的羊抗兔IgG抗體，4℃過夜；PBDT洗3次，每次5 min后，Leica熒光顯微鏡(德國)下拍照觀察，并用Image-Pro Plus 6.0分析圖片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細胞免疫熒光結(jié)果

通過免疫熒光結(jié)果可見，KLF6蛋白主要共定位在細胞核。Image-Pro Plus 6.0對熒光強度的分析結(jié)果顯示，HepG2細胞中陽性信號占細胞個數(shù)的百分比為11.73%±1.40%，L-02細胞中陽性熒光信號占細胞個數(shù)的百分比為87.34%±1.75%，可見KLF6蛋白在肝癌細胞HepG2和正常肝細胞L-02中均有表達，且在HepG2中，KLF6蛋白的表達量要明顯的低于L-02，二者差異有顯著性(P< 0.01)(圖1)。

2.2 敲除KLF6基因后HepG2及L-02細胞系中KLF6蛋白的表達

KLF6蛋白在HepG2及L-02細胞中均有表達，且在HepG2中，KLF6蛋白的表達量明顯低于L-02，細胞HepG2及L-02轉(zhuǎn)染了敲除KLF6基因的質(zhì)粒后，細胞中KLF6的蛋白表達量明顯降低。通過Quantity one的灰度分析，HepG2細胞表達KLF6蛋白的灰度值為0.11663±0.011，L-02細胞表達KLF6蛋白的灰度值為0.28032±0.024，二者差異有顯著性(P< 0.001)。敲除KLF6基因后HepG2細胞表達KLF6蛋白的灰度值為0.04686±0.005，L-02細胞表達KLF6蛋白的灰度值為0.08344±0.006，二者與未轉(zhuǎn)染組的比較，差異有顯著性(P< 0.001)(圖2)。

注:(A)a、b細胞核(藍色)；c、d KLF6蛋白(紫色)；e、f 細胞骨架F-actin染色(紅色)及合成圖；(B)1.L-02細胞；2.HepG2細胞；第2組與第1組對比，差異有顯著性；**P < 0.01。圖1 細胞免疫熒光染色圖Note. (A) a, b Nucleus (blue); c, d KLF6 (purple); e, f Cytoskeleton stain with F-actin (red) and Merge. (B) 1. L-02； 2. HepG2; The second group contrast to the first group, with statistical significance, **P < 0.01.Fig.1 Cell immunofluorescence images

注:(A)1. HepG2；2. L-02；3. HepG2敲除KLF6基因；4. L-02敲除KLF6基因；(B)1. L-02；2. HepG2；3. L-02敲除KLF6基因；4. HepG2敲除KLF6基因；第2、3、4組分別與第1組對比，差異有顯著性，***P < 0.001。圖2 敲除KLF6基因后HepG2和L-02細胞KLF6蛋白表達Note. (A) 1. HepG2; 2. L-02; 3. HepG2+piLenti-shKLF6-GFP; 4. L-02+piLenti-shKLF6-GFP. (B) 1. L-02; 2. HepG2; 3. L-02+piLenti-shKLF6-GFP; 4. HepG2+piLenti-shKLF6-GFP; The second, third and fourth group were compared with the first group, with statistical significance, ***P < 0.001.Fig.2 KLF6 expression in HepG2 and L-02 cells with knockdown of KLF6

2.3 敲除KLF6基因后對HepG2細胞凋亡的影響

通過Image-Pro Plus 6.0軟件對圖片進行熒光強度分析，Control組、Control-sh組、sh-KLF6組凋亡細胞占細胞總數(shù)的百分比分別為9.62%±0.85%、15.90%±1.28%、14.93%±1.94%，可以看出HepG2細胞Control組和Control-sh組的固縮細胞核占細胞總數(shù)比例沒有明顯區(qū)別，sh-KLF6組的凋亡固縮細胞核占細胞總數(shù)比例明顯少于Control組，差異有顯著性(P< 0.01)(圖3)。

2.4 敲除KLF6基因后對細胞周期的影響

Control組與Control-sh組對比，細胞處于G0-G1期及S期所占比例沒有明顯差異。sh-KLF6組細胞處于G0-G1期的比例為43.24%±1.66%，明顯少于Control組的59.40%±5.60%；sh-Klf6組細胞處于S期的比例為43.73%±1.40%，明顯多于Control組的31.69%±2.38%；差異有顯著性(P< 0.01)。三組之間，G2-M期沒有明顯差異(圖4)。

注:(A)紅色箭頭標注的致密發(fā)白的細胞核為凋亡細胞；a. Control組；b. Control-sh組；c. sh-KLF6組；(B)1. Control組；2. Control-sh組；3. sh-KLF6組；第3組與第1組對比，差異有顯著性，**P < 0.01。圖3 敲除KLF6基因后對HepG2細胞凋亡的影響Note. (A) Red arrows indicate the dense pale nucleus of apoptotic cells. a. Control; b. Control-sh; c. sh-KLF6. (B) 1. Control; 2. Control-sh; 3. sh-KLF6; The third group contrast to the first group, with statistical significance, **P < 0.01.Fig.3 The effects of knockout of KLF6 on the apoptosis of HepG2

注:(A、B)1. Control組；2. Control-sh組；3. sh-KLF6組；(B)3組中G1期、S期與1組G1期、S期對比，差異有顯著性，**P < 0.01。圖4 敲除KLF6基因?qū)epG2細胞周期的影響Note. (A, B) 1. Control; 2. Control-sh; 3. sh-KLF6; (B) G1 phase, S phase of the third group contrast to G1 phase and S phase of the first group, with statistical significance, **P < 0.01.Fig.4 The effects of knockout of KLF6 on HepG2 cell cycle

2.5 敲除KLF6基因后對細胞遷移能力的影響

劃痕24 h后sh-KLF6組的劃痕愈合率為50.16%±3.12%，Control組的為28.74%±1.33%，Control-sh組的為29.65%±4.64%；劃痕24 h后sh-KLF6組的劃痕愈合率76.35%±2.86%，Control組的為61.26%±2.40%，Control-sh組的為63.23%±3.90%；劃痕24 h及48 h后，可見Control組與Control-sh組的劃痕愈合率比較，差異無顯著性，sh-KLF6組劃痕愈合率較Control組明顯增多，差異有顯著性(P< 0.01)?？梢娗贸齂LF6基因后，HepG2細胞遷移能力明顯增強(圖5)。

2.6 沉默klf6基因后斑馬魚胚胎肝臟表型變化結(jié)果

通過Image-Pro Plus 6.0軟件對斑馬魚肝臟熒光面積進行分析，在3 dpf時，klf6-MO組的肝臟熒光面積為1734.83±331.16，Control組胚胎為7329.75±383.32；5 dpf時，klf6-MO組的肝臟熒光面積為6766.75±376.33，Control組胚胎為26950.75±1393.31；7 dpf時，klf6-MO組的肝臟熒光面積為12138.75±997.61，Control組胚胎為23917.40±958.91；差異有顯著性(P< 0.001)，沉默klf6基因后肝臟發(fā)育明顯延遲。此外，沉默klf6基因后，還出現(xiàn)其他表型變化：心包水腫，魚鰾消失以及卵黃囊炎癥(圖6)。

2.7 沉默klf6基因后斑馬魚胚胎肝臟KLF6蛋白表達結(jié)果

通過Image-Pro Plus 6.0軟件對斑馬魚肝臟熒光強度進行分析，klf6-MO組的IOD值6.72±1.63，明顯小于Control組的肝臟IOD值24.66±3.36；二者差異有顯著性(P< 0.001)。

注:(A)白色橫線之間的寬度為劃痕的寬度；(B)a、b：1. Control組；2. Control-sh組；3. sh-KLF6組；(a)敲除KLF6基因24 h后對HepG2細胞遷移能力的影響；(b)敲除KLF6基因48 h后對HepG2細胞遷移能力的影響；(a、b)第3組與第1組對比，差異有顯著性，**P < 0.01。圖5 敲除KLF6基因后對HepG2細胞遷移能力的影響Note. (A) The width between the white lines is the width of the scratch. (B) a, b: 1. Control; 2. Control-sh; 3. sh-KLF6. (a) Knockout of KLF6 affects HepG2 cells migration ability after 24 h. (b) Knockout of KLF6 affects HepG2 cells migration ability after 48 h; (a, b) The third group contrast to the first group, with statistical significance, **P < 0.01.Fig.5 Knockout of KLF6 effects HepG2 cell migration ability

沉默斑馬魚klf6基因后，斑馬魚胚胎肝臟減小，KLF6蛋白表達量顯著減少(圖7)。

3 討論

注:A、B為Control組(3 dpf)，C、D為klf6-MO組(3 dpf)，E、F為Control組(5 dpf)，G、H為klf6-MO組(5 dpf)，I、J為Control組(7 dpf)，K、L為klf6-MO組(7 dpf)；綠色部分為轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝臟；在統(tǒng)計圖中，3、5、7 dpf中klf-MO組對比Control組差異有顯著性，***P < 0.001。圖6 klf6基因?qū)Π唏R魚肝臟發(fā)育的影響Note. A, B Control at 3 dpf; C, D klf6-MO at 3 dpf; E, F Control at 5 dpf; G, H klf6-MO at 5 dpf; I, J Control at 7 dpf; K, L klf6-MO at 7 dpf; green tissue is the zebrafish liver; In the statistics graph, the klf-MO group in the 3, 5, 7 dpf had statistical significance compared with the Control group, ***P < 0.001.Fig.6 Knockdown of klf6 effects zebrafish liver development

注:(A)白色虛線范圍內(nèi)為斑馬魚肝臟KLF6蛋白抗原抗體結(jié)合部分；a、b 肝臟自帶熒光 (綠色)；c、d 肝臟KLF6蛋白染色(紅色)；e、f 合成圖；(B)1. Control組；2. klf-MO組；第2組與第1組對比，***P < 0.001圖7 klf6基因沉默后斑馬魚肝內(nèi)KLF6蛋白的表達Note. (A) The white dashed line indicates the KLF6 staining in the zebrafish liver; a, b eGFP; c, d KLF6 (red); e, f Merge; (B) 1. Control; 2. klf-MO; The second group contrast to the first group, ***P < 0.001.Fig.7 KLF6 protein expression in the zebrafish liver after klf6 knockdown

肝細胞癌(HCC)是一個主要的公共健康問題，因為缺乏早期診斷和行之有效的治療方法[7]，而成為社會及醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點。目前肝癌治療手段主要有三個，肝腫瘤的手術(shù)切除、經(jīng)皮射頻消融和原位肝移植，尚無有效的藥物治療及基因治療方法[8]，因此迫切的需要找到新的方法治療肝細胞癌；因而人們將目光聚焦在基因水平研究，希望從基因?qū)用嫒チ私獍l(fā)病機理，從而找到更好的治療方式。Narla等人發(fā)現(xiàn)，野生型KLF6通過上調(diào)p53通路中p21WAF1來抑制前列腺癌及肝癌組織中蛋白周期性依賴激酶(CDK)活性，導(dǎo)致細胞在細胞周期G1-S期阻滯，從而抑制腫瘤的生長[9, 10]；Pan等通過對23例肝癌病例組織中KLF6基因的序列分析和KLF6蛋白的表達水平研究，發(fā)現(xiàn)了兩個與肝癌發(fā)生相關(guān)的KLF6基因突變位點，首次揭示了KLF6蛋白第162位氨基酸色氨酸W突變?yōu)楦拾彼酖后導(dǎo)致突變后的KLF6基因?qū)Ω伟┘毎脑鲋呈タ刂疲谕ㄟ^對肝癌細胞系HepG2的研究發(fā)現(xiàn)，當過表達KLF6基因后，可上調(diào)p21WAF1表達含量，達到抑制肝癌細胞中蛋白周期性依賴激酶(CDK)活性，導(dǎo)致肝癌細胞在細胞周期G1-S期阻滯的效果，從而減緩細胞的增殖[11]；2010年，Lee等通過對KLF6基因的低表達對肝癌細胞HepG2的凋亡等的檢測，發(fā)現(xiàn)HepG2的凋亡減少，增殖能力增強[12]。論證了KLF6的突變和表達水平的變化與肝癌發(fā)生的相關(guān)性，以往相關(guān)文獻報道以KLF6基因過表達對肝癌細胞的影響較多，本實驗從報道相對較少的KLF6低表達對肝癌細胞影響的方向繼續(xù)進行研究。

作為人類KLF6的同源基因，斑馬魚klf6基因(copeb)所編碼的 COPEB 蛋白與哺乳動物 KLF6 蛋白的序列的高度保守[13]。并且斑馬魚的性成熟時間只需要3個月的時間，每對交配魚可以大量產(chǎn)卵，受精卵是透明的，可以利用顯微鏡進行實時觀察，同時斑馬魚胚胎發(fā)育很快，受精24 h后主要的器官就可形成[14-16]。因此，利用斑馬魚作為模式動物來探究 KLF6 蛋白及其突變體對肝細胞的增殖、腫瘤發(fā)生發(fā)展提供了堅實的理論基礎(chǔ)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚消化器官包括肝臟發(fā)生于胚胎內(nèi)胚層，Zhao發(fā)現(xiàn)在胚胎干細胞分化的早期階段，klf6促進胚胎干細胞增殖，隨后導(dǎo)致分化成內(nèi)胚層細胞，促進斑馬魚胚胎消化器官增長和擴張；在沉默klf6基因后，斑馬魚肝臟發(fā)育明顯延緩[5]。

本研究中，通過細胞免疫熒光法及Western blot檢測肝癌細胞HepG2及正常肝細胞L-02之間的蛋白表達的差異，可以看出KLF6蛋白在L-02細胞中的表達明顯高于HepG2細胞，可以說明KLF6基因在肝癌細胞中的表達明顯低于正常肝細胞，再次驗證了其抑癌的作用。在敲除HepG2細胞KLF6基因后，HepG2細胞KLF6蛋白表達明顯減少，提示轉(zhuǎn)染成功。再通過細胞凋亡、細胞周期檢測及劃痕實驗，可以看出，敲除KLF6基因后，肝癌細胞HepG2凋亡減少，說明癌細胞增殖能力增強、增值活躍，與Lee等[12]報道的KLF6基因低表達使HepG2細胞增殖能力增強相符；肝癌細胞的遷移能力也增強，與Liang等報道的KLF6基因低表達使HepG2細胞遷移能力增強相互印證[17]；本實驗創(chuàng)新性的對敲除KLF6基因后細胞周期的檢測，可以發(fā)現(xiàn)細胞分裂集中在S期增多，也再一次為KLF6基因的低表達對肝癌細胞的增值能力的增強提供了證據(jù)。體內(nèi)實驗中，沉默斑馬魚klf6基因，經(jīng)過對3 dpf、5 dpf、7 dpf肝臟表型觀察，發(fā)現(xiàn)沉默klf6基因的斑馬魚胚胎肝臟發(fā)育明顯延遲于同時期對照組，與Zhao等[5]報道的klf6基因沉默對斑馬魚胚胎肝臟發(fā)育延遲相符合。以往實驗多通過原位雜交方法，在基因水平檢測斑馬魚胚胎肝中Klf6基因沉默后mRNA的表達減少，本實驗通過整體免疫熒光法，對3 dpf的胚胎KLF6蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)沉默klf6基因的斑馬魚胚胎肝臟中的KLF6蛋白表達明顯低于對照組；從蛋白水平說明klf6基因?qū)Π唏R魚肝臟發(fā)育有重要作用。

綜上所述，KLF6低表達增強細胞增殖能力，促進肝癌細胞遷移，抑制斑馬魚肝細胞發(fā)育過程，提示KLF6基因在細胞遷移與分化進程可能扮演不同的角色。本研究驗證了KLF6基因在肝發(fā)育和肝癌發(fā)展中的重要作用，為以后建立穩(wěn)定的斑馬魚肝癌模型，研究KLF6基因的功能及抑癌機制提供實驗基礎(chǔ)。

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Effects of Kruppel-like factor 6 on HepG2 and the development of liver in zebrafish

CHEN Hao1,2, YANG Zhen-guo1, WU Shui-long1, WU Yong-fu1, Feng Yu-fei1, GAO Xiao-xia1, BAO Shi-ting1,2*, ZHANG Jing-jing1,2*

(1. Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, China; 2. Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, China)

Objective To investigate the effects of Kruppel-like factor 6 (KLF6) on the apoptotic and migration ability of HepG2 cell, and the developmental role ofKLF6 on zebrafish liver. Methods Constructed plasmid with shRNA-KLF6 was transfected in HepG2 and L-02. The impacts of loss ofKLF6 on HepG2 was investigated by Western bolt, apoptosis analyses, cell cycle detection and scratch experiment;KLF6 morpholino oligonucleotides was microinjected into the Tg(lfabp:eGFP) transgenic zebrafish embryos. The morphant phenotype of the liver was imaged and the protein expression of KLF6 after knockdown ofKLF6 was analyzed by Immunofluorescence staining. Results The expression of KLF6 in L-02 was significantly higher than in HepG2. After knockout ofKLF6, KLF6 protein expression and apoptosis were significantly reduced. In addition, the cell cycle mainly stated in S phase and the migration ability of HepG2 was enhanced. Afterklf6 knockdown in transgenic zebrafish larvae, the development of zebrafish liver was delayed and KLF6 expression was obviously decreased in the liver. Conclusions The reduction of KLF6 expression increased the proliferation and migration ability, and reduced the apoptosis of HepG2. Loss ofKLF6 affects the development of zebrafish liver, which may open a possibility to use zebrafish as a liver cancer model and for anti-liver cancer drug screening.

KLF6; HepG2; Zebrafish; Morpholino

廣東省科技計劃項目(2013B060300021)；廣東省“培養(yǎng)高層次人才特殊支持計劃”專項基金(粵人才辦〔2015〕8號)；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃(YQ2015081)；廣東醫(yī)科大學(xué)科研基金(XK1418)。

陳浩(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：肝膽外科學(xué)。E-mail： 1024742919@qq.com

包仕廷，男，教授。E-mail： bst1967@sohu.com； 張晶晶，男，博士，教授。E-mail： gdmccrc@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0042-09

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.011

2016-11-19