符麗珍，黃茂芹，勞之勇，肖孟生，朱德康

(1.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院內(nèi)科，海口 570203；2.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院心血管內(nèi)科，?？?570203)

miR-221在H2O2誘導的大鼠心肌細胞損傷中的作用及機制研究

符麗珍1，黃茂芹2，勞之勇1，肖孟生1，朱德康1

(1.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院內(nèi)科，?？?570203；2.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院心血管內(nèi)科，?？?570203)

目的 探討miR-221在過氧化氫(H2O2)誘導的大鼠心肌細胞(H9c2)損傷中的作用及機制研究。方法 MTT法檢測不同濃度H2O2對H9c2細胞的損傷作用，RT-PCR法檢測miR-221表達量。通過Lipofectamine 2000將miR-221 inhibitor及陰性對照轉(zhuǎn)入H9c2心肌細胞，并將實驗分為4組，正常對照組，模型對照組(H2O2組)，陰性對照組(H2O2+陰性對照組)，抑制組(H2O2+miR-221 inhibitor組)。MTT法檢測細胞活力，吖啶橙染色檢測細胞凋亡情況，Western blot檢測Bax，Bcl-2，10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因蛋白(PTEN)及p-蛋白激酶(AKT)表達。結(jié)果 0、25、50、100、200、400 μmol/L H2O2對H9c2細胞活力的抑制作用逐漸加強，其中200 μmol/L H2O2對細胞活力抑制程度適中，因此作為后續(xù)誘導劑量。與正常對照組比較，模型對照組及陰性對照組中miR-221表達量顯著上調(diào)(P< 0.01)，H9c2細胞活力降低(P< 0.01)，細胞凋亡率顯著提高(P< 0.01)，Bax及PTEN表達量上調(diào)(P< 0.01)，Bcl-2及p-AKT表達量下調(diào)(P< 0.01)。與模型對照組及陰性對照組比較，抑制組中miR-221表達量顯著下調(diào)(P< 0.01)，H9c2細胞活力提高(P< 0.01)，細胞凋亡率顯著降低(P< 0.01)，Bax及PTEN表達量下調(diào)(P< 0.01)，Bcl-2及p-AKT表達量上調(diào)(P< 0.01)。結(jié)論 miR-221低表達能顯著抑制H2O2誘導的H9c2心肌細胞氧化應激損傷，與調(diào)控PTEN/AKT信號通路有關(guān)。

miR-221；H9c2心肌細胞；氧化應激；凋亡；PTEN/AKT信號通路

在正常生理情況下，機體內(nèi)氧自由基及活性氧的生成和清除處于動態(tài)平衡，而在病理情況下，活性氧的生成遠大于機體清除能力后，會造成組織和細胞氧化應激損傷。大量研究證實，心血管疾病心肌梗死，心力衰竭，心肌重塑，心肌缺血及心肌缺血再灌注等病理條件下，機體會產(chǎn)生大量的氧自由基及活性氧，造成心肌組織及細胞氧化應激損傷，使得心肌細胞大量的凋亡或者壞死，加重病情，并造成惡性循環(huán)。其中細胞壞死一般是發(fā)生在心肌缺血或者缺血再灌注的終末階段，而心肌細胞凋亡貫穿于整個心血管疾病病理過程。因此，抑制氧化應激引起的心肌細胞凋亡，對于心血管疾病的治療將具有顯著的改善作用[1, 2]。miRNA是一類具有18～23 nt氨基酸的保守的內(nèi)源性非編碼RNA分子，能結(jié)合于其下游靶基因mRNA的3’UTR端，進而對基因進行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，從而參與細胞的生長，凋亡，增殖，凋亡，遷移等生物學行為，也因此，miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括心血管疾病[3, 4]。但是miRNA在心血管疾病的氧化應激損傷中的研究較少，所以本研究將選取一個miRNA，探討其在心肌氧化應激中的作用。研究已顯示miR-221在心肌梗死，心力衰竭等高表達，且miR-221與心肌氧化應激密切相關(guān)[5-7]，但是具體的機制尚未見報道，因此，本研究將探討miR-221在過氧化氫(H2O2)誘導的大鼠心肌細胞(H9c2)損傷中的作用及具體機制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

大鼠心肌細胞H9c2購于中國科學院上海細胞庫。兔抗Bax，Bcl-2，PTEN，AKT，p-AKT，GAPDH單克隆抗體購自美國Epitmics公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Lipofectamine 2000，trizol 試劑盒，一步法RT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，MTT購自美國Gibco公司。miR-221 inhibitor(5’-GAAACCCAGCAGACAAUGUA GCU-3’)及miR-221陰性對照(正義鏈：5’-CGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈：5’-ACGUGACA CGUUCGGAGAATT-3’)由廣州市銳博生物科技有限公司訂購合成。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀購自北京六一儀器廠；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀購自瑞士TECAN集團公司；熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同濃度的H2O2處理H9c2心肌細胞

將處于生長對數(shù)期的H9c2細胞接種于96孔板后，24 h后，0、25、50、100、200、400 μmol/L H2O2作用48 h，采用MTT法檢測H2O2對H9c2心肌細胞活力的影響。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組

通過Lipofectamine 2000將miR-21 inhibitor及陰性對照轉(zhuǎn)染到H9c2細胞中，轉(zhuǎn)染濃度分別為200 nm和200 nm，6 h后換成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，RT-PCR法檢測miR-221 inhibitor轉(zhuǎn)染效果。另將實驗分為4組，正常對照組，模型對照組(H2O2組)，陰性對照組(H2O2+陰性對照組)，抑制組(H2O2+miR-221 inhibitor組)。

1.2.3 RT-PCR檢測miR-221表達量

采用trizol試劑盒提取總RNA，并檢測RNA純度。接著一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄，最后進行realtime-PCR，采用2-△△t方法對目的基因進行定量分析。引物設計如下，miR-221上游引物：5’- GGGCATGAACCTGGCATAC-3’， 下游引物：5’- AGGTAGCCTGAAACCCAGCA-3’。GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’。引物分別加入25 μL的PCR反應體系中，反應條件為94℃變性45 s，59℃復性45 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)。

1.2.4 MTT法檢測細胞活力

按“1.2.1”或 “1.2.2”方法處理細胞，將細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入終濃度為5 mg/mL 的MTT 20 μL，4 h后，將上清液棄掉，每孔加入150 μL的二甲基亞砜，10 min后，酶標儀570 nm處測定OD值。

1.2.5 吖啶橙染色檢測細胞凋亡

按“1.2.2”方法處理細胞，將細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞，并加入1×Buffer A重懸細胞，接著將細胞濃度調(diào)整為106/mL，取95 μL細胞懸液加入5 μL的吖啶橙染液，并混合均勻，室溫條件下避光染色15 min，后將細胞懸液接種于載玻片上，并蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，利用Image pro plus6.0軟件分析圖像計算細胞凋亡率(%)。其中正常細胞被均為染成黃綠色，而凋亡細胞胞質(zhì)濃縮，細胞核破碎成點狀，呈致密濃染的綠色。

1.2.6 Western-blot

按“12.2”方法處理細胞，將細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞加入裂解液裂解30 min，離心，獲得蛋白樣品。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品煮沸變性10 min，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，轉(zhuǎn)膜30～40 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗Bax，Bcl-2，PTEN，AKT，p-AKT，GAPDH單克隆抗體，稀釋度皆為1∶100)4°C孵育過夜。次日二抗溶液(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，稀釋度為1∶200)室溫孵育1 h，并滴加化學曝光液，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)通過采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組之間比較采用t檢驗，以P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對H9c2細胞活力的影響

注：與0 μmol/L H2O2比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖1 H2O2對H9c2細胞活力的影響Note.Compared with 0 μmol/L H2O2, *P < 0.05，**P < 0.01.Fig.1 Effect of H2O2 on H9c2 cell viability

如圖1所示， 0、25、50、100、200、400 μmol/L H2O2處理H9c2心肌細胞48 h后，MTT實驗結(jié)果表明，隨著H2O2劑量濃度的增加，H9c2細胞活力逐漸下降，差異有顯著性(P< 0.01)。在200 μmol/L 時，既能顯著抑制H9c2細胞活力，又不會使大量細胞凋亡，所以選此劑量濃度作為后續(xù)實驗研究的誘導劑量。

2.2 miR-221在H2O2誘導的H9c2細胞中的表達量

與正常對照組(0.18±0.02)比較，模型對照組(0.94±0.09)細胞中miR-221表達量顯著提高，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.3 miR-221 inhibitor的轉(zhuǎn)染效果

如圖2所示，與正常對照組比較，模型對照組及陰性對照組中miR-221表達量顯著提高，差異有顯著性(P< 0.01)；與模型對照組及陰性對照組比較，抑制組中miR-221表達量顯著降低，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：(1)正常對照組；(2)模型對照組；(3)陰性對照組；(4)抑制組；與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組及陰性對照組比較，##P < 0.01。圖2 miR-221 inhibitor的轉(zhuǎn)染效果Note.(1)normal control group;(2)model control group;(3)negative control group;(4)inhibition group；Compared with normal control group, **P<0.01; Compared with model control group and negative control group, ##P < 0.01.Fig.2 Effect of miR-221 inhibitor transfection

2.4 miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2細胞活力的影響

注：(1)正常對照組；(2)模型對照組；(3)陰性對照組；(4)抑制組；與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組及陰性對照組比較，##P < 0.01。圖3 miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2細胞活力的影響Note.(1)normal control group;(2)model control group;(3)negative control group;(4)inhibition group；Compared with normal control group, **P<0.01; Compared with model control group and negative control group, ##P < 0.01.Fig.3 Effect of miR-221 inhibitor on viability of H9c2 cell induced by H2O2

如圖3所示，與正常對照組比較，模型對照組及陰性對照組中細胞活力顯著降低，差異有顯著性(P< 0.01)；與模型對照組及陰性對照組比較，抑制組中細胞活力顯著提高，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.5 miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡的影響如圖4所示，與正常對照組(3.47±0.35)比較，模型對照組(45.49±4.56)及陰性對照組(43.97±4.40)中細胞凋亡率顯著提高，差異有顯著性(P< 0.01)；與模型對照組及陰性對照組比較，抑制組(7.21±0.72)中細胞凋亡率顯著降低，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：(1)正常對照組；(2)模型對照組；(3)陰性對照組；(4)抑制組。圖4 miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡的影響(×200)Note.(1)Normal control group;(2)Model control group;(3)Negative control group;(4)Inhibition group.Fig.4 Effect of miR-221 inhibitor on viability of H9c2 cell induced by H2O2

2.6 miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2細胞中Bax及Bcl-2表達量的影響

如圖5，與正常對照組比較，模型對照組及陰性對照組中Bax表達量上調(diào)，Bcl-2表達量下調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)；與模型對照組及陰性對照組比較，抑制組中Bax表達量下調(diào)，Bcl-2表達量上調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：(1)正常對照組；(2)模型對照組；(3)陰性對照組；(4)抑制組；與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組及陰性對照組比較，##P < 0.01。圖5 miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2 細胞中Bax，Bcl-2表達量的影響Note.(1)Normal control group;(2)Model control group;(3)Negative control group;(4)Inhibition group；Compared with normal control group, **P<0.01; Compared with model control group and negative control group, ##P < 0.01.Fig.5 Effect of miR-221 inhibitor on the expression of Bad and Bcl-2 in H9c2 cell induced by H2O2

2.7 miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2細胞中PTEN及p-AKT表達量的影響

如圖6所示，與正常對照組比較，模型對照組及陰性對照組中PTEN表達量上調(diào)，p-AKT表達量降低，差異有顯著性(P< 0.01)；與模型對照組及陰性對照組比較，抑制組中PTEN表達量下調(diào)，p-AKT表達量上升，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：(1)正常對照組；(2)模型對照組；(3)陰性對照組；(4)抑制組；與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組及陰性對照組比較，##P < 0.01。圖6 miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2細胞中PTEN及p-AKT表達量的影響Note.(1)Normal control group;(2)Model control group;(3)Negative control group;(4)Inhibition group；Compared with normal control group, **P<0.01; Compared with model control group and negative control group, ##P < 0.01.Fig.6 Effect of miR-221 inhibitor on the expression of PTEN and p-AKT in H9c2 cell induced by H2O2

3 討論

1993年Lee首次在研究線蟲的發(fā)育調(diào)控過程中發(fā)現(xiàn)了miRNA，并命名為Lin-4，爾后2000年Reinhart也在線蟲發(fā)現(xiàn)了另一個miRNA(Line-7)，因此miRNA迅速的成為生命科學領域的關(guān)注熱點。miRNA是一類長度約為18-25 nt的高度保守的小RNA，能通過與其靶基因的3’-UTR區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后水平，從而參與細胞生長，增值，分化與凋亡的調(diào)控，與機體的發(fā)育、代謝及眾多疾病的進展密切相關(guān)。近些年研究發(fā)現(xiàn)miRNA與心肌梗死，心力衰竭，心臟重構(gòu)，心肌缺血再灌注等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[8, 9]。而且研究也進一步顯示miRNA與心血管基本氧化應激損傷密切相關(guān)，如Xu等[10]研究顯示miR-19b在H2O2誘導的H9c2心肌細胞中高表達，下調(diào)miR-19b表達能顯著抑制H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡。Li等[11]研究顯示miR-139在H2O2誘導的H9c2細胞中低表達，上調(diào)miR-139表達能顯著抑制H2O2誘導的H9c2細胞凋亡。而miR-221被發(fā)現(xiàn)較早，是從斑馬魚中獲得并克隆的miRNA，后來又在白血病細胞株HL-60進一步克隆獲得。miR-221一直以來都被認為具有抑癌基因，在肺癌，乳腺癌，胃癌等多種腫瘤中高表達，并與miR-222是同一個onco-miR，都位于X染色體p11.3區(qū)[12]。而且Souza等[5]研究也表明miR-221在心力衰竭高表達。Coskunpinar等[6]研究證實心肌梗死組織中多種循環(huán)miRNA表達量異常，其中循環(huán)miR-221表達量最高，是正常組的3.89倍，且與心肌損傷標志物超敏心肌肌鈣蛋白T及GARCE、 Synthax評分密切相關(guān)，提示循環(huán)miR-221是心肌梗死早期診斷新的標記物。另外miR-221與糖尿病心肌氧化應激密切相關(guān)[7]，對缺氧再復氧引起的H9c2細胞凋亡具有保護作用[13]。所以本研究推測miR-221與心肌氧化應激損傷密切相關(guān)。

H2O2作為活性氧中的一種，常常被用來模擬心肌細胞、神經(jīng)元細胞等細胞的氧化應激損傷模型，因此本研究首先采用不同濃度 的H2O2誘導心肌細胞，并結(jié)合MTT實驗發(fā)現(xiàn)200 μmol/L H2O2能降低H9c2細胞一半活力，且此誘導劑量與以往文獻報道一致[14, 15]，因此被用于后續(xù)實驗誘導劑量。接著利用RT-PCR法檢測H2O2誘導的H9c2細胞中miR-221的表達量，結(jié)果表明H2O2組中miR-221表達量上升，與Souza等[5]，Coskunpinar等[6]研究結(jié)果一致，RT-PCR結(jié)果進一步表明miR-221 inhibitor轉(zhuǎn)染的成功。所以我們接著利用MTT法及吖啶橙檢測miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2細胞活力及凋亡的影響，結(jié)果表明抑制組細胞活力顯著提高，細胞凋亡率顯著降低，提示miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡具有抑制作用。

細胞的凋亡受眾多信號通路調(diào)控，PI3K/AKT信號通路就是其中一種，其具有抗凋亡通路之稱，能通過調(diào)控下游多種靶蛋白如Bax及Bcl-2的表達，從而參與調(diào)控細胞生長、凋亡、分化、遷移、侵襲及血管生成等過程[16, 17]。而同時PI3K/AKT信號通路上游蛋白PTEN是miR-221的下游靶基因[12]。PTEN能將三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化為二磷酸脂酰肌醇(PIP2)，從而負調(diào)控PI3K/AKT信號通路，在細胞凋亡中起重要作用。研究顯示miR-221通過調(diào)控PTEN/AKT信號通路及Bax、Bcl-2的表達參與多種腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展[18-20]。所以本研究繼續(xù)探討miR-221 inhibitor對H2O2誘導的H9c2細胞中PTEN/AKT信號通路的影響，結(jié)果表明miR-221 inhibitor能顯著下調(diào)H2O2誘導的H9c2細胞中PTEN及Bax表達，上調(diào)p-AKT及Bcl-2表達，從而說明下調(diào)miR-221表達能通過激活PTEN/AKT信號通路，并調(diào)控下游蛋白表達，從而抑制H2O2誘導的H9c2細胞凋亡。

綜上所述，miR-221在H2O2誘導的H9c2細胞中高表達，下調(diào)miR-221表達能通過調(diào)控PTEN/AKT信號通路，進而調(diào)節(jié)下游蛋白Bax及Bcl-2表達，從而抑制H2O2誘導的H9c2細胞凋亡。

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The role of miR-221 in the injury induced by hydrogen peroxide in rat myocardial cells

FU Li-zhen1，HUANG Mao-qin2，LAO Zhi-yong1，XIAO Meng-Sheng1，ZHU De-kang1

(1.Department of Hainan Nongken General Hospital，Haikou 570203，China； 2.Department of Cardiology 2 Hainan Nongken General Hospital，Haikou 570203)

Objective To explore the role of miR-221 in the injury induced by hydrogen peroxide (H2O2) in rat myocardial cells (H9c2). Methods The viability of H9c2 cell induced by cell different concentrations of H2O2was determined by MTT. The expression of miR-221 was detected by RT-PCR method. The miR-221 inhibitor and negative control were transferred into H9c2 cells by Lipofectamine 2000, then the cells were divided into normal control group, model control group (H2O2group), negative control group (H2O2+ negative control group), inhibition group (H2O2+miR-221 inhibitor group). The cell viability was measured by MTT assay. Cell apoptosis was detected by acridine orange staining method. The expression of Bcl-2, Bax, phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN, p-protein kinase B (AKT) were assayed by Western Blot. Results 0，25，50，100，200，400 μmol/L H2O2inhibited H9c2 cell activity gradually, of which 200 mol/L inhibition of cell viability moderate, so as a subsequent induction dose. Compared with normal control group, cell viability was decreased (P< 0.01), cell apoptotic rat was increased (P< 0.01), the expression of Bax and PTEN was upregulated (P< 0.01), the expression of Bcl-2 and p-AKT was downregulated (P< 0.01) in model control group and negative control group. Compared with model control group and negative control group, inhibition group proves the contrary. Conclusions Down-expression of miR-221 could significantly inhibit oxidative stress damage in H9c2 cells, which related to regulation of PTEN/AKT signal pathway.

miR-221; H9c2 myocardial cell; Oxidative stress; Apoptosis; PTEN/AKT signal pathway

符麗珍(1980-)，女，主治醫(yī)師。E-mail: 13518828771@qq.com

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0083-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.018

2016-09-14