馮佳佳，吳倩倩，王保強(qiáng)，孫銘艷，陶元勇

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產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌的鑒定及微生物學(xué)性狀研究

馮佳佳1，吳倩倩1，王保強(qiáng)2，孫銘艷2，陶元勇2

目的 對(duì)臨床分離于皮脂腺囊腫標(biāo)本中的菌株進(jìn)行表型和基因型鑒定，描述該菌株的生物學(xué)特性及致病性，為臨床診斷提供準(zhǔn)確地病原學(xué)依據(jù)。方法 對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色等，并使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行鑒定。采用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。提取分離菌株DNA，采用通用引物對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中收錄的16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST同源性對(duì)比。結(jié)果 分離菌株經(jīng)VITEK 2 Compact鑒定為玫瑰色庫克菌，后經(jīng)16S rRNA序列測(cè)定方法鑒定，分離菌株為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌。藥敏試驗(yàn)顯示該菌株對(duì)四環(huán)素、萬古霉素、利福平敏感，對(duì)青霉素、紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、頭孢吡肟、亞胺培南、慶大霉素等均耐藥。結(jié)論 對(duì)于表現(xiàn)型不易鑒定或鑒定不準(zhǔn)確的細(xì)菌，采用16S rRNA序列測(cè)定的方法進(jìn)行鑒定是最準(zhǔn)確的。產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌是引起患者疾病的致病菌。在完善產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌生化反應(yīng)信息的同時(shí)，探索出有效可行的生物學(xué)鑒定方法。

產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌；生物學(xué)特性；16S rRNA

棒狀桿菌屬是革蘭氏染色陽性桿菌，因其一端或兩端呈棒狀膨大而得名。棒狀桿菌屬有103個(gè)種和亞種，其中白喉棒狀桿菌、假白喉棒狀桿菌等40余種與人類致病性有關(guān)。產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌是棒狀桿菌屬的新種，由Tong J等在2006年從美國一所醫(yī)學(xué)研究中心采集的一例腹股溝膿腫標(biāo)本中分離，并根據(jù)其表型特點(diǎn)于2010年正式將其命名為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌[1]。仝佳等認(rèn)為該菌極有可能為非致病菌[2]。但本研究將皮脂腺囊腫患者的膿液標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，僅分離得到產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌單一菌株。本研究旨在通過表型和基因型鑒定更具體的描述該菌的生物學(xué)特性，為臨床實(shí)驗(yàn)診斷提供病原學(xué)鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病歷資料 患者，女性，38歲，因“發(fā)現(xiàn)胸骨旁皮膚腫物約1周”來我院就診?；颊甙l(fā)病后，出現(xiàn)腫物進(jìn)行性腫大，可觸及波動(dòng)感，疼痛明顯，體溫?zé)o明顯增高，診斷為“皮脂腺囊腫”收治入院。后于我院行“膿腫切開引流術(shù)”，引流膿液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)+鑒定+藥敏試驗(yàn)。臨床根據(jù)藥敏結(jié)果選用利福平、多西環(huán)素等抗感染治療9 d，患者感染得到有效控制，病情好轉(zhuǎn)出院。

1.1.2 主要儀器與試劑 2720 thermal cycler PCR儀為美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品；DYCP-31DN DNA電泳槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品；FR980凝膠成像儀為上海復(fù)日科技儀器有限公司產(chǎn)品；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，Sanprep DNA柱式DNA膠回收試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；Taq酶，dNTPs,SM0337 DNA Ladder Marker為上海生工生物工程股份有限公司；瓊脂糖凝膠為加拿大BBI公司產(chǎn)品。Tween80購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。16SrRNA序列通用引物:

27F:AGTTTGATCMTGGCTCAG

1429R:GGTTACCTTGTTACGACTT

1.2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)方法 將患者引流膿液標(biāo)本接種于哥倫比亞血瓊脂平板，經(jīng)35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。取菌落及標(biāo)本涂片經(jīng)革蘭染色后鏡檢。使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)GPI卡上機(jī)鑒定，并根據(jù)儀器SOP文件進(jìn)行操作。使用微量生化反應(yīng)管，補(bǔ)做部分生化反應(yīng)。藥敏試驗(yàn)采用K-B法。

1.3 需脂培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 分別接種分離菌株于普通肉湯培養(yǎng)基和加有1% Tween 80的肉湯中，培養(yǎng)于37 ℃，72 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況[3]。

1.4 16S rRNA基因測(cè)序分析

1.4.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 取分離株接種于肉湯培養(yǎng)液孵育過夜，加入1.5 mL離心管中，室溫8 000 r/min離心1 min，棄上清，收集菌體。使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行提取。

1.4.2 PCR擴(kuò)增基因序列 反應(yīng)體系(25 μL):基因組DNA 0.5 μL(20～50 ng/μL),10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL， Taq酶0.2 μL,通用引物F(10 μmol/L)0.5 μL，R(10 μmol/L) 0.5 μL，加ddH2O至25 μL，混勻，稍離心，加1滴礦物油。94℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共30輪循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(150 V、100 mA、20 min)，EB染色，采用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4.3 PCR產(chǎn)物回收及測(cè)序 采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對(duì)16S rRNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.4 序列同源性比對(duì) 將16S rRNA基因片段導(dǎo)入美國NCBI網(wǎng)站的BLAST在線軟件，進(jìn)行BLAST序列對(duì)比，獲取與該16S rRNA基因序列同源的序列和對(duì)應(yīng)的細(xì)菌名稱。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定 分離培養(yǎng)48 h后，在血平板上可見圓形，光滑，中央隆起，透明的小菌落(圖1)。標(biāo)本及菌落涂片經(jīng)革蘭染色后可見革蘭氏陽性桿菌，棒狀(圖2)。使用VITEK 2 Compact 鑒定，GPI卡鑒定結(jié)果為玫瑰色庫克菌，鑒定值為89%，生化反應(yīng)編碼為000064100000000。生化反應(yīng)如下：脲酶(-)，β-葡糖醛酸糖苷酶(+)，β-半乳糖苷酶(-)α-糖苷酶(-)，β-糖苷酶(-)，N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(-)，葡萄糖(-)，核糖(-)，木糖(-)，蔗糖(-)，麥芽糖(-)，甘露醇(-)。后參考《實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜》補(bǔ)做：觸酶(+)，硝酸鹽還原試驗(yàn)(+)，CAMP試驗(yàn)(+)，動(dòng)力(-)，七葉苷水解試驗(yàn)(-)，O/F 試驗(yàn)為F。親脂性培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，分離菌株可生長(zhǎng)于添加有1% Tween 80的肉湯中，在單純?nèi)鉁囵B(yǎng)基中培養(yǎng)3 d仍無細(xì)菌生長(zhǎng)，這說明該分離菌株具有親脂性。由于玫瑰色庫克菌為革蘭氏陽性球菌，其鏡下特點(diǎn)與分離菌株明顯不符，故后續(xù)進(jìn)行16S rRNA檢測(cè)來鑒定該菌株。

圖1 菌株分離培養(yǎng)48 h后Fig.1 Isolated strains after 48 h of incubation

圖2 標(biāo)本及菌落涂片經(jīng)革蘭氏染色后Fig.2 Specimens and colony smear after gram staining

2.2 分離株與06-17730T菌株生化反應(yīng)比較 見表1。

表1 分離株與06-17730T菌株生化反應(yīng)比較表
Tab.1 Biochemical reaction of the 06-17730Tstrain of description and the isolated strain

生化反應(yīng)06-17730T分離菌株CAMP試驗(yàn)(CAMPreaction)-+硝酸鹽還原(Reductionofnitrates)-+觸酶(Catalase)++產(chǎn)生(Productionof):β-葡糖醛酸糖苷酶(β-Glucuronidase)++脲酶(Urease)--α-糖苷酶(α-Glucosidase)--β-糖苷酶(β-Glucosidase)--N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-glucosaminidase)--發(fā)酵(Fermentationof):核糖(D-Ribose)+-木糖(D-Xylose)+-葡萄糖(D-Glucose)+-麥芽糖(Maltose)+-蔗糖(Sucrose)+-果糖(Fructose)+未做甘露醇(D-Mannitol)--

+:positive; -:negative

2.3 藥敏試驗(yàn) 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株對(duì)四環(huán)素、萬古霉素、利福平敏感，對(duì)青霉素、紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、頭孢吡肟、亞胺培南、慶大霉素等均耐藥。

2.4 分離菌16S rRNA基因序列分析 以提取的分離菌株DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，其大小約為1 400 bp(圖3)。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后測(cè)序，顯示16S rRNA基因序列為1 359 bp(圖4)。在NCBI上進(jìn)行BLAST序列對(duì)比，登錄號(hào)為KF372873.1，分離菌株的1 359 bp片段序列與棒狀桿菌屬的產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌新種的16S rRNA基因序列100%一致，因此可以確定該分離菌株為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌。

M: DNA marker; 1: The PCR products of isolated strains.圖3 分離菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR products electrophoresis of isolated strains 16S rRNA gene sequences

圖4 分離菌株16S r RNA基因全序列(1 359 bp)Fig.4 16S rRNA gene sequences of isolated strains(1 359 bp)

3 討 論

棒狀桿菌屬是革蘭氏染色陽性桿菌，棒狀，在自然界中分布廣泛，從致病性角度可以將其分為三類：人類致病菌，動(dòng)植物致病菌，非致病性土壤源菌。目前，對(duì)人類致病棒狀桿菌以白喉棒狀桿菌為代表，其余多被報(bào)道為條件致病菌，對(duì)棒狀桿菌的研究也主要集中在白喉棒狀桿菌致病方面[4]及棒狀桿菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)方面[5-7]，而對(duì)于較為少見的條件致病性棒狀桿菌的報(bào)道相對(duì)較少[8]。因此，在臨床分離到相關(guān)致病菌株時(shí)，可能因?yàn)閰⒖嫉奈墨I(xiàn)較少以及缺乏準(zhǔn)確的鑒定手段而造成漏診。

從皮脂腺囊腫患者的膿液標(biāo)本中分離得到的菌株，經(jīng)鑒定為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌。在仝佳等[1]的研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌細(xì)胞壁內(nèi)不含有結(jié)核硬脂酸，不產(chǎn)生白喉毒素，并且在標(biāo)本中除分離得到產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌外還有其他伴隨菌株，且三者濃度相同，故認(rèn)為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌極有可能為非致病性棒狀桿菌。但在本研究獲得的膿液標(biāo)本中僅分離得到產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌，無其他相關(guān)伴隨菌，并且臨床根據(jù)本次試驗(yàn)的藥敏結(jié)果用藥后，患者感染得到有效控制，病情好轉(zhuǎn)出院。因此認(rèn)為，產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌是引起該患者皮脂腺囊腫的致病菌，其具體致病機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。目前，僅有少數(shù)與產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌相關(guān)的研究[9-11]，產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌可以引起疾病還沒有相關(guān)報(bào)道。通過本次報(bào)道引起臨床醫(yī)生重視，并為臨床疾病的診斷提供病原學(xué)依據(jù)即為本次研究的意義所在。

在本研究中，分離菌株及標(biāo)本經(jīng)革蘭氏染色后見到革蘭氏陽性的棒狀桿菌，這與使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀鑒定的玫瑰色庫克菌的結(jié)果不相符。為準(zhǔn)確鑒定該菌株，后進(jìn)行16S rRNA序列測(cè)定。16S rRNA序列測(cè)定屬于基因型鑒定，相較于常規(guī)的表型鑒定更穩(wěn)定，受環(huán)境影響較小[12-13]，并且16S rRNA序列測(cè)定重復(fù)性好，可以用于所有的病原細(xì)菌。對(duì)于表現(xiàn)型不易鑒定或鑒定不準(zhǔn)確的細(xì)菌，可以采用16S rRNA序列測(cè)定的方法進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定[14]。經(jīng)16S rRNA序列測(cè)定，該分離菌株為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌，屬于棒狀桿菌新種。目前，還沒有在國內(nèi)分離到該菌的相關(guān)報(bào)道，對(duì)其開展的研究也相對(duì)較少，缺乏可以準(zhǔn)確鑒定該菌的表型鑒定方法，所以采用16S rRNA序列測(cè)定方法進(jìn)行鑒定是最準(zhǔn)確的。

為更加全面的描述該分離菌株的生物學(xué)性狀，探索出有效可行的生物學(xué)鑒定方法，在此將該菌株與Tong J等報(bào)道的06-17730T菌株的生化反應(yīng)進(jìn)行了比較(表1)。發(fā)現(xiàn)06-17730T菌株的觸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶試驗(yàn)為陽性，脲酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶陰性，與分離菌株結(jié)果相同；CAMP試驗(yàn)、硝酸鹽還原反應(yīng)試驗(yàn)為陰性，發(fā)酵木糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、核糖，而分離菌株的CAMP試驗(yàn)、硝酸鹽還原反應(yīng)試驗(yàn)為陽性，不發(fā)酵木糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、核糖，說明雖然經(jīng)16S rRNA序列測(cè)定鑒定這兩種菌株均為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌，其部分生化反應(yīng)結(jié)果并不一致，具有多樣性。但二者在觸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶試驗(yàn)、脲酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶試驗(yàn)的結(jié)果表現(xiàn)出的一致性說明產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌的這部分生化反應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定。此外，分離菌株的需脂性培養(yǎng)試驗(yàn)說明分離菌株具有親脂性，與06-17730T菌株結(jié)果相同。因此在進(jìn)行生物學(xué)性狀鑒定時(shí)，若根據(jù)其菌落特點(diǎn)、革蘭氏染色結(jié)果判定分離菌株為革蘭氏陽性的棒狀桿菌，則可進(jìn)一步根據(jù)本研究描述的觸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、脲酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶試驗(yàn)這些相對(duì)穩(wěn)定的生化反應(yīng)及需脂性培養(yǎng)試驗(yàn)，考慮標(biāo)本分離菌株為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌。

綜上所述，產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌是導(dǎo)致該患者皮脂腺囊腫的主要致病菌。目前針對(duì)產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌開展的研究較少，本研究通過描述該分離菌株的生化反應(yīng)，為以后的表型鑒定工作提供更加全面的鑒定依據(jù)。此外，臨床上采用全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，方便且易于操作，但對(duì)于臨床表現(xiàn)型不易鑒定或鑒定不準(zhǔn)確的細(xì)菌缺乏特異性，容易造成漏診，利用16S rRNA序列測(cè)定方法進(jìn)行鑒定更為可靠。目前，對(duì)產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌致病機(jī)制不是十分明確，有待于進(jìn)一步的研究，可以通過進(jìn)一步分析該菌的生化反應(yīng)特點(diǎn)、生長(zhǎng)條件、菌體成分及毒力等方面進(jìn)行探究，還可以通過構(gòu)建動(dòng)物疾病模型，觀察分離菌株對(duì)動(dòng)物的致病性，間接探究其與人類疾病的關(guān)系，這對(duì)于臨床疾病的發(fā)生與發(fā)展，預(yù)防、診斷及治療均具有深遠(yuǎn)意義。

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Identification and microbiological characteristics ofCorynebacteriumpyruviciproducens

FENG Jia-jia1,WU Qian-qian1,WANG Bao-qiang2,SUN Ming-yan2,TAO Yuan-yong2

(1.InstituteofNanomedicineTechnology,DepartmentofLaboratoryMedicine,WeifangMedicalUniversity/InstitutionalKeyLaboratoryofClinicalLaboratoryDiagnostics,12th5-yearProjectofShandongProvince,WeifangMedicalUniversity/KeyDisciplineofClinicalLaboratoryMedicineofShandongProvince,AffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China; 2.ClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

The phenotype and genotype of the strains isolated from the sebaceous cysts were identified,and the biological characteristics and pathogenicity of the strains were described,which provided accurate etiological evidence for clinical diagnosis. Isolated strains were Gram stained and identified with VITEK 2 compact automatic microorganism analyzer. Antimiocrobial susceptibility testing was performed by K-B method. DNA was extracted from the isolated strains. The 16S rRNA fragment was amplified by universal primers PCR and sequenced. BLAST was used to compare the homology of the sequences to the 16S rRNA gene sequence in GenBank. Results showed that the isolated strain was identified asKocuriaroseusby VITEK 2 Compact,and then identified by 16S rRNA sequencing method asCorynebacteriiumpyruviciproducens. Drug sensitive testing indicated that the isolates was sensitive to tetracycline,vancomycin,rifampin but resistant to penicillin,erythromycin,clindamycin,ciprofloxacin,levofloxacin,and compound new Ming,cefepime,imine pei south,gentamicin resistance. It is concluded that the phenotype of bacteria is not easy or inaccurate to identify; the 16S rRNA sequence is the most accurate determination method of identification. TheCorynebacteriumpyruviciproducensis a pathogenic bacterium causing the disease of the patient. At the same time,to improve the biochemical reaction information ofCorynebacteriumpyruviciproducens,the effective and feasible method of biological identification is also explored.

Corynebacteriumpyruviciproducens; biological characteristics; 16S rRNA

Tao Yuan-yong,Email: taoyuanyong@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.006

陶元勇，Email:taoyuanyong@163.com

1.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系納米醫(yī)學(xué)技術(shù)研究所，濰坊 261053; 2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,濰坊 261053

R372

A

1002-2694(2017)05-0418-05

2017-01-03 編輯：劉岱偉