楊彩虹，楊 敏，于 璐，包海洋，吳長(zhǎng)新，曹旭東，陳創(chuàng)夫

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高分辨率熔解曲線技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥性的快速檢測(cè)

楊彩虹1，楊 敏2，于 璐3，包海洋1，吳長(zhǎng)新3，曹旭東3，陳創(chuàng)夫1

目的 評(píng)價(jià)高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(high-resolution melting curve，HRM)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的應(yīng)用價(jià)值。方法 1)通過(guò)傳統(tǒng)比例法藥敏實(shí)驗(yàn)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的49株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行異煙肼耐藥性分析。2)進(jìn)一步對(duì)該結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行異煙肼耐藥相關(guān)基因KatG基因和inhA基因進(jìn)行異煙肼耐藥決定區(qū)測(cè)序分析，篩查突變位點(diǎn)。3)根據(jù)篩查到的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)高分辨率熔解曲線分析所用的特異性引物，對(duì)異煙肼耐藥基因耐藥決定區(qū)進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析檢測(cè)DNA突變，評(píng)估用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性檢測(cè)的效率。結(jié)果 1)比例法藥敏結(jié)果顯示，49株實(shí)驗(yàn)菌株中20株為異煙肼耐藥株，29株為異煙肼敏感株。 2)測(cè)序分析結(jié)果顯示：①KatG基因出現(xiàn)了4種突變形式，分別是234單位點(diǎn)突變；234、315雙位點(diǎn)突變；234、463雙位點(diǎn)突變；234、315、463三位點(diǎn)聯(lián)合突變。②inhA基因檢測(cè)到3種突變，即-8位、-15位、-152位。3) ①對(duì)耐藥株的基因突變進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：20株異煙肼耐藥株中11株存在KatG基因第315位密碼子的突變、占異煙肼耐藥株的55%；6株存在inhA基因-15(4株)位堿基、-8(1株)位堿基、-152(1株)位堿基的突變，共占異煙肼耐藥株的30%；2株同時(shí)存在基因KatG315密碼子和inhA-15位堿基的突變，占異煙肼耐藥株的10%；1株均未檢測(cè)到KatG基因和inhA基因的突變，占異煙肼耐藥株的5%。通過(guò)基因突變檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的敏感性為95%、特異性為100%。 ②用高分辨率溶解曲線檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株耐藥基因突變的結(jié)果顯示，18株存在基因突變，24株不存在基因突變，檢測(cè)的靈敏度為94.7%、特異性為80%。③以高分辨率熔解曲線檢測(cè)到突變?yōu)槟退幍呐袛鄻?biāo)準(zhǔn)，檢出19株為耐藥株，24株為敏感株。以比例法藥敏結(jié)果為參照，檢測(cè)的靈敏度為95%、特異性為82.76%。結(jié)論 高分辨率溶解曲線用于結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥性的檢測(cè)具有較好的靈敏度，耗時(shí)短，在異煙肼耐藥結(jié)核病的快速診斷方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)核分枝桿菌；高分辨率熔解曲線(HRM)；DNA測(cè)序；耐藥性；異煙肼

結(jié)核病是感染結(jié)核分枝桿菌引起的傳染病。近年來(lái)由于HIV的流行及耐藥結(jié)核分枝桿菌(MDR-TB)的出現(xiàn)等原因，使結(jié)核病成為一個(gè)嚴(yán)重威脅人類(lèi)生存的公共衛(wèi)生問(wèn)題。在抗擊結(jié)核病的醫(yī)療實(shí)踐過(guò)程中，用到利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、氧佛沙星、阿米卡星、卡那霉素等一線及二線抗結(jié)核藥物。異煙肼對(duì)結(jié)核桿菌有很強(qiáng)的抑菌和殺菌作用，該藥在消化道吸收完全，易滲入肺組織和腦脊液，對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)外各期結(jié)核病病灶中的結(jié)核桿菌均有殺滅作用。異煙肼在肝內(nèi)被乙酰化和羥化后，可隨尿排出，毒性較?。挥捎谄渥饔脧?qiáng)、療效好、用量少、價(jià)格低等原因，多年來(lái)異煙肼成為臨床抗結(jié)核的首選藥[1]。幾十年過(guò)去了，結(jié)核桿菌對(duì)異煙肼已產(chǎn)生了耐藥性，在1990年、2000年和2010年全國(guó)3次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)中顯示，異煙肼初始耐藥率分別為9.6%、11.0%、28.2%，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；異煙肼獲得性耐藥率分別為23.5%、31%、30.8%，亦呈現(xiàn)嚴(yán)重上升趨勢(shì)[2]。耐藥及耐多藥結(jié)核桿菌感染，使原來(lái)可治愈的結(jié)核病變成難以治療的致死性疾病。

目前，常用的結(jié)核桿菌藥敏檢測(cè)方法，是將菌株接種到含有抗癆藥物的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況來(lái)判斷耐藥性。該方法準(zhǔn)確性高，但耗時(shí)長(zhǎng)，一般需要1～2個(gè)月時(shí)間，不僅受培養(yǎng)條件、培養(yǎng)技術(shù)及各種人為因素的影響，而且對(duì)快速診斷結(jié)核耐藥性來(lái)說(shuō)，存在嚴(yán)重的滯后性，有些嚴(yán)重患者在藥敏結(jié)果出來(lái)前已死亡。因此，快速檢測(cè)獲得菌株的耐藥信息，及時(shí)設(shè)計(jì)制定臨床化療方案，是有效治療耐藥結(jié)核病的關(guān)鍵[3]。

回顧近年來(lái)結(jié)核桿菌異煙肼耐藥機(jī)制研究資料顯示，結(jié)核桿菌發(fā)生異煙肼耐藥與其基因組中katG、inhA、kasA、oxy-ahpC、ndh、efpA、furA、iniA等基因突變有關(guān)；其中50%～70%的結(jié)核桿菌異煙肼耐藥株katG基因有突變，25%的的結(jié)核桿菌異煙肼耐藥株與inhA基因突變有關(guān)?？傮w上，高達(dá)80%的結(jié)核桿菌異煙肼耐藥株基因突變發(fā)生在katG和inhA這兩個(gè)基因。因此，katG和inhA這兩個(gè)基因可作為臨床檢測(cè)異煙肼耐藥菌的靶點(diǎn)[4]。

本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)耐藥分析基礎(chǔ)上，對(duì)異煙肼耐藥相關(guān)基因耐藥決定區(qū)進(jìn)行DNA測(cè)序，根據(jù)測(cè)序檢測(cè)到的DNA突變，設(shè)計(jì)HRM實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KatG基因、inhA基因突變的特異性引物，對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行HRM檢測(cè)，分析HRM檢出耐藥基因突變的效率，評(píng)估以HRM檢測(cè)到DNA突變?yōu)榫昴退幍呐袛鄻?biāo)準(zhǔn)，分析用HRM對(duì)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性進(jìn)行檢測(cè)的效率。以建立一種快速檢測(cè)異煙肼耐藥性的方法，并評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值，為結(jié)核病的治療提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 結(jié)核分枝桿菌H37Rv及49株實(shí)驗(yàn)菌株均由本實(shí)驗(yàn)保存。

1.1.2 主要試劑 氨酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、檸檬酸鎂、丙三醇、天澤恩基因柱式分支桿菌DNAout 試劑盒、高分辨率熔解曲線試劑盒(羅氏公司)、谷核酸染料及2×Taq PCR Master Mix 購(gòu)與生工生物科技有限公司、引物均由上海祥音生物科技有限公司合成、DNA ladder購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 渦旋混合儀、恒溫培養(yǎng)箱、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler480，瑞士羅氏公司)。Nanodrop 2000分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 比例法藥敏實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)至出現(xiàn)可見(jiàn)菌落的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作遵循《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》進(jìn)行，異煙肼在含藥培養(yǎng)基中的濃度為0.2 μg/mL[5]。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌DNA的提取及HRM檢測(cè)模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)化 在改良的羅氏培養(yǎng)基上挑取適量生長(zhǎng)良好的結(jié)核分枝桿菌加入磨菌瓶，磨菌瓶提前加入磨菌株高壓備用，使用時(shí)再加入5～6滴生理鹽水。每株菌磨3 min，靜止5 min，然后分裝到0.5 mL的滅菌管中，再將其放入滅活儀85 ℃，1 h。滅活后的菌液按照柱式分枝桿菌DNAout試劑盒說(shuō)明書(shū)提取，獲得的DNA原液用分光光度計(jì)檢測(cè)濃度， HRM檢測(cè)所需模板將DNA原液用雙蒸水稀釋成10 ng/μL，備用。

1.2.3 異煙肼耐藥決定區(qū)(IRDR)DNA測(cè)序分析 結(jié)核桿菌異煙肼耐藥機(jī)制研究資料顯示，結(jié)核桿菌發(fā)生異煙肼耐藥與其基因組中katG、inhA、kasA、oxy-ahpC、ndh、efpA、furA、iniA等基因突變有關(guān)[6]。但總體上，高達(dá)80%的結(jié)核桿菌異煙肼耐藥株基因突變發(fā)生在katG(基因登錄號(hào)為X68081)和inhA(基因登錄號(hào)為U66801)這兩個(gè)基因，這兩個(gè)基因分別存在跟異煙肼耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)，這些位點(diǎn)主要集中在基因的某一區(qū)域，這個(gè)區(qū)域就稱為異煙肼耐藥決定區(qū)(IRDR)[7]。katG基因的異煙肼耐藥決定區(qū)有2個(gè)，分別為KatG1區(qū)和KatG2區(qū)；KatG1區(qū)從第194個(gè)密碼子到第348個(gè)密碼子之間，包含189個(gè)密碼子，片段長(zhǎng)度為569bp；KatG2區(qū)從第348個(gè)密碼子到第524個(gè)密碼子之間，包含177個(gè)密碼子，片段長(zhǎng)度為531 bp。inhA基因啟動(dòng)子區(qū)的擴(kuò)增覆蓋-8、-15位點(diǎn)，片段長(zhǎng)度為300 bp。針對(duì)katG基因和inhA基因異煙肼耐藥決定區(qū)設(shè)計(jì)的測(cè)序引物序列見(jiàn)表1所示。

表1 異煙肼耐藥決定區(qū)DNA測(cè)序用到的引物
Tab.1 Primers of DNA sequencing

基因(Gene)序列(Thesequence)退火溫度(Tm)片段長(zhǎng)度(Fragmentlength)KatG1F1:CGATGAGGTC-TATTGGGGCA58.5℃568bpR1:AGAGGTCAGT-GGCCAGCATCKatG2F2:CTGGCGCTTG-GCAATACACC59.5℃531bpR2:GGATCTCTTC-CAGGGTGCGAInhAF:ACATACCTGCT-GCGCAATTC59.7℃300bpR:CCGATCCCCCG-GTTTCCTC

對(duì)49株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行異煙肼耐藥決定區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為25 μL，包括9.7 μL dd H2O、25 μm上下游引物各0.4 μL、模板2 μL、Mix 12.5 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性40 s、59.5 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s、重復(fù)30個(gè)循環(huán)、72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序分析，DNA測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得每株菌在耐藥決定區(qū)的突變信息，將該突變信息與文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的突變位點(diǎn)進(jìn)行比較，觀察二者之間的異同并統(tǒng)計(jì)各突變位點(diǎn)在耐藥株里所占比例。

1.2.4 高分辨率熔解曲線(HRM)分析 根據(jù)結(jié)核分枝桿菌在異煙肼耐藥決定區(qū)的測(cè)序結(jié)果，針對(duì)耐藥突變發(fā)生頻率最高的部位設(shè)計(jì)HRM檢測(cè)KatG基因和inhA基因突變的特異性引物(引物序列見(jiàn)表2)，片段長(zhǎng)度約為100～400 bp。

表2 HRM檢測(cè)異煙肼耐藥性的引物
Tab.2 Primers of detecting isoniazid-resistance by HRM

GeneSequenceAnnealingtempSizeofproductKatGF:TCGTATGGCACCG-GAACC59℃123bpR:CAGCTCCCACTCG-TAGCCInhAF:CGTTACGCTCGTG-GACATAC57℃126bpR:TCCGGTAACCAG-GACTGAAC

對(duì)異煙肼耐藥決定區(qū)進(jìn)行DNA突變的HRM檢測(cè)。HRM檢測(cè)的反應(yīng)體系為10 μL，其中包括HRM Mix 5μL 、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、ddH2O 1.8 μL、MgCl2 1.8 μL、模板1 μL。

HRM檢測(cè)檢測(cè)參數(shù)如表3、表4。

表3 高峰辯率熔解曲線(HRM)分析實(shí)驗(yàn)條件設(shè)計(jì)
Tab.3 Experiment conditions of HRM

ProgramCyclesAnalysismodePre-incubate1NoneAmplification55QuantificationTm-calling1MeltingcurvesCooling1None

表4 不同反應(yīng)階段條件
Tab.4 Experiment conditions of each procedure

ProcedureTarget(℃)AcquisitionmodeHold(h:m:s)Rapmrate(℃/S)Acquisitions(per℃)Pre-incubate95None00:10:004.495None00:00:104.4amplification59None00:00:152.272Single00:00:104.495None00:01:004.4Tm-calling40None00:01:002.270None00:00:014.495Continuous0.0320Cooling40None00:00:302.2

每個(gè)樣本檢測(cè)時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣本孔。HRM擴(kuò)增完成后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

首先，①對(duì)樣本的擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，確定模板濃度是否符合要求，當(dāng)CP<30時(shí)符合；②再觀察每個(gè)樣本擴(kuò)增曲線上顯示的CP值是否一致對(duì)模板的起始量是否在同一水平進(jìn)行分析。然后，再對(duì)樣本的熔解峰進(jìn)行分析，確定設(shè)計(jì)的引物是否符合要求，觀察是否存在雜峰或者引物二聚體。最后，再對(duì)樣本是否存在基因突變進(jìn)行分析，以H37Rv為野生型參照，比較3個(gè)重復(fù)樣本孔與野生型復(fù)孔的峰形和顏色異同來(lái)判斷樣本是否存在基因突變。當(dāng)樣本的3個(gè)復(fù)孔或2個(gè)復(fù)孔的峰形和顏色相同且與野生型復(fù)孔的峰型不同時(shí)，則判斷為基因突變株；反之則為野生株。若3個(gè)重復(fù)樣本孔之間的峰形和顏色都不同，則要重復(fù)試驗(yàn)以確定。

以上分析完成后，對(duì)49株結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性HRM檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行整理分析，再評(píng)估用HRM對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行異煙肼耐藥性檢測(cè)的效率。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)所有菌株HRM檢測(cè)結(jié)果分析完成后，應(yīng)用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以DNA測(cè)序結(jié)果為參照，計(jì)算HRM檢測(cè)結(jié)果與DNA測(cè)序檢測(cè)結(jié)果之間的符合率。以傳統(tǒng)藥敏結(jié)果為參照，計(jì)算HRM檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)藥敏檢測(cè)結(jié)果之間的符合率。再用卡方檢測(cè)法分析HRM檢測(cè)菌株耐藥性與傳統(tǒng)藥敏檢測(cè)菌株耐藥性、DNA測(cè)序檢測(cè)菌株耐藥性與之間存在的差異性。用Kappa檢測(cè)來(lái)分析兩種結(jié)果的一致性。Kappa<0.4時(shí)為低度一致性；0.75≥Kappa≥0.4時(shí)為中度一致性；1≥Kappa≥0.75時(shí)為高度一致性。

2 結(jié) 果

2.1 比例法藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 比例法藥敏結(jié)果顯示49株結(jié)核分枝桿菌中20株為異煙肼耐藥株，29株為異煙肼敏感株。

2.2 異煙肼耐藥決定區(qū)(IRDR)DNA測(cè)序分析結(jié)果

2.2.1 目的基因KatG和inhA的擴(kuò)增結(jié)果 用測(cè)序引物PCR分別擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)菌株的基因組DNA，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。49株分枝桿菌及H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株全部擴(kuò)增出KatG基因568 bp和531 bp片段長(zhǎng)度，如圖1。inhA基因擴(kuò)增出300 bp片段長(zhǎng)度，如圖2所示。將可以觀察到陽(yáng)性擴(kuò)增條帶的樣本剩余部分送至生工基因公司測(cè)序。

M: 2000 mark; 1-5: strains; H37Rv: positive control; Empty: blank control.圖1 katG基因 IRDR 區(qū)域PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of isoniazid resistance-determining region

M: 500 mark; 1-5: strains; H37Rv: positive control; Empty: blank control圖2 InhA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of inhA

2.2.2 目的基因KatG和inhA的測(cè)序分析 將DNA測(cè)序結(jié)果分別與GenBank上公布的結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因KatG和inhA基因?qū)?yīng)序列進(jìn)行比較，50株分枝桿菌中異煙肼耐藥相關(guān)基因KatG存在3種突變類(lèi)型，分別為第234位密碼子GCG突變?yōu)镚GG，氨基酸由丙氨酸(Ala)突變?yōu)楦拾彼?Gly),如圖3A所示；第315位密碼子AGC的突變,如圖3B所示；第463位密碼子CGG的突變，如圖3C所示。inhA基因存在3種突變類(lèi)型，分別為inhA-8位T的突變，如圖3D所示；inhA-15位C的突變，如圖3E所示；inhA-152位G的突變,如圖3F所示。

A: KatG234 GCG→GGG,Ala→Gly; B: KatG315 AGC→ACC,Ser→Thr; C: KatG463 CGG→CTG,Arg→Leu; D: inhA T-8 C; E: inhA C-15 T; F: inhA-152 G→A 圖3 DNA序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 DNA sequence alignment results

2.2.3 各菌株在異煙肼耐藥決定區(qū)的突變位點(diǎn)分析 將每株菌的測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的KatG基因和inhA基因?qū)?yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)表5所示。

表5 不同株菌在異煙肼耐藥決定區(qū)的突變信息
Tab.5 Mutation information of different strains in isoniazid resistance-determining region

ThedrugsensitivitytestStrainsKatGmutationsInhAmutationsResistantstrains1234,463-153,4,5,6,8,25,26,28,30,33,36234,315,463/27234,315/29234,315,463-831234/32,34,35,38,39234,463-1537234,315,463-152Sensitivestrains2,7,9,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,40,41,42,43,45,46,47,48,49,50-234,463/10234,463-1544234,344,463/

2.2.4KatG基因和inhA基因各位點(diǎn)突變類(lèi)型及密碼子變化 通過(guò)對(duì)49株分枝桿菌KatG基因突變位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，20株異煙肼耐藥株中出現(xiàn)了4種突變類(lèi)型，分別為GCG 234 GGG 單位點(diǎn)突變(1株)；234、AGC 315 ACC雙位點(diǎn)突變(1株)；234、CGG 463 CTG雙位點(diǎn)突變(6株)；234、315、463三位點(diǎn)聯(lián)合突變(12株)；30株異煙肼敏感株中出現(xiàn)了3種突變類(lèi)型，分別為234、463雙位點(diǎn)突變，234、358雙位點(diǎn)突變，234、344、463三位點(diǎn)聯(lián)合突變，見(jiàn)表6所示。

表6KatG基因突變位點(diǎn)分析
Tab.6 Analysis of mutations ofKatGgene

ThedrugsensitivitytestMutationsCodonchangesAminoacidchangeNo.ofstrainsThepercentage(%)Resistantstrains234GCG→GGGAla→Gly15234GCG→GGGAla→Gly315AGC→ACCSer→Thr15234GCG→GGGAla→Gly315AGC→ACCSer→Thr1260463CGG→CTGArg→Leu234GCG→GGGAla→Gly463CGG→CTGArg→Leu630Sensitivestrain234GCG→GGGAla→Gly463CGG→CTGArg→Leu2793.1234GCG→GGGAla→Gly13.4358GGC→AGCGly→Ser234GCG→GGGAla→Gly344ACG→CCGThr→Pro13.4463CGG→CTGArg→Leu

研究結(jié)果顯示，出現(xiàn)頻率最高的突變位點(diǎn)是KatG234、KatG463，幾乎每株菌都有這兩個(gè)突變位點(diǎn)的存在，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[9]。而KatG315位點(diǎn)突變是在耐藥菌株中出現(xiàn)頻率較多的位點(diǎn)， 20株耐藥株中有13株存在KatG315位點(diǎn)的突變，占異煙肼耐藥株的65%，而敏感株中沒(méi)有該位點(diǎn)的突變，因此，KatG315的突變是異煙肼耐藥突變位點(diǎn)之一，可作為檢測(cè)菌株異煙肼耐藥的靶點(diǎn)之一，見(jiàn)圖4所示。

對(duì)49株分枝桿菌inhA基因進(jìn)行突變位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，20株異煙肼耐藥株中存在3種突變類(lèi)型，分別為-8 T→C(1株)，-15 C→T(6株) ，-152 G→A(1株)。29株異煙肼敏感株有1株存在inhA-15位C→T的突變；28株未檢測(cè)到inhA基因的突變，如表7所示。

圖4 katG各突變位點(diǎn)在敏感株及耐藥株中所占比例Fig.4 Mutations proportion of katG in sensitive strains and resistant strains

表7inhA基因突變位點(diǎn)分析
Tab.7 Analysis of mutations ofinhAgene

ThedrugsensitivitytestMutationsiteDNAbasechangeNo.ofstrainsThepercentage(%)Resistantstrains-8T→C15-15C→T630-152G→A15NoNo1260Sensitivestrains-15C→T13.4NoNo2896.6

inhA基因的DNA測(cè)序結(jié)果顯示，出現(xiàn)頻率最高的突變位點(diǎn)是inhA-15,在異煙肼耐藥株中占30%，在異煙肼敏感株中僅占5%；而inhA-8位點(diǎn)、inhA-152位點(diǎn)的突變?cè)诋悷熾履退幹曛懈髡?%，而敏感株中沒(méi)有這兩個(gè)突變位點(diǎn)的存在，因此，inhA-8、inhA-152、inhA-15的突變是異煙肼的耐藥突變位點(diǎn)，可作為檢測(cè)菌株異煙肼耐藥的靶點(diǎn)。見(jiàn)圖5所示。

圖5 inhA各突變位點(diǎn)在敏感株及耐藥株中所占比例Fig.5 Mutations proportion of inhA in sensitive strains and resistant strains

3 評(píng)估用HRM對(duì)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性進(jìn)行檢測(cè)的價(jià)值

3.1 以DNA測(cè)序檢測(cè)到突變判斷菌株耐藥性的效率 傳統(tǒng)比例法藥敏結(jié)果與基因突變結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，20株異煙肼耐藥株中11株存在KatG基因的突變，6株存在inhA基因的突變，2株同時(shí)存在KatG基因和inhA基因的突變，1株不存在KatG基因或inhA基因中任何一個(gè)基因的突變。以DNA測(cè)序檢測(cè)到KatG基因第315位密碼子發(fā)生突變或inhA基因第-8位堿基發(fā)生突變?yōu)楫悷熾履退幍呐袛鄻?biāo)準(zhǔn)。

經(jīng)卡方檢測(cè)分析，以比例法為標(biāo)準(zhǔn)，在異煙肼耐藥株中，耐藥突變的菌株占95%，耐藥未突變的菌株占5%。即用DNA測(cè)序法檢測(cè)異煙肼耐藥性的敏感性為95%，特異性為100%，異煙肼耐藥檢測(cè)的Kappa值為0.957，大于0.75，故而可認(rèn)為兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性。見(jiàn)表8所示。

表8 傳統(tǒng)耐藥與基因突變之間的關(guān)系
Tab.8 Relationship between the traditional resistance and genetic mutations

ThesequencingresultsThedrugsensitivitytestResistanceSensitiveTotalSensitivitySpecificityPositivepredictiveNegativepredictiveKappaMutation1901995%100%100%96.7%0.957No12930Total202949

3.2 用高分辨率溶解曲線(HRM)檢測(cè)菌株耐藥突變的效率

3.2.1 目的基因KatG和inhA的HRM擴(kuò)增 用針對(duì)耐藥突變發(fā)生頻率最多的KatG315位點(diǎn)、inhA基因-15位點(diǎn)設(shè)計(jì)的HRM檢測(cè)的特異性引物，對(duì)49株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行HRM擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)分別為123 bp和126 bp。獲得的擴(kuò)增曲線和熔解峰型見(jiàn)圖6、圖7所示，不存在引物二聚體的峰及其他雜峰，顯示引物特異性較好。

圖6 KatG基因HRM擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 HRM amplification results of KatG

圖7 inhA基因HRM擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 HRM amplification results of inhA

3.2.2KatG基因和inhA基因突變位點(diǎn)的HRM分析 經(jīng)HRM分析，以標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv為野生型敏感株對(duì)照，49株結(jié)核分枝桿菌KatG基因和inhA基因突變位點(diǎn)檢測(cè)獲得的HRM分析曲線見(jiàn)圖8和圖9。

經(jīng)DNA測(cè)序確定，HRM檢測(cè)區(qū)不僅存在耐藥突變位點(diǎn)，還存在跟耐藥不相關(guān)的突變位點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)以HRM檢測(cè)到KatG基因和inhA在檢測(cè)區(qū)存在基因突變?yōu)楫悷熾履退幍呐袛鄻?biāo)準(zhǔn)，來(lái)評(píng)價(jià)HRM檢測(cè)基因突變的效率。

經(jīng)卡方檢測(cè)分析，以DNA測(cè)序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，19株DNA測(cè)序結(jié)果顯示存在基因突變的菌株，HRM檢測(cè)出了18株；30株DNA測(cè)序結(jié)果顯示不存在基因突變的菌株(29株敏感株和1株未發(fā)生基因突變的耐藥株)，HRM檢測(cè)出了24株。即用HRM檢測(cè)基因突變的敏感性為94.7%，特異性為80%，兩者方法檢測(cè)基因突變的Kappa值為0.713，小于0.75，大于0.4，故而可認(rèn)為兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果具有中度一致性。見(jiàn)表9所示。

圖8 KatG315位點(diǎn)HRM分析曲線圖Fig.8 HRM analysis of KatG315 locus

圖9 inhA-15位點(diǎn)HRM分析曲線圖Fig.9 HRM analysis of inhA-15 locus

3.3 評(píng)估高分辨率溶解曲線(HRM)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的應(yīng)用價(jià)值 以HRM檢測(cè)到突變?yōu)榫昴退幍呐袛鄻?biāo)準(zhǔn)，以比例法藥敏結(jié)果為參照，HRM檢測(cè)結(jié)果顯示，檢出24株發(fā)生了基因突變，包括19株耐藥株和5株敏感株；25株未發(fā)生基因的突變，包括24株敏感株和1株耐藥株。

經(jīng)卡方檢測(cè)分析， HRM檢測(cè)的敏感性為95%，特異性為82.76%，異煙肼耐藥檢測(cè)的Kappa值為0.754，大于0.75，故而可認(rèn)為兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性。見(jiàn)表10所示。

表9 HRM檢測(cè)基因突變的效率
Tab.9 HRM detection efficiency of genetic mutations

HRMThesequencingresultsMutationNoTotalSensitivitySpecificityPositivepredictiveNegativepredictiveKappaMutation1862494.7%80%75%96%0.713No12425Total193049

表10 HRM檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的效率
Tab.10 HRM detection efficiency of isoniazid-resistance

4 討 論

我國(guó)是WHO認(rèn)定的27個(gè)耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。化學(xué)療法是控制結(jié)核病流行的主要方法，在結(jié)核病治療中發(fā)揮著重要作用，但由于不規(guī)范的治療、導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。由于人口流動(dòng)性增大及艾滋病流行等因素的影響，耐多藥及廣泛耐藥性結(jié)核病的感染人數(shù)越來(lái)越多。使結(jié)核桿菌耐藥株流行趨勢(shì)不斷上升，導(dǎo)致結(jié)核病的防控面臨巨大挑戰(zhàn)[8]，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康。異煙肼是酰肼類(lèi)化學(xué)合成藥物，其作用主要是通過(guò)抑制結(jié)核桿菌分枝菌酸的生物合成，造成細(xì)胞壁破損而起到抑菌作用。作為有效的抗菌藥物，異煙肼不僅對(duì)結(jié)核桿菌有抑制作用，對(duì)溶血性鏈球菌、肺炎球菌、沙門(mén)氏菌、流行性感冒病毒等都有抵抗作用[9]。該藥除了做為抗結(jié)核病的首選藥物外，在治療百日咳、急性痢疾、腸炎、麥粒腫、沙門(mén)氏菌感染、上呼吸道病毒感染、多發(fā)性硬化的動(dòng)作性震顫、白癜風(fēng)、甚至遺傳性舞蹈病方面都有明顯療效，從而使異煙肼的臨床使用范圍擴(kuò)大，耐藥現(xiàn)象也越來(lái)越普遍[9]。異煙肼耐藥與其基因組中katG、inhA、kasA、oxy-ahpC、ndh、efpA、furA、iniA等基因突變有關(guān)[10]；其中50%～70%的結(jié)核桿菌異煙肼耐藥株katG基因存在突變，25%的的結(jié)核桿菌異煙肼耐藥株與inhA基因突變有關(guān)。katG基因編碼的產(chǎn)物是過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶，其作用是活化異煙肼，使其發(fā)揮作用，當(dāng)KatG基因發(fā)生突變以后，會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧化氫酶活性的喪失，達(dá)不到活化異煙肼的作用，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼產(chǎn)生耐藥性。而inhA基因是烯酰基還原酶編碼基因，編碼的產(chǎn)物烯?；d體蛋白還原酶，是異煙肼的作用靶點(diǎn)，與結(jié)核分枝桿菌的耐藥性密切相關(guān)[11]?？傮w上，高達(dá)80%的結(jié)核桿菌異煙肼耐藥的耐藥相關(guān)基因突變發(fā)生在katG和inhA這兩個(gè)基因。

對(duì)于異煙肼耐藥結(jié)核病的診斷領(lǐng)域，傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基藥敏檢測(cè)法，由于耗時(shí)長(zhǎng)，費(fèi)用高，已不能滿足耐藥結(jié)核病早發(fā)現(xiàn)、早治療的迫切需求。由于結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的產(chǎn)生與異煙肼耐藥相關(guān)基因的突變存在直接的關(guān)系，因此，衍生出一些基因診斷方法。如：PCR-SSCP法、PCR-DNA測(cè)序法、PCR-基因芯片法、熒光PCR熔解曲線法等[12]。近十多年來(lái)，這些方法在結(jié)核桿菌異煙肼耐藥性檢測(cè)中起到了較好的輔助診斷作用；同時(shí)，在臨床應(yīng)用實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)了不足之處。例如，PCR-SSCP法檢測(cè)雖然耗時(shí)短，但是其操作復(fù)雜，結(jié)果判讀容易受到電泳條件、以及凝膠染色條件的影響，而不易判斷，不易在基層推廣。PCR-DNA測(cè)序法雖然結(jié)果較準(zhǔn)確，但DNA測(cè)序耗時(shí)長(zhǎng)，費(fèi)用高，不易在邊遠(yuǎn)地區(qū)推廣。PCR-基因芯片法假陽(yáng)性、假陰性影響其檢測(cè)結(jié)果，且儀器價(jià)格高，操作條件要求較高，推廣受限[13]。

本實(shí)驗(yàn)使用的方法高分辨率熔解曲線法，是在對(duì)異煙肼耐藥相關(guān)基因突變進(jìn)行DNA測(cè)序檢測(cè)的基礎(chǔ)上，針對(duì)耐藥突變發(fā)生頻率最高的部位設(shè)計(jì)高分辨率熔解曲線檢測(cè)基因突變的特異性引物，對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行HRM檢測(cè)。

分析DNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，katG基因出現(xiàn)最多的突變是234位、315位、463位，而65%的異煙肼耐藥與KatG315位點(diǎn)的突變有關(guān)。40%的異煙肼耐藥株與inhA基因的突變有關(guān)，inhA基因出現(xiàn)最多的突變?yōu)?15位。用DNA測(cè)序方法分析菌株異煙肼耐藥性，結(jié)果顯示敏感性為95%、特異性為100%。雖然該方法檢測(cè)菌株耐藥性的敏感性及特異性較好，但這種方法耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用大，尤其在邊遠(yuǎn)地區(qū)不易推廣使用。以DNA測(cè)序結(jié)果為參照，用HRM檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因突變的敏感性為94.7%、特異性為80%。分析其特異性較低的原因，主要與檢測(cè)過(guò)程中假陽(yáng)性結(jié)果的增多有關(guān)，這可能是因?yàn)闊晒馊劢馇€檢測(cè)技術(shù)本身很靈敏，假陽(yáng)性的出現(xiàn)可能與實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程存在一定的關(guān)系。以比例法藥敏結(jié)果為參照，以HRM檢測(cè)到突變?yōu)榫昴退幍呐袛鄻?biāo)準(zhǔn)，HRM檢測(cè)菌株異煙肼耐藥的敏感性為95%；特異性為82.76%。通過(guò)HRM方法獲得的結(jié)果直觀，易于判斷；耗材便宜，耗時(shí)短，在獲得結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的基礎(chǔ)上，只需2～3 d即可獲得菌株耐藥性信息，而傳統(tǒng)的比例法藥敏實(shí)驗(yàn)獲得菌株耐藥信息至少需要一個(gè)月的時(shí)間，所以在一定程度上對(duì)結(jié)核桿菌異煙肼耐藥性檢測(cè)起到較好的輔助診斷作用。但katG基因和inhA基因之外的其他基因突變導(dǎo)致的異煙肼耐藥，可能是影響HRM檢測(cè)敏感性的主要原因。另外，katG基因和inhA基因中異煙肼耐藥突變熱點(diǎn)區(qū)的同義突變，可能是影響HRM檢測(cè)特異性的主要原因。

總的來(lái)說(shuō)，高分辨率熔解曲線分析技術(shù)與傳統(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)相比，在結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性檢測(cè)中可作為較好的輔助診斷，可盡快為設(shè)計(jì)耐藥結(jié)核病的臨床治療方案提供依據(jù)。

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Rapid detection of isoniazid resistance in clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates by high-resolution melting curve analysis

YANG Cai-hong1,YANG Min2,YU Lu3,BAO Hai-yang1, WU Chang-xin3,CAO Xu-dong3,CHEN Chuang-fu1

(1.SchoolofAnimalSciencesandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China; 2.SchoolofLifeScience,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China; 3.MedicalSchool,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China)

We detected the isoniazid resistance in clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates by high-resolution melting (HRM) curve analysis and assessed the application value of the assay. The isoniazid resistance of 49M.tuberculosisisolates preserved in laboratory was analyzed by the drug sensitivity test (traditional proportion method). Further analysis was made on the sequencing of the isoniazid resistance determining region in these test strains,and their mutation sites were screened. Specific primers used in the HRM curve analysis were designed based on the screened mutation sites,DNA mutations were assayed in the isoniazid-resistant gene determining region by the HRM curve analysis,and an assessment was made of the detection efficiency of the assay in isoniazid resistance inM.tuberculosis. Results of the drug sensitivity test (proportion method) showed that,of the 49 test strains,there were 20 isoniazid-resistant strains,29 isoniazid-sensitive strains. Results of the sequencing analysis showed that: 1)KatGgene had four mutation patterns,i.e.,point mutations at site 234,at sites 234 and 315,at sites 234 and 463,and at sites 234,315 and 463; 2) there were three mutations were detected ininhAgene,i.e.,mutations in inhA-8,-15 and-152. Analysis of gene mutation in drug-resistant strains found that of the 20 isoniazid-resistant strains,11 (55%) were mutated at codon 315 ofKatGgene; 6 (30%) were mutated ininhA-15 (4/20),-8 (1/20) and-153 (1/20) ofinhAgene; two (10%) were mutated at codon 315 ofKatGgene and ininhA-15; in one strain (5%),no mutation was detected inKatGandinhAgenes. Through the gene mutation detection,the sensitivity and specificity of isoniazid resistance inM.tuberculosiswere 95% and 100%,respectively. Results of HRM curve analysis of drug-resistance gene mutations in test strains showed gene mutations were present in 18 strains and absent in 24 ones; referring to DNA sequencing results,the sensitivity and specificity of the assay were 94.7% and 80%,respectively. Judged by mutations as drug-resistance via the HRM curve analysis,19 resistant and 24 sensitive strains were tested. With the drug sensitivity test results by the proportion method as controls,the sensitivity and specificity of the assay were 95% and 82.76%,respectively. Use of the HRM curve in the detection of resistance ofM.tuberculosisto isoniazid is characterized by good sensitivity and short time consuming,and has certain value in the rapid diagnosis of isoniazid-resistant tuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; high-resolution melting (HRM) curve; DNA sequencing; drug resistance; isoniazid

Chen Chuang-fu,Email: ccf-xb@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.004

“十二五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(No.2013ZX10003003-002),國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31060333)

陳創(chuàng)夫，Email:ccf-xb@163.com；

1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003； 2.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832003; 3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子 832002

S855.2

A

1002-2694(2017)05-0403-10

2016-07-25 編輯：劉岱偉

Supported by the National Science and Technology Major Project of the 12th Five-Year Plan: "Prevention and Control of Severe Infectious Diseases Like AIDS and Viral Hepatitis" (No. 2013ZX10003003-002) and the National Natural Science Foundation of China (No. 31060333)