李金春，李家鵬，周 彤，喬曉玲，許隨根，戚 彪，米瑞芳，曲 超，許 典

引物3’端不同堿基錯(cuò)配情況下實(shí)時(shí)熒光定量PCR非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律

李金春，李家鵬*，周 彤，喬曉玲*，許隨根，戚 彪，米瑞芳，曲 超，許 典

（中國(guó)肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

以錯(cuò)配反應(yīng)與正常反應(yīng)之間的ΔCt值為指示，研究不同堿基錯(cuò)配類型、位置與個(gè)數(shù)條件下引物3′端與模板之間非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律，并構(gòu)建ΔCt值的二次多項(xiàng)式回歸模型。結(jié)果表明，堿基錯(cuò)配種類、位置、個(gè)數(shù)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）的非特異性擴(kuò)增都有顯著影響，并呈現(xiàn)出較強(qiáng)的規(guī)律性。堿基類型上，研究的各個(gè)位置上異型錯(cuò)配較易發(fā)生非特異性擴(kuò)增，而同型錯(cuò)配則較難發(fā)生，并且兩種錯(cuò)配類型之間有顯著性差異（P＜0.05）；錯(cuò)配位置上，相同條件下引物3’端第1位堿基錯(cuò)配對(duì)ΔCt值影響最大，錯(cuò)配位置遠(yuǎn)離3’端時(shí)對(duì)ΔCt值的影響逐漸減小，非特異性擴(kuò)增也更容易發(fā)生；錯(cuò)配個(gè)數(shù)上，隨著錯(cuò)配堿基個(gè)數(shù)的增加對(duì)ΔCt值得影響程度不斷增大，非特異性擴(kuò)增較難發(fā)生。構(gòu)建ΔCt值預(yù)測(cè)模型R2達(dá)到0.837 1，根據(jù)此模型可以預(yù)測(cè)出不同位置、不同錯(cuò)配類型條件下ΔCt值，從而可以判斷RT-qPCR非特異性擴(kuò)增的發(fā)生的難易程度。

肉類摻假；循環(huán)閾值；堿基錯(cuò)配；非特異性擴(kuò)增；引物特異性

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、高效便捷等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品真?zhèn)闻c摻假鑒別[1-4]、食品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)[5-6]、食品致病菌檢測(cè)[7-9]等多個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目中，已成為肉類品種鑒別的主流方法[10-11]，在食品安全監(jiān)管中發(fā)揮著重要作用。引物特異性是RT-qPCR方法體系中關(guān)鍵性能指標(biāo)之一，特別是對(duì)用于食品真?zhèn)螜z測(cè)的RT-qPCR方法來(lái)說(shuō)更是核心指標(biāo)[12-13]。設(shè)計(jì)和選取的引物體系對(duì)擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列需要具有唯一性[14]，即在具有多種相近序列的復(fù)雜DNA模板中，引物體系只擴(kuò)增出目標(biāo)模板，而不擴(kuò)增其他的相似序列DNA模板。但當(dāng)存在相似DNA序列的復(fù)雜樣本時(shí)，引物和模板之間容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)檢測(cè)結(jié)果判定帶來(lái)干擾[15]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)引物與模板之間非特異性擴(kuò)增的研究相對(duì)較少。Wu等[16]將引物中每個(gè)堿基分別替換成其余3 種堿基后得到一系列新引物，新引物再與模板進(jìn)行非特異性擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)堿基錯(cuò)配位置對(duì)PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率有較大影響，并提出一種評(píng)價(jià)引物擴(kuò)增能力的方法；Brett等[17]研究了引物中間位置和靠近引物5’端的單個(gè)或多個(gè)堿基與模板發(fā)生非特異性擴(kuò)增對(duì)RT-qPCR擴(kuò)增準(zhǔn)確性的影響，發(fā)現(xiàn)中間位置和引物5’端的堿基錯(cuò)配也能較大程度的降低RT-qPCR定量準(zhǔn)確性。Sü?等[18]發(fā)現(xiàn)在RT-qPCR引物和探針中的單堿基錯(cuò)配都能夠引起較大的定量誤差，誤差甚至高到63.12%。Klungthong等[10]發(fā)現(xiàn)引物3’端單一堿基錯(cuò)配便可較大程度的降低方法靈敏度。目前，尚缺少系統(tǒng)考察3個(gè)因素：堿基錯(cuò)配類型、位置、個(gè)數(shù)對(duì)RT-qPCR非特異性擴(kuò)增發(fā)生規(guī)律影響的報(bào)道，而現(xiàn)有報(bào)道也多集中于對(duì)其中某一因素的研究，以及堿基錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增效率、定量準(zhǔn)確性和方法靈敏度等方面的研究，因此研究影響非特異性擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵因素及其作用規(guī)律就顯得尤為迫切。

為探究引物和模板之間非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律，篩選本實(shí)驗(yàn)室屬性相近、序列各異的引物作為研究基礎(chǔ)。由于引物3’端核苷酸序列對(duì)RT-qPCR特異性擴(kuò)增起到至關(guān)重要的作用，因此選取引物3’端核苷酸序列作為研究對(duì)象，在正常引物的基礎(chǔ)上人為設(shè)計(jì)一系列錯(cuò)配引物，研究引物中錯(cuò)配堿基種類、個(gè)數(shù)、位置對(duì)RT-qPCR非特異性擴(kuò)增發(fā)生規(guī)律的影響，并通過(guò)錯(cuò)配反應(yīng)與正常反應(yīng)之間的Ct值之差（ΔCt值）的預(yù)測(cè)模型來(lái)判斷非特異性擴(kuò)增的發(fā)生的難易程度。研究錯(cuò)配引物與目標(biāo)物種模板之間RT-qPCR非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律，對(duì)于建立引物評(píng)價(jià)體系和設(shè)計(jì)技術(shù)都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬四號(hào)肉 北京資源公司；牛肉 北京御香苑畜牧有限公司；Qiagen69504血液、組織DNA提取試劑盒德國(guó)Qiagen公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；D2000 DNA Marker 天根生化科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國(guó)Axygen公司；TaKaRa 2×酶體系預(yù)混液 大連寶生物工程（大連）有限公司；SYBR GreenⅠMaster 德國(guó)Roche公司；RT-qPCR 96 孔板羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。實(shí)驗(yàn)中涉及引物均由實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)，并由英濰捷 基（上海）有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Prep多樣品勻漿儀 美國(guó)Omni公司；BT224S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；LightCycler 480熒光PCR儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；PCR儀、Biorad GelDoc XR凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；S-100渦旋振蕩器 大洋科學(xué)工業(yè)株式會(huì)社；Eppendorf 5417型離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司；Synergy H4全功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；DYCP-31F瓊脂糖水平電泳儀 北京六一儀器廠；GI54DW全自動(dòng)高壓滅菌器 美國(guó)致微（廈門(mén)）儀器有限公司；Cascada BIO超純水系統(tǒng) 美國(guó)Pall公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取方法

將肉和水按照1∶4（m/m）的比例進(jìn)行準(zhǔn)確稱量并進(jìn)行勻漿，13 500 r/min勻漿10 min。吸取100 μL勻漿液于1.5 mL離心管中，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取基因組DNA，總DNA溶解于100 μL TE緩沖液中，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定280 nm和260 nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算DNA純度和質(zhì)量濃度。然后用TE緩沖液稀釋至5 ng/μL，作為普通PCR反應(yīng)模板。

1.3.2 RT-qPCR模板制備方法

模板通過(guò)普通PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，然后用凝膠試劑盒回收得到。普通PCR反應(yīng)為25 μL體系，其中TaKaRa 2×酶體系預(yù)混液12.5 μL；濃度為5 μmol/L的上、下游引物各1.5 μL，引物序列如表1所示；質(zhì)量濃度為5 ng/μL全基因組模板溶液2.0 μL；滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至25 μL。普通PCR循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

表 1 正常反應(yīng)中的引物序列Table 1 Pr imers used for normal RT-qPCR

擴(kuò)增結(jié)束后按照凝膠回收試劑盒操作流程對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，然后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定回收得到的目的片段質(zhì)量濃度，用TE緩沖液稀釋至2×10－3ng/μL，作為RT-qPCR的模板。

1.3.3 錯(cuò)配反應(yīng)引物設(shè)計(jì)與合成

表 2 單堿基錯(cuò)配實(shí)驗(yàn)方案Table 2 Experimental program of single base-pair mismatches in RT-qPCR

圖 1 RT-qPCR反應(yīng)過(guò)程中的非特異性擴(kuò)增Fig. 1 Schematic diagram of base pair mismatch in RT-qPCR

以引物CMRC-2-1F為例描述PCR反應(yīng)非特異性擴(kuò)增過(guò)程，具體如圖1所示。篩選本實(shí)驗(yàn)室屬性相近、序列各異的引物作為基礎(chǔ)（表1），按照表2和表3方案合成系列錯(cuò)配引物。其中表2是單堿基錯(cuò)配方案，涵蓋了3 個(gè)位置不同堿基配對(duì)的所有36 種情況。表3列出了2 個(gè)和3 個(gè)堿基典型錯(cuò)配方案，包含典型錯(cuò)配類型。

表 3 雙堿基、三堿基錯(cuò)配實(shí)驗(yàn)方案Table 3 Experimental program of double base-pair and triple basepair mismatches in RT-qPCR

1.3.4 RT-qPCR反應(yīng)體系

用1.3.3節(jié)中合成的引物與其對(duì)照引物，及對(duì)應(yīng)模板組成RT-qPCR反應(yīng)擴(kuò)增體系，分別記錄錯(cuò)配引物及其正常引物的Ct值，并計(jì)算其Ct值之差，作為衡量非特異性擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生難易程度的衡量標(biāo)準(zhǔn)。ΔCt值越大代表非特異性擴(kuò)增越難發(fā)生，反之則容易發(fā)生。

RT-qPCR擴(kuò)增體系為10 μL體系，其中Roche 2×酶體系預(yù)混液5 μL；濃度為5 μmol/L的上、下游引物各0.6 μL；質(zhì)量濃度為2×10－3ng/μL模板溶液2.0 μL；滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至10 μL。RT-qPCR循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，退火和延伸合并為一步，溫度為60 ℃，時(shí)間為45 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。

1.3.5 ΔCt值預(yù)測(cè)模型構(gòu)建

由單堿基錯(cuò)配結(jié)果可將堿基錯(cuò)配對(duì)ΔCt值得影響程度由小到大分為5 個(gè)等級(jí)，然后給所有單堿基、雙堿基和三堿基錯(cuò)配情況（共計(jì)56 種情況）的不同位置按照錯(cuò)配等級(jí)賦予分值，而不同的錯(cuò)配情況又對(duì)應(yīng)不同的ΔCt值，則可以得到引物3’端3 個(gè)位置與ΔCt值之間的數(shù)量對(duì)應(yīng)關(guān)系。然后通過(guò)二次多項(xiàng)式逐步回歸的方法便可得到ΔCt值與引物3’端3 個(gè)位置上不同錯(cuò)配類型之間的數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型，模型公式見(jiàn)式（1）[20]：

式中：x、y、z分別表示引物3’端第3位、第2位、第1位；pi（i=1,2,310）為多項(xiàng)式回歸系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用DPS 7.05軟件（中國(guó)，唐啟義）對(duì)ΔCt預(yù)測(cè)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和模型的構(gòu)建；用PASWStatistics 18.0軟件（美國(guó)SPSS公司）進(jìn)行位置以及個(gè)數(shù)對(duì)ΔCt影響的顯著性分析；t檢驗(yàn)和R2以及數(shù)據(jù)處理通過(guò)Microsoft Excel 2007軟件（美國(guó)微軟公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基錯(cuò)配類型對(duì)非特異性擴(kuò)增的影響

結(jié)果顯示，堿基錯(cuò)配種類對(duì)非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)的難易程度有顯著影響?；旧?，引物與模板對(duì)應(yīng)位置上出現(xiàn)同類型堿基錯(cuò)配（嘌呤/嘌呤，或嘧啶/嘧啶）會(huì)對(duì)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生明顯的抑制作用，而異型堿基錯(cuò)配（嘌呤/嘧啶，或嘧啶/嘌呤）對(duì)抑制非特性擴(kuò)增的作用不大。由表4可知，當(dāng)將引物M-1-T1 3’端第1位T被替換成A（A/A）和G時(shí)（G/A），ΔCt分別達(dá)到了17.70和14.12，而替換成C時(shí)，ΔCt僅為3.63，前者發(fā)生非特異性擴(kuò)增的概率不足后者的千分之一。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，3’端第1位同型錯(cuò)配和異型錯(cuò)配之間對(duì)ΔCt值影響有極顯著差異（P＜0.01），無(wú)論是第2位還是第3位兩種錯(cuò)配類型之間對(duì)ΔCt值的影響有顯著差異（P＜0.05），且該影響程度差距逐步縮小。這可能與4種核苷酸的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，同類核苷酸之間的錯(cuò)配DNA合成酶的容錯(cuò)率更低一些。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了異型錯(cuò)配發(fā)生的難易程度明顯低于同型錯(cuò)配，而異型錯(cuò)配之所以容易發(fā)生，可能是由于核苷酸的5-甲基胞嘧啶脫氨基反應(yīng)相對(duì)比較容易發(fā)生導(dǎo)致的[21-22]，這與生物遺傳中突變類型多為轉(zhuǎn)換結(jié)果一致[23]。另外由表4可知，錯(cuò)配反應(yīng)中有堿基A參與的，一般ΔCt值都會(huì)偏大，說(shuō)明堿基種類A對(duì)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生明顯的抑制作用。

表 4 單堿基錯(cuò)配RT-qPCR反應(yīng)中ΔCt值Table 4 Δ Ct values of single base-pair mismatches in RT-qPCR

2.2 堿基錯(cuò)配位置對(duì)非特異性擴(kuò)增的影響

表 5 雙堿基、三堿基錯(cuò)配RT-qPCR中ΔCt值Table 5 ΔCt values of double and triple base-pair mismatches in RT-qPCR

堿基錯(cuò)配位置對(duì)非特異性擴(kuò)增發(fā)生的難易程度有顯著影響，且越是遠(yuǎn)離3’端錯(cuò)配位置對(duì)ΔCt值的影響呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)。由表4可知，單堿基錯(cuò)配反應(yīng)自3’端起3 個(gè)位置ΔCt的平均值依次為8.04、3.22、1.06，最大值依次為17.70、8.99、4.82，均呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)。這說(shuō)明越是遠(yuǎn)離3′端錯(cuò)配位置對(duì)ΔCt值的影響呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)，此時(shí)RT-qPCR非特異性擴(kuò)增越是容易發(fā)生，這與Ayyadevara等[24]研究的結(jié)果相一致。而由t檢驗(yàn)可知，錯(cuò)配類型為異型錯(cuò)配時(shí)，3’端第1位和第2位之間對(duì)ΔCt值影響不顯著（P=0.11），但兩者與第3位相比均具有顯著性差異（P＜0.05）；當(dāng)為同型錯(cuò)配時(shí)，3’端3 個(gè)位置間對(duì)ΔCt值影響具有極顯著的差異（P＜0.01），說(shuō)明堿基錯(cuò)配位置對(duì)非特異性擴(kuò)增發(fā)生的難易程度有顯著影響。而由表5可知，雙堿基錯(cuò)配中第1、2位堿基錯(cuò)配最大ΔCt值為22.48，第1、3位的為20.36，而第2、3位的為18.85，同樣說(shuō)明堿基錯(cuò)配位置越靠近3’端對(duì)ΔCt值的影響越大，非特異性擴(kuò)增越難以發(fā)生，這與單堿基錯(cuò)配結(jié)果相一致。而由t檢驗(yàn)結(jié)果可知，三者之間并無(wú)顯著差異，說(shuō)明當(dāng)堿基錯(cuò)配個(gè)數(shù)增加后錯(cuò)配位置對(duì)Δ Ct值影響減弱。

2.3 堿基錯(cuò)配個(gè)數(shù)的影響

由表4、5可知，堿基錯(cuò)配個(gè)數(shù)對(duì)ΔCt值得影響同樣明顯。引物3’端3 個(gè)堿基發(fā)生的錯(cuò)配反應(yīng)中，單堿基、雙堿基以及三堿基錯(cuò)配ΔCt值的平均值依次為4.10、13.66、17.15，ΔCt值的最大值依次為17.70、22.48、22.94，兩者均呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，說(shuō)明隨著錯(cuò)配堿基個(gè)數(shù)的不斷增加，對(duì)ΔCt值的影響程度不斷增大，對(duì)非特異性擴(kuò)增的抑制也不斷增強(qiáng)。而由t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，錯(cuò)配類型為異型錯(cuò)配時(shí)，單個(gè)、雙個(gè)以及3 個(gè)堿基錯(cuò)配時(shí)對(duì)ΔCt值的影響存在極顯著差異（P＜0.01）；而當(dāng)錯(cuò)配類型為同型錯(cuò)配時(shí)，單堿基錯(cuò)配分別與雙堿基錯(cuò)配和三堿基錯(cuò)配之間存在顯著性差異（P＜0.05），但雙堿基錯(cuò)配與三堿基錯(cuò)配之間對(duì)ΔCt值的影響并無(wú)顯著差異（P=0.16），說(shuō)明錯(cuò)配堿基個(gè)數(shù)增加到一定程度后對(duì)ΔCt值的影響程度便會(huì)減弱。

2.4 因素交互作用研究與Δ Ct值預(yù)測(cè)模型構(gòu)建

為研究因素之間的交互作用和數(shù)量相關(guān)關(guān)系，用三元二次多項(xiàng)式對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行回歸分析。由單堿基錯(cuò)配結(jié)果可知，同型錯(cuò)配的ΔCt值明顯高于異型錯(cuò)配的，并且相同錯(cuò)配類型條件下含有堿基A的ΔCt值也相對(duì)偏大，據(jù)此將堿基錯(cuò)配對(duì)ΔCt值得影響程度由小到大分為5 個(gè)等級(jí)，分別為“未發(fā)生錯(cuò)配”、“異型錯(cuò)配”、“異型錯(cuò)配（含堿基A）”、“同型錯(cuò)配”以及“同型錯(cuò)配（含堿基A）”。并且給每個(gè)等級(jí)依次賦值“0、1、2、3、4”。將所有單堿基、雙堿基和三堿基錯(cuò)配情況（共計(jì)56種情況）的不同位置按照錯(cuò)配等級(jí)進(jìn)行賦分，而不同的錯(cuò)配情況又對(duì)應(yīng)不同的ΔCt值，則可以得到引物3’端3 個(gè)位置與Δ Ct值之間的數(shù)量對(duì)應(yīng)關(guān)系，如表6所示。

通過(guò)二次多項(xiàng)式逐步回歸的方法對(duì)表6中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到3 個(gè)位置上不同錯(cuò)配類型與ΔCt的預(yù)測(cè)模型，模型公式見(jiàn)式（2）：

ΔCt=－8.49+5.41x+8.32y+8.62z－0.52x2－1.26y2－0.76z2－0.21xy－0.40xz－0.62yz （2）

通過(guò)公式（2）可知，引物3’端3 個(gè)位置上不同錯(cuò)配類型對(duì)ΔCt值都有較大的影響，而從公式中二次項(xiàng)xy、yz以及xz可知，3 個(gè)位置中的任意兩個(gè)之間都存在明顯的交互作用。對(duì)表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的方差結(jié)果如表7所示，模型F值為25.70，P＜0.000 1，模型是極顯著的，模型 擬合成功。回歸模型R2達(dá)到0.837 1，根據(jù)此模型在一定程度上可以預(yù)測(cè)出不同位置、不同錯(cuò)配類型條件下ΔCt值。

表 6 ΔCt值與3’端3 個(gè)位置上不同錯(cuò)配類型之間的數(shù)量關(guān)系Table 6 Relationship between ΔCt value and mismatch types

表 7 Δ Ct值回歸模型方差分析結(jié)果Table 7 Analysis of variance for regression model for ΔCt

將文獻(xiàn)[25]報(bào)道的單堿基錯(cuò)配ΔCt值與通過(guò)模型得到的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較驗(yàn)證，結(jié)果如表8所示，可以看出模型殘差值的絕對(duì)值均小于1，上下浮動(dòng)于零左右，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)的ΔCt值是可信的。因此，應(yīng)用二次多項(xiàng)式回歸模型能夠預(yù)測(cè)出引物3’端不同位置、不同錯(cuò)配類型條件下Δ Ct值，從而可以判斷RT-qPCR非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律。

表 8 ΔCt值回歸模型的殘差值Table 8 Residuals of regression model for ΔCt

3 討 論

肉類摻假售假事件近年來(lái)頻頻發(fā)生，2013年更是爆發(fā)了歐洲“馬肉風(fēng)波”事件[26-27]，引起了全球關(guān)注，基于RT-qPCR的動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)也隨之成為研究熱點(diǎn)[28-30]。由于物種之間DNA序列相近，極易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，因此該檢測(cè)技術(shù)對(duì)引物特異性要求較高，為引物設(shè)計(jì)和篩選帶來(lái)了較大難度，并且引物設(shè)計(jì)完成后通常需要做特異性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，該評(píng)價(jià)不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且需要收集盡可能多的物種肌肉或血液等生物樣本，極大增加了方法開(kāi)發(fā)成本。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)引物3’端一個(gè)或者多個(gè)堿基與模板發(fā)生錯(cuò)配反應(yīng)引起Ct值變化來(lái)評(píng)價(jià)RT-qPCR中非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律，發(fā)現(xiàn)引物上某些堿基發(fā)生錯(cuò)配對(duì)ΔCt值影響較小，甚至毫無(wú)影響，說(shuō)明引物堿基發(fā)生置換后仍能與模板發(fā)生非特異性擴(kuò)增，間接說(shuō)明用于設(shè)計(jì)引物的該段模板特異性較差。引物3’端不同種類、位置、個(gè)數(shù)堿基錯(cuò)配對(duì)RT-qPCR非特異性擴(kuò)增發(fā)生規(guī)律的影響截然不同，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了3’端3 個(gè)位置上不同堿基錯(cuò)配類型與ΔCt之間預(yù)測(cè)模型，根據(jù)此模型在一定程度上可以預(yù)測(cè)出不同位置、不同錯(cuò)配類型條件下ΔCt值，提出了一種評(píng)價(jià)RT-qPCR非特異性擴(kuò)增發(fā)生難以程度的方法，從而可以描述非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律。設(shè)計(jì)引物時(shí)，掌握引物3’端堿基錯(cuò)配對(duì)RT-qPCR非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律，避免選擇DNA序列中易于發(fā)生非特異性擴(kuò)增的堿基位置、堿基種類，確保用于設(shè)計(jì)引物的特異序列具有真實(shí)的特異性，對(duì)于提高特異性引物設(shè)計(jì)效率，降低基于RT-qPCR的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)成本具有重要的實(shí)用性價(jià)值。

除引物3’端核苷酸序列外，DNA聚合酶保真性、探針序列、試劑體系、擴(kuò)增條件等因素都會(huì)對(duì)非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生有影響，因此將會(huì)進(jìn)行持續(xù)系統(tǒng)的研究，建立完整的評(píng)價(jià)體系，為該領(lǐng)域的引物設(shè)計(jì)提供參考。根據(jù)堿基錯(cuò)配反應(yīng)ΔCt值評(píng)價(jià)RT-qPCR非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律，可用于指導(dǎo)特異性引物的設(shè)計(jì)，為肉制品真?zhèn)舞b別方法的建立提供技術(shù)支持，有利于維護(hù)肉制品安全，保障消費(fèi)者、肉制品加工企業(yè)的合法權(quán)益。

[1] UMMI K H, MOHD N M, AMIN I, et al. A higher sensitivity and ef ciency of common primer multiplex PCR assay in identi cation of meat origin using NADH dehydrogenase subunit 4 gene[J]. Journal of Food Science and Technology, 2015, 2(7): 4166-4175. DOI:10.1007/ s13197.014.1459.7.

[2] MD E A, MD A R, SHARIFAH B A H. Multiplex PCR in species authentication: probability and prospects: a review[J]. Food Analytical Method, 2014, 7: 1933-1949. DOI:10.1007/s12161.014.9844.4.

[3] SóNIA S, JOANA S A, ISABEL M, et al. Quantitative detection of poultry meat adulteration with pork by a duplex PCR assay[J]. Meat Science, 2010, 85: 531-536. DOI:10.1016/j.meatsci.2010.03.001.

[4] 周彤, 李家鵬, 田寒友, 等. 一種基于實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的肉及肉制品中豬源性成分含量測(cè)定[J]. 肉類研究, 2013, 27(12): 11-15. [5] 魏霜, 陳貞, 蘆春斌, 等. 多重PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻的轉(zhuǎn)基因成分[J].食品科學(xué), 2012, 33(12): 159-162.

[6] 王小花, 李建祥, 王國(guó)卿, 等. SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大豆轉(zhuǎn)基因成分[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(8): 171-175.

[7] RODRíGUEZ A, GORDILLO R, ANDRADE M J, et al. Development of an ef cient real-time PCR assay to quantify enterotoxin-producing staphylococci in meat products[J]. Food Control, 2016, 60: 302-308. DOI:10.1016/j.foodcont.2015.07.040.

[8] FERNáNDEZ I C, GUARDDON M, B?HME K, et al. Detection and quantification of spoilage and pathogenic Bacillus cereus, Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis by real-time PCR[J]. Food Microbiology, 2011, 28: 605-610. DOI:10.1016/j.fm.2010.10.014.

[9] ALMEIDA C, CERQUEIRA C, AZEVEDO N F, et al. Detection of Salmonella enterica serovar Enteritidis using real time PCR, immunocapture assay, PNA FISH and standard culture methods in different types of food samples[J]. International Journal of Food Microbiology, 2013, 161: 16-22. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2012.11.014.

[10] 吳亞君, 王斌, 劉鳴暢, 等. 阿膠中馬和驢成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(8): 85-88. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201408016.

[11] 陳穎, 吳亞君. 基因檢測(cè)技術(shù)在食品物種鑒定中的應(yīng)用[J]. 色譜, 2011, 29(7): 594-600. DOI:10.3724/SP.J.1123.2011.00594.

[12] MARIA T B, ALESSANDRA D.Animal species identification in food products: evolution of biomolecular methods[J]. The Veterinary Journal, 2011, 190: 34-38. DOI:10.1016/j.tvjl.2010.09.024.

[13] 李家鵬, 喬曉玲, 田寒友, 等. 食品和飼料中動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(9): 340-347.

[14] MUHAMMAD S, YASMEEN J. A multiplex-conventional PCR assay for bovine, ovine, caprine andsh species identi cation in feedstuffs: highly sensitive and specific[J]. Food Control, 2015, 50: 190-194. DOI:10.1016/j.foodcont.2014.08.048.

[15] 申志勇. PCR引物特異性評(píng)估體系及多重PCR引物設(shè)計(jì)系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用[D]. 北京: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2009: 4-6.

[16] WU J H, HONG P Y, LIU W T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension[J]. Journal of Microbiological Methods, 2009, 77: 267-275.

[17] BRETT M L, SUSAN K D L. The effect of multiple primer-template mismatches on quantitative PCR accuracy and development of a multiprimer set assay for accurate quantification of pcrA gene sequence variants[J]. Journal of Microbiological Methods, 2013, 94: 224-231.

[18] Sü? B, FLEKNA G, WAGNER M, et al. Studying the effect of single mismatches in primer and probe binding regions on ampli cation curves and quanti cation in real-time PCR[J]. Journal of Microbiological Methods, 2009, 76: 316-319. DOI:10.1016/ j.mimet.2008.12.003.

[19] KLUNGTHONG C, CHINNAWIROTPISAN P, HUSSEM K, et al. The impact of primer and probe-template mismatches on the sensitivity of pandemic in uenza A/H1N1/2009 virus detection by real-time RTPCR[J]. Journal of Clinical Virology, 2010, 48: 91-95. DOI:10.1016/ j.jcv.2010.03.012.

[20] SUTHERLAND J P, BAYLISS A J, BRAXTON D S, et al. Predictive modelling of Escherichia coli O157:H7: inclusion of carbon dioxide as a fourth factor in a pre-existing model[J]. International Journal of Food Microbiology, 1997, 37: 113-120.

[21] CHRISTY M W, ROBERT E, BENJAMIN D C. Kinetic characterization of primer mismatches in allele-specific PCR: a quantitative assessment[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2002, 299: 715-722.

[22] TORAHIKO T, NOBUYUKI K, MAKOTO H,et al. Base transitions and base transversions seen in mutations among various types of the hepatitis C viral genome[J]. Federation of European Biochemical Societies, 1993, 315(2): 201-203.

[23] 趙輝, 李啟寨, 李俊, 等. 相鄰堿基組分與產(chǎn)生SNP的轉(zhuǎn)換或顛換在植物基因組中的研究[J]. 中國(guó)科學(xué): C輯, 2006, 36(1): 1-8.

[24] AYYADEVARA S, THADEN J J, REIS R J. Discrimination of primer 39-nucleotide mismatch by Taq DNA polymerase during polymerase chain reaction[J]. Analytical Biochemistry, 2000, 284: 11-18. DOI:10.1006/abio.2000.4635.

[25] STADHOUDERS R, PAS S D, ANBER J, et al. The effect of primertemplate mismatches on the detection and quantification of nucleic acids using the 5’nuclease assay[J]. Journal of Molecular Diagnostics, 2010, 12(1): 109-117. DOI:10.2353/jmoldx.2010.090035.

[26] IWOBI A, SEBAH D, KRAEMER I, et al. A multiplex real-time PCR method for the quantification of beef and pork fractions in minced meat[J]. Food Chemistry, 2015, 169: 305-313. DOI:10.1016/ j.foodchem.2014.07.139.

[27] SENTANDREU M A, SENTANDREU E. Authenticity of meat products: tools against fraud[J]. Food Research International, 2014, 60: 19-29. DOI:10.1016/j.foodres.2014.03.030.

[28] SOARES S, AMARAL J S, OLIVEIRA M B P P, et al. A SYBR green real-time PCR assay to detect and quantify pork meat in processed poultry meat products[J]. Meat Science, 2013, 94: 115-120. DOI:10.1016/j.meatsci.2012.12.012.

[29] DRUMMOND M G, BRASIL B S A F, DALSECCOA L S, et al. A versatile real-time PCR method to quantify bovine contamination in buffalo products[J]. Food Control, 2013, 29: 131-137. DOI:10.1016/ j.foodcont.2012.05.051.

[30] BALLIN N Z. Authentication of meat and meat products[J]. Meat Science, 2010, 86: 577-587. DOI:10.1016/j.meatsci.2010.06.001.

Pattern of Occurrence of Nonspecific Amplification in Real-Time Fluorescent PCR with Different Base Pair Mismatches at the Primer 3’ End

LI Jinchun, LI Jiapeng*, ZHOU Tong, QIAO Xiaoling*, XU Suigen, QI Biao, MI Ruifang, QU Chao, XU Dian
(Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology, China Meat Research Center, Beijing 100068, China)

Primer specificity is one of the key figures of merit for the identification of meat adulteration by polymerase chain reaction (PCR). In this study, the pattern of occurrence of non-specific amplification in real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was evaluated in terms of the Δ Ct value between base pair matches and mismatches. Three independent variables including the type, position and number of base pair mismatches were investigated for building a quadratic polynomia l to predict the Δ Ct value. Results showed that the type, location, and number of base pair mismatches had a significant impact on non-specific RT-qPCR amplification in a very regular pattern. As far as different types of base pair mismatches were concerned, nonspecific amplification between purine and pyrimidine, but not between different purines or between different pyrimidines, occurred easily, with a significant difference being observed between two types of base pair mismatches. For base position, the first base of the 3’ end of the primer had the greatest impact on the Δ Ct value; the mismatch position gradually far away from the 3’ end had a decreased effect on the Ct value, making nonspecific amplification occur more easily. The greater the number of base pair mismatches was, the more significant the influence on the Δ Ct value was, leading to reduced occurrence of nonspecific amplification. The prediction model for Δ Ct was fitted using a stepwise method with correlation coefficient of more than 0.80, which could provide a useful and accurate method to predict the ΔCt value within certain limits.

meat adulteration; cycle threshold value; base pair mismatch; nonspecific amplification; primer specificity

10.7506/spkx1002-6630-201710045

TS207.3

A

1002-6630（2017）10-0277-07

2016-11-01

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271877）；“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFD0401203）

李金春（1987—），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：lijinchun1987@163.com

*通信作者：李家鵬（1979—），男，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：ljp7915@126.com

喬曉玲（1964—），女，教授級(jí)高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)和加工技術(shù)。E-mail：cmrcsen@126.com

李金春, 李家鵬, 周彤, 等. 引物3’端不同堿基錯(cuò)配情況下實(shí)時(shí)熒光定量PCR非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 277-283. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710045. http://www.spkx.net.cn

LI Jinchun, LI Jiapeng, ZHOU Tong, et al. Pattern of occurrence of nonspecific amplification in real-time fluorescent PCR with different base pair mismatches at the primer 3’ end[J]. Food Science, 2017, 38(10): 277-283. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710045. http://www.spkx.net.c n