劉 丹，韓小敏，李鳳琴，王 暢，羅曉林，盧大新,*

（1.北京農(nóng)學院食品科學與工程學院，北京 102206；2.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206；3.國家食品安全風險評估中心，衛(wèi)生部食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021；4.中山大學公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州 510080）

花生油和玉米油中多組分真菌毒素高效
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法的建立

劉 丹1,2，韓小敏3，李鳳琴3，王 暢4，羅曉林4，盧大新1,2,*

（1.北京農(nóng)學院食品科學與工程學院，北京 102206；2.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206；3.國家食品安全風險評估中心，衛(wèi)生部食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021；4.中山大學公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州 510080）

摘 要：建立花生油和玉米油中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、單端孢霉烯族化合物等13 種真菌毒素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)乙腈-水提取、MultiSep 226多功能凈化柱凈化后，分別用電噴霧正離子模式和負離子模式檢測。經(jīng)優(yōu)化，正離子模式流動相為含2 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸-甲醇溶液，負離子模式流動相為0.1%氨水-乙腈溶液。該方法對花生油和玉米油中13 種真菌毒素的檢出限為0.05～3.00 μg/kg，定量限為0.10～10.00 μg/kg，平均加標回收率為66.6%～114.9%。所建方法操作簡單、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于花生油和玉米油中多組分真菌毒素的協(xié)同測定。
關(guān)鍵詞：真菌毒素；花生油；玉米油；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

Abstract: A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous detection of 13 mycotoxins including aflatoxins, zearalenone, and trichothecenes in peanut and corn oils. Samples were extracted with acetonitrile-water, followed by clean-up with a MultiSep 226 multifunctional column. The positive electrospray ionization mode (ESI+) and negative electrospray ionization mode (ESI-) were respectively employed to acquire signals. The mobile phase for ESI+was composed of 0.1% formic acid containing 2 mmol/L ammonium formate (solvent A) and methanol (solvent B), while that for ESI-consisted of 0.1% ammonia water (solvent A) and acetonitrile (solvent B). The limits of detections (LODs) for 13 mycotoxins in peanut and corn oils ranged from 0.05 to 3.00 μg/kg and the limits of quantification (LOQ) ranged from 0.10 to 10.00 μg/kg. The mean recoveries ranged from 66.6% to 114.9%. The method developed in the present study had the advantages of simple operation, high sensitivity and good reproducibility, and so it could be used for the detection of multi-mycotoxins in peanut and corn oils.
Key words: mycotoxin; peanut oil; corn oil; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

真菌毒素是由某些真菌在特定條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，人畜攝入后可導(dǎo)致中毒[1-3]。目前國際上普遍關(guān)注的真菌毒素包括黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、單端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等。其中單端孢霉烯族化合物中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）及其衍生物和T-2毒素等尤為引人關(guān)注[4-6]。大豆油、菜籽油、花生油和玉米油等是我國消費量最大的植物油。據(jù)報道，花生油和玉米油由于其原料在田間、收獲和貯存過程中極易受到真菌及其毒素的污染，而后期的壓榨、堿煉和脫臭等加工工藝雖可除去部分毒素但不完全，導(dǎo)致目前我國食用植物油中真菌毒素污染現(xiàn)象普遍[7-8]。雖然GB 2761—2011《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定了花生油、玉米油等植物油中AFB1的限量標準[9]，但食用植物油中AFB1污染依然嚴重[10-11]，且目前尚無食用玉米油中ZEN的限量標準。劉展華等[12]于2014年對廣西城鄉(xiāng)183 份食用植物油AFB1的污染調(diào)查發(fā)現(xiàn)，AFB1的總體超標率為25.14%。吳振興等[13]的研究結(jié)果顯示，玉米油中ZEN的含量高達1 160.1 μg/kg。鑒于我國大部分食用油主產(chǎn)區(qū)氣候條件適于各種真菌的生長繁殖和產(chǎn)毒，導(dǎo)致我國食用植物油不可避免地會受到多種真菌毒素的協(xié)同污染，而目前已有的檢測植物油中AF、ZEN和單端孢霉烯族化合物的方法存在耗時費力、成本較高、僅檢測某一類毒素、不能對多種真菌毒素協(xié)同檢測的缺點，亟待建立植物油中多組分真菌毒素協(xié)同檢測的方法。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]因具有靈敏度高、特異性強、定性及定量同時進行、可實現(xiàn)多種毒素同時檢測、并可篩查未知毒素等優(yōu)點，是目前檢測食品中多組分真菌毒素的優(yōu)選方法[15-17]。本研究在優(yōu)化樣品前處理條件的基礎(chǔ)上，建立適于花生油和玉米油中13 種真菌毒素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生油、玉米油樣品 市購。

AF標準溶液（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2質(zhì)量濃度分別為1.00、0.30、0.98、0.31 μg/mL） 美國Supelco公司；3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-acetyledeoxynivalenol，3-ADON，100.7 μg/mL）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀茵烯醇（15-acetyle-deoxynivalenol，15-ADON，101.1 μg/mL）、雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，NIV，104.4 μg/mL）、T-2毒素（100.5 μg/mL）、HT-2毒素（100.4 μg/mL）、鐮刀菌烯酮-X（fusarenon X，F(xiàn)X，100.3 μg/mL）、二乙酰藨草鐮刀菌烯醇（diacetoxyscirpenol，DAS，100.8 μg/mL），DON、 ZEN、伏馬菌素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）和FB2固體標準品 奧地利Romer Labs公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Fisher公司；甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨、氨水（均為色譜純） 美國Sigma公司；冰醋酸（分析純） 北京化學試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MultiSep 226多功能凈化柱 奧地利Romer Labs公司；0.22 μm聚丙烯濾膜 美國Waters公司；0.22 μm尼龍濾膜天津津騰實驗設(shè)備有限公司；Prominence LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；Triple QuadTM3500儀美國AB Sciex公司；BK-3600A超聲波清洗器 無錫超聲電子設(shè)備廠；MS3基本型渦旋混合器 德國IKA公司；Millipore-Elix-QE-QG純水儀 美國Millipore公司；N-EVAPTM112氮吹儀 美國Organomation公司；HY-3多功能振蕩器 江蘇金壇醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 真菌毒素標準溶液的配制

真菌毒素混合標準儲備液：取一定量真菌毒素標準溶液于棕色小瓶中，用乙腈稀釋后，制備成混合標準儲備溶液，使各毒素的質(zhì)量濃度分別為AFB1、AFG11 μg/mL，AFB2、AFG20.3 μg/mL，3-ADON、15-ADON、NIV、DAS、FB1、FB2、T-2、FX 10 μg/mL，ZEN 5 μg/mL，HT-2、DON 30 μg/mL，－18 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

使用前將混合標準儲備液用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液或空白植物油提取液逐級稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的毒素標準工作液和基質(zhì)匹配毒素標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

參考于釧釧等[18]建立的方法并進行適當改進。稱取10 g（精確到0.01 g）植物油樣品，加入40 mL乙腈-水（84∶16，V/V）溶液，150 r/min振蕩提取30 min，靜置10 min，待分層后，取上清液經(jīng)定性濾紙過濾，取8 mL濾液，加入40 μL冰醋酸（相當于添加0.5%冰醋酸），混勻后過MycoSep 226凈化柱，棄掉先流出的2 mL凈化液，取隨后的4 mL凈化液，于40 ℃水浴中氮吹至近干，加入少許乙腈-水（50∶50，V/V）溶液超聲5 min、渦旋1 min溶解并定容至1 mL，最后經(jīng)0.22 μm聚丙烯濾膜過濾后備用。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子模式（electrospray positive ionization mode，ESI+）和電噴霧負離子模式（electrospray negative ionization mode，ESI－）的離子化電壓分別為5 500 V和－4 500 V。ESI+與ESI－的氣簾氣壓力、離子源溫度、噴霧氣壓力、輔助加熱氣壓力、碰撞氣壓力、駐留時間等參數(shù)均相同，分別為35 psi、550 ℃、55 psi、50 psi、6 psi、20 ms。采用電噴霧多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進行信號采集，經(jīng)過優(yōu)化后各真菌毒素檢測的主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 檢測15 種真菌毒素的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for detection of 15 mycotoxins

本研究對15 種真菌毒素進行檢測條件的優(yōu)化，包括FB1和FB2。但在樣品前處理過程中發(fā)現(xiàn)MycoSep 226多功能凈化柱可以吸附樣品中的FB1和FB2而無法測定伏馬菌素，因此本方法適用于除FB1和FB2外的13 種真菌毒素的測定。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱：Wa t e r s A C Q U I T Y B E H C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；樣品室溫度4 ℃；進樣體積5 μL；流速0.3 mL/min。ESI+條件下的流動相A為含2 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸溶液，流動相B為甲醇；ESI－條件下的流動相A為0.1%氨水溶液，流動相B為乙腈。

ESI+洗脫程序：0～0.5 min，55% A；0.5～6 min，55%～20% A；6～8 min，20%～5% A；8～11 min，5% A；11～11.1 min，5%～55% A；11.1～14 min，55% A。

ESI－洗脫程序：0～0.5 min，95% A；0.5～5 min，95%～35% A；5～6 min，35%～5% A；6～7 min，5% A；7～7.5 min，5%～95% A；7.5～11.5 min，95% A。

ESI+條件下，分別考察0.1%甲酸溶液、0.1%乙酸溶液、2 mmol/L乙酸銨溶液、2 mmol/L甲酸銨溶液、含2 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸溶液作為流動相A和甲醇或乙腈作為流動相B；ESI－條件下，分別考察0.1%氨水溶液、0.1%甲酸溶液和水作為流動相A和甲醇或乙腈作為流動相B，對待測13 種真菌毒素的保留時間和質(zhì)譜信號響應(yīng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

考慮到各真菌毒素在ESI+和ESI－條件下的響應(yīng)值，本研究將15 種真菌毒素分為兩組分別進行檢測，結(jié)果顯示，ESI+條件下AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、FB1、FB2的母離子峰均以[M+H]+最優(yōu)，T-2、HT-2和DAS的母離子峰分別以[M+Na]+和[M+NH4]+最優(yōu)。ESI－條件下DON、3-ADON、15-ADON、NIV、FX、ZEN均以[MH]－最優(yōu)，其中NIV、DON、3-ADON子離子峰為環(huán)氧基團斷裂峰，其m/z分別為281、265、306.9。經(jīng)過優(yōu)化，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、T-2、HT-2、DAS、FB1和FB2共9 種真菌毒素采用ESI+模式進行檢測，而DON、3-ADON、15-ADON、NIV、FX和ZEN共6 種真菌毒素采用ESI－模式進行分析，具體見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)2.1節(jié)質(zhì)譜條件優(yōu)化的結(jié)果，將15 種毒素分成兩組分別進行ESI+和ESI－條件的優(yōu)化。ESI+條件下，分別考察甲醇、乙腈作為流動相B和0.1%甲酸溶液、0.1%乙酸溶液、2 mmol/L乙酸銨溶液、2 mmol/L甲酸銨溶液、含2 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸溶液作為流動相A對待測真菌毒素色譜峰的影響。結(jié)果顯示，甲醇作為流動相B時，9 種真菌毒素的信號響應(yīng)強度是乙腈作為流動相時的2 倍多，且各毒素色譜峰的峰形更對稱，噪音更低（圖1a、b）。用0.1%甲酸溶液、0.1%乙酸溶液、2 mmol/L乙酸銨溶液和2 mmol/L甲酸銨溶液作為流動相A時發(fā)現(xiàn)，0.1%甲酸溶液比0.1%乙酸溶液更易促進真菌毒素的電離并使4 種黃曲霉毒素出現(xiàn)更窄的色譜峰（圖1a、c）；用2 mmol/L甲酸銨溶液作為流動相A時，各真菌毒素的色譜峰信號強度明顯提高，且是2 mmol/L乙酸銨溶液的2 倍多（圖1d、e），且隨著甲酸銨濃度的增高（1、2 mmol/L和5 mmol/L），9 種毒素色譜峰信號強度逐漸增強，考慮到甲酸銨濃度過高會影響色譜柱壽命[18]，因此后續(xù)實驗中甲酸銨的濃度選擇2 mmol/L。鑒于采用甲酸銨溶液作為流動相時不能使FB1和FB2有效分離[19-20]，因此選擇在2 mmol/L甲酸銨溶液中添加0.1%甲酸溶液，發(fā)現(xiàn)該條件下9 種毒素既可得到較高的離子化，又可使2 種伏馬菌素出峰（圖1f），因此，本研究選擇含2 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸-甲醇溶液作為ESI+的流動相。

ESI－條件下，分別考察了甲醇、乙腈作為流動相B和0.1%氨水溶液、0.1%甲酸溶液和水作為流動相A對5 種B類單端孢霉烯族化合物和ZEN的保留時間和質(zhì)譜信號響應(yīng)差異的影響。結(jié)果表明，乙腈作為流動相B時可明顯縮短各毒素的保留時間、提高各毒素的色譜峰響應(yīng)值（圖2a、b）。與水和0.1%甲酸溶液相比，0.1%氨水溶液作為流動相A時可顯著提高6 種毒素的離子化效率，并改善色譜峰的峰形（圖2a、c、d）。因此選擇0.1%氨水-乙腈溶液作為ESI－的流動相，該條件下各毒素信號響應(yīng)值較高且以ZEN響應(yīng)強度為最高，峰形較好，3-ADON和15-ADON單純通過液相色譜方式無法完全分離，但可經(jīng)質(zhì)譜選擇不同的子離子予以區(qū)分。2.3 提取物殘渣定容溶劑及濾膜的優(yōu)化

圖 1 ESI＋條件下9 種真菌毒素在不同流動相中的總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatograms (TIC) of 9 mycotoxins using different mobile phases under the ESI+mode

圖 2 ESI－條件下6 種真菌毒素在不同流動相中的總離子流圖Fig. 2 TICs of 6 mycotoxins using different mobile phases under the ESI-mode

分別選用乙腈-水（V/V）溶液30∶70、50∶50作為定容溶劑進行測定發(fā)現(xiàn)，乙腈-水（50∶50，V/V）溶液作為定容溶劑時ZEN的響應(yīng)強度較高，但DON的峰形略寬，如圖3所示，其他真菌毒素的響應(yīng)值和峰形無明顯差別。考慮真菌毒素極性的差異，為使13 種真菌毒素有較高溶解度和較好的分離，本研究采用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液作為定容溶劑。實驗同時對比了樣品提取液上機前用尼龍濾膜與聚丙烯濾膜過濾對色譜峰峰形、毒素吸附差異和雜質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 種濾膜過濾均未出現(xiàn)對真菌毒素明顯的吸附效應(yīng)，考慮到尼龍濾膜可帶入雜質(zhì)并出現(xiàn)雜質(zhì)峰，且雜質(zhì)峰與ZEN的色譜峰保留時間相近會影響到ZEN的檢測，因此，本研究選擇聚丙烯濾膜進行實驗。

圖 3 ESI－條件下真菌毒素在不同定容溶劑的總離子流圖Fig. 3 TICs of mycotoxins in different solvents under the ESI-mode

2.4 樣品前處理條件的優(yōu)化

本研究考察了在樣品提取液中添加體積分數(shù)為0.5%或1%冰醋酸溶液對毒素提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花生油中添加0.5%或1%冰醋酸溶液均可顯著提高ZEN、3-ADON、FX與NIV的回收率，且差異均具有統(tǒng)計學意義；但對其他真菌毒素的平均回收率無顯著性差異。與不添加冰醋酸相比，玉米油中添加0.5%或1%冰醋酸溶液均可顯著提高AFB1、AFG1、AFB2、15-ADON、3-ADON、HT-2、FX和ZEN的平均回收率，差異均具有統(tǒng)計學意義，而對其他真菌毒素的平均回收率無顯著性差異，如表2所示。綜上所述，添加0.5%或1%冰醋酸溶液雖然均可提高部分毒素的加標回收率，但考慮到添加過多冰醋酸會影響毒素的穩(wěn)定性[21]，因此后續(xù)實驗選擇在樣品前處理過程中添加0.5%冰醋酸溶液。

表 2 冰醋酸對13 種真菌毒素平均加標回收率的影響（n=6）Table 2 Effects of glacial acetic acid on mean recoveries of 13 mycotoxins (n = 6)

注：*.差異顯著（P＜0.05）；**.差異極顯著（P＜0.01）。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果

表 3 不同文獻中內(nèi)標校正法和基質(zhì)匹配校正法的比較Table 3 Comparison between internal calibration method and matrixmatched calibration method reported in different references

基質(zhì)效應(yīng)是由目標化合物在離子化過程中引起的信號增強或抑制[22-24]，主要與色譜峰信號強度和噪音高低相關(guān)，凈化過程并不能徹底消除，且同一種基質(zhì)的不同樣品間基質(zhì)效應(yīng)也有不同[25]。本研究將毒素的混合標準儲備液用空白樣品經(jīng)1.3.2節(jié)處理所得提取液和乙腈-水（50∶50，V/V）溶液分別稀釋，制得一定質(zhì)量濃度的2 種標準工作液，二者對應(yīng)毒素的峰面積比值乘以100來計算基質(zhì)效應(yīng)[21]?；ㄉ秃陀衩子途胁煌潭鹊幕|(zhì)效應(yīng)，二者對不同毒素的基質(zhì)效應(yīng)范圍分別為60.00%～103.85%和50.00%～95.45%。目前降低基質(zhì)效應(yīng)的方法主要有樣品稀釋法、內(nèi)標校正法、基質(zhì)匹配校正法等[22,26]。其中，內(nèi)標校正法和基質(zhì)匹配校正法應(yīng)用較廣。由表3可知，文獻[22,27]對玉米研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)匹配校正法所得回收率低于內(nèi)標校正法，表明其定量準確度相對較低?？紤]到多組分分析中，內(nèi)標校正法需找到每種目標待測物所對應(yīng)的內(nèi)標物，操作較復(fù)雜，且成本較高[28]。而基質(zhì)匹配校正法成本低廉，適合批量檢測[29]。對此，有些研究將二者結(jié)合，當基質(zhì)匹配校正法無法滿足分析需要時，采用內(nèi)標校正法定量[17,30]。而本研究采用基質(zhì)匹配校正法所得回收率已達到定量要求[31]，因此，本實驗采用基質(zhì)匹配校正曲線對樣品中的毒素水平進行定量。

表 4 花生油和玉米油中13 種毒素的相關(guān)技術(shù)指標Table 4 Figures of merit of the developed method for detection of 13 mycotoxins in peanut and corn oils

2.6 方法驗證結(jié)果

2.6.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果

從表4可知，花生油和玉米油中AF、A類單端孢霉烯族化合物（HT-2、T-2和DAS）、B類單端孢霉烯族化合物（DON、3-ADON、15-ADON、NIV、FX）的線性范圍均為0.1～100、0.5～1 500、1～1 500 μg/kg，ZEN的線性范圍分別為0.5～500 μg/kg和0.25～500 μg/kg?；ㄉ椭蠥F、A類單端孢霉烯族化合物、B類單端孢霉烯族化合物和ZEN的檢出限（limit of determination，LOD，RSN≥3）和定量限（limit of quantification，LOQ，RSN≥10）范圍分別為0.05～0.10 μg/kg和0.10～0.50 μg/kg、0.10～0.30 μg/kg和0.30～0.75 μg/kg、0.50～3.00 μg/kg和1.00～9.00 μg/kg、0.25 μg/kg和0.50 μg/kg；玉米油中AF、A類單端孢霉烯族化合物、B類單端孢霉烯族化合物和ZEN的LOD和LOQ范圍分別為0.05～0.15 μg/kg和

0.10 ～0.50 μg/kg、0.10～0.30 μg/kg和0.30～0.75 μg/kg、0.50～3.00 μg/kg和1.00～10.00 μg/kg、0.05 μg/kg和0.25 μg/kg。且13 種真菌毒素的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好，可滿足花生油和玉米油中真菌毒素定量檢測的要求。

2.6.2 方法的加標回收率結(jié)果

表 5 花生油和玉米油中13 種毒素的加標回收率和RSD（n=6）Table 5 Recoveries and relative standard deviations of 13 mycotoxins in peanut and corn oils (n=6)

取真菌毒素陰性的花生油及玉米油樣品，分別添加4 個質(zhì)量濃度的13 種真菌毒素混合標準溶液，每個加標水平進行6 次重復(fù)實驗，按1.3.2節(jié)進行樣品的前處理，如表5所示?；ㄉ秃陀衩子椭?3 種真菌毒素的平均加標回收率范圍分別為71.0%～101.6%和66.6%～114.9%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.2%～14.2%和1.5%～17.9%，符合歐盟Commission Regulation （EC） No. 401-2006對食品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、T-2、HT-2、DON、ZEN等真菌毒素的回收率及RSD定量測定的要求[28]。

2.6.3 方法的精密度結(jié)果

表 6 13 種真菌毒素的日內(nèi)和日間精密度Table 6 Intra- and inter-day precision for 13 mycotoxins

本實驗采用添加低、中和高3 個梯度真菌毒素的花生油和玉米油樣品，按照1.3.2節(jié)的實驗流程提取凈化，進行日內(nèi)、日間實驗，同一天不同時間點測定5 次，連續(xù)測定5 d。從表6可知，花生油的日內(nèi)和日間RSD范圍分別為0.3%～11.5%和0.1%～13.6%，玉米油的日內(nèi)和日間RSD范圍分別為2.0%～12.3%和2.0%～12.5%，表明所建方法具有良好的精密度。

3 結(jié) 論

本研究建立了花生油和玉米油中AF、單端孢霉烯族化合物和ZEN共13 種真菌毒素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，優(yōu)化出液相色譜條件、質(zhì)譜條件、樣品前處理方法、提取物溶解定容溶劑等條件。ESI+和ESI－條件下的流動相分別為含2 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸-甲醇溶液和0.1%氨水-乙腈溶液；前處理過程中添加0.5%冰醋酸可顯著提高ZEN和3-ADON等毒素的回收率；乙腈-水（50∶50，V/V）溶液作為定容溶劑可使13 種真菌毒素得到較高的響應(yīng)值；花生油和玉米油均有不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，為保證檢測結(jié)果的準確性，本實驗均采用基質(zhì)匹配校正曲線進行定量。研究表明，所建方法檢出限低、回收率高、穩(wěn)定性好、靈敏度高、準確可靠，可滿足花生油和玉米油中真菌毒素的測定。

利用本方法對實際樣品進行檢測，ESI+和ESI－條件下的真菌毒素均可在9 min內(nèi)出峰，可滿足批量樣品檢測要求。此外，所建方法具有較低的檢出限和定量限，可滿足我國[9]及歐盟[32]對花生油和玉米油中黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮等毒素的限量要求。綜上所述，本方法可用于花生油和玉米油中13 種真菌毒素的測定，從而為食品安全監(jiān)管提供一定的技術(shù)支持。

[1] 鄭翠梅. 高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法同時測定糧食中13種真菌毒素[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學, 2012.

[2] 宮小明, 任一平, 董靜, 等. 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定花生、糧油中18 種真菌毒素[J]. 分析測試學報, 2011, 30(1): 6-12. DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2011.01.002.

[3] LATTANZIO V M T, SOLFRIZZO M, POWERS S, et al. Simultaneous determination of aflatoxins, ochratoxin A and fusarium toxins in maize by liquid chromatography/tandem mass spectrometry after multitoxin immunoaffinity cleanup[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2007, 21: 3253-3261. DOI:10.1002/rcm.3210. [4] BENNETT J W, KLICH M. Mycotoxins[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2003, 16(3): 497-516. DOI:10.1128/CMR.16.3.497-516.2003.

[5] RAHMANI A, JINAP S, SOLEIMANY E. Qualitative and quantitative analysis of mycotoxins[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2009, 8(3): 202-251. DOI:10.1111/ j.1541-4337.2009.00079.x.

[6] BERTHILLER F, SCHUHMACHER R, BUTTINGER G, et al. Rapid simultaneous determination of major type A- and B-trichothecenes as well as zearalenone in maize by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1062: 209-216. DOI:10.1016/ j.chroma.2004.11.011.

[7] 王月華, 孫冬梅, 溫江濤, 等. 玉米油生產(chǎn)過程中對玉米赤霉烯酮及嘔吐毒素的影響[J]. 糧食與食品工業(yè), 2015, 22(4): 19-22. DOI:10.3969/j.issn.1672-5026.2015.04.004.

[8] 馬治良, 徐同城, 劉麗娜, 等. 食用油及油料作物中真菌毒素研究進展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2014(2): 45-48. DOI:10.3969/jissn.1671-9646(X).2014.02.045.

[9] 衛(wèi)生部. 食品中真菌毒素限量: GB 2761—2011[S]. 北京: 中國標準出版社, 2011: 1-2.

[10] 劉曉莉, 曹悅, 陳世瓊, 等. 2011-2012年食用植物油中黃曲霉毒素B1的調(diào)查[J]. 中國食品工業(yè), 2012(12): 68-69. DOI:10.3969/ j.issn.1006-6195.2012.12.045.

[11] 葉盛群, 諶剛, 韓秀山. 食用油吸附脫色劑對植物油中黃曲霉毒素含量的影響[J]. 精細與專用化學品, 2013, 21(7): 20-22. DOI:10.3969/j.issn.1008-1100.2013.07.006.

[12] 劉展華, 唐振柱, 鐘延旭, 等. 2014年廣西城鄉(xiāng)食用植物油黃曲霉毒素B1污染水平調(diào)查[J]. 應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學, 2015, 21(6): 377-380. DOI:10.3969/j.issn.1673-758X.2015.06.004.

[13] 吳振興, 鮑蕾, 呂寧, 等. 植物油中多種真菌毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法建立及污染調(diào)查分析[J]. 分析測試學報, 2012, 31(12): 106-110.

[14] OFITSEROVA M, NERKAR S, PICKERING M, et al. Multiresidue mycotoxin analysis in corn grain by column high-perfermance liquid chromatography with postcolumn photochemical and chemical derivatization: single-laboratory validation[J]. Journal of AOAC International, 2009, 92(1): 15-25.

[15] 辛媛媛, 張艷, 王松雪, 等. UPLC-MS/MS法測定玉米中13 種真菌毒素[J]. 中國糧油學報, 2015, 30(12): 126-130. DOI:10.3969/ j.issn.1003-0174.2015.12.023.

[16] TANG Y Y, LIN H Y, CHEN Y C, et al. Development of a quantitative multi-mycotoxin method in rice, maize, wheat and peanut using UPLC-MS/MS[J]. Food Analytical Methods, 2013, 6: 727-736. DOI:10.1007/s12161-012-9473-8.

[17] REN Y P, ZHANG Y, SHAO S L, et al. Simultaneous determination of multi-component mycotoxin contaminants in foods and feeds by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1143: 48-64. DOI:10.1016/ j.chroma.2006.12.064.

[18] 于釧釧, 邵兵, 李鳳琴, 等. 糧食中隱蔽型脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等多組分真菌毒素協(xié)同檢測技術(shù)[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學雜志, 2010, 44(8): 736-740. DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2010.08.013.

[19] BERTHILLER F, SULYOK M, KRSKA R, et a1. Chromatographic methods for the simultaneous determination of mycotoxins and their conjugates in cereals[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 119(12): 33-37. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.07.022.

[20] BELTRAN E, IBANEZ M, SANCHO J V, et al. Determination of mycotoxins in different food commodities by ultra-high-pressure liquid chromatography coupled to triple quadruple mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2009, 23: 1801-1809. DOI:10.1002/rcm.4077.

[21] 韓錚. 中藥材中常見真菌毒素分析方法學及代謝動力學研究[D].杭州: 浙江大學, 2011: 28-29.

[22] ELISABETH V, THOMAS G, ROBERT K. Stable isotope dilution assay for the accurate determination of mycotoxins in maize by UHPLC-MS/MS[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402: 2675-2686. DOI:10.1007/s00216-012-5757-5.

[23] HUANG L C, ZHENG N, ZHENG B Q, et al. Simultaneous determination of aflatoxin M1, ochratoxin A, zearalenone and α-zearalenol in milk by UHPLC-MS/MS[J]. Food Chemistry, 2014, 146: 242-249. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.09.047.

[24] NATHANAIL A V, SYV?HUOKO J, MALACHOVá A, et al. Simultaneous determination of major type A and B trichothecenes, zearalenone and certain modi ed metabolites in Finnish cereal grains with a novel liquid chromatography-tandem mass spectrometric method[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015, 407(16): 4745-4755. DOI:10.1007/s00216-015-8676-4.

[25] SULYOK M, KRSKA R, SCHUHMACHER R. Application of a liquid chromatography-tandem mass spectrometric method in multimycotoxin determination in raw cereals and evaluation of matrix effects[J]. Food Additives and Contaminants, 2007, 24: 1184-1195. DOI:10.1080/02652030701510004.

[26] GOSETTI F, MAZZUCCO E, ZAMPIERI D, et al. Signal suppression/ enhancement in high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217: 3929-3937. DOI:10.1016/j.chroma.2009.11.060.

[27] 王秀嬪, 李培武, 楊揚, 等. 液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定糧油中的黃曲霉毒素[J]. 色譜, 2011, 29(6): 517-522. DOI:10.3724/ SP.J.1123.2011.00517.

[28] 胡貝貞. 糧谷中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2006: 15-54.

[29] WANG Y H, XU D M, CHEN C H, et al. Beware of pseudo matrix-matched standard calibration curve due to matrix effect on sulfonamide residue in honey[J]. Advanced Materials Research, 2013, 781/782/783/784: 120-126. DOI:10.4028/www.scienti c.net/AMR.781-784.120.

[30] de BOEVRE M, di MAVUNGU J D, MAENE P, et al. Development and validation of an LC-MS/MS method for the simultaneous determination of deoxynivalenol, zearalenone, T-2-toxin and some masked metabolites in different cereals and cereal-derived food[J]. Food Additives and Contaminants. Part A: Chemistry, Analysis, Control, Exposure and Risk Assessment, 2012, 29(5): 819-835. DOI:10.1080/19440049.2012.656707.

[31] Commission Regulation(EC) No. 401/2006 of 23 February 2006. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs[S].

[32] Commission Regulation (EC) No. 1881/2006 of 19 December 2006. Setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs[S].

Development of High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Detection of Multi-Mycotoxins in Peanut Oil and Corn Oil

LIU Dan1,2, HAN Xiaomin3, LI Fengqin3, WANG Chang4, LUO Xiaolin4, LU Daxin1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China; 2. Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control for Spoilage Organisms and Pesticides, Beijing 102206, China; 3. Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment, Ministry of Health, China National Centre for Food Safety Risk Assessment, Beijing 100021, China; 4. School of Public Health, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, China)

10.7506/spkx1002-6630-201710048

TS207.3

A

1002-6630（2017）10-0297-08

劉丹, 韓小敏, 李鳳琴, 等. 花生油和玉米油中多組分真菌毒素高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法的建立[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 297-304. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710048. http://www.spkx.net.cn

LIU Dan, HAN Xiaomin, LI Fengqin, et al. Development of high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for detection of multi-mycotoxins in peanut oil and corn oil[J]. Food Science, 2017, 38(10): 297-304. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710048. http://www.spkx.net.cn

2016-08-03

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301489）；北京市自然科學基金項目（7163235）

劉丹（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品中有害物質(zhì)殘留檢測。E-mail：liudaidainame@foxmail.com*

盧大新（1961—），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工工程。E-mail：dx.lu@126.com