陳國忠，郭秋翠，譚其秀，武碩軍，劉煉強，馮志彬

（魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025）

1 株產(chǎn)煙酸羥基化酶海洋細菌H9的分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

陳國忠，郭秋翠，譚其秀，武碩軍，劉煉強，馮志彬*

（魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025）

利用96 孔板和紫外顯影相結(jié)合的定向快速篩選方法，從煙臺渤海灣采集的腐敗魚尸上分離篩選得到1 株高產(chǎn)煙酸羥基化酶的菌株H9，通過形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），對其產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為：可溶性淀粉15 g/L、玉米漿15 g/L、煙酸10 g/L、K2HPO41.0 g/L、初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度25 ℃、接種量7%、500 mL三角瓶裝液量50 mL。優(yōu)化后煙酸羥基化酶活力達到0.37 U/mL，比優(yōu)化前提高了68%，采用靜息細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)6-羥基煙酸產(chǎn)率達到124.77 g/L，具有工業(yè)化生產(chǎn)6-羥基煙酸的應(yīng)用前景。

煙酸；6-羥基煙酸；惡臭假單胞菌；煙酸羥基化酶；培養(yǎng)條件優(yōu)化

6-羥基煙酸（6-hydroxynicotinic acid，6-HNA）是一種合成農(nóng)藥、醫(yī)藥和其他化學(xué)藥品的重要中間體[1-3]，它可以用于生產(chǎn)以吡蟲啉為代表的吡啶甲胺類農(nóng)藥[4-6]，也可以和氯反應(yīng)生成5,6-二氯煙酸，后者可作為一種減肥藥。國內(nèi)6-HNA的生產(chǎn)多采用化學(xué)法[7]，存在副產(chǎn)物多、產(chǎn)量低、成本高、污染重等缺陷，從國外進口則價格昂貴，無法滿足國內(nèi)需求。早在1955年研究者發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）可將煙酸氧化為6-HNA[8]，隨后催化該反應(yīng)的煙酸羥基化酶獲得純化[9]隨著生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，通過微生物酶催化轉(zhuǎn)化煙酸生產(chǎn)6-HNA的方法成為研究熱點[10-15]，該法工藝簡單、副產(chǎn)物少、環(huán)境友好。Kulla等[16]篩選到2 株木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans DSM2402 & DSM2783）能夠轉(zhuǎn)化煙酸成為6-HNA，為此瑞士的Lonza公司申請了專利，目前已經(jīng)開始進行6-HNA的生產(chǎn)。Nagasawa等[17]報道的熒光假單胞菌TN5菌株（Pseudomonasuorescens TN5）、Hurh等[18]報道的黏質(zhì)沙雷氏菌株（Serratia marcescens IFO12648）均具有轉(zhuǎn)化生產(chǎn)6-HNA的活性。陸宏偉等[19-20]報道了1 株惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida NA-1），羅暉等[21-22]篩選得到2 株假單胞菌（Pseudomonas sp. BK-1 & BKC4），楊瑤等[23]報道了1 株睪酮叢毛單胞菌JA1（Comamonas testosterone JA1），均表現(xiàn)出較高的活性。國內(nèi)對微生物法生產(chǎn)6-HNA的研究起步較晚，與國外的研究水平相比尚有較大差距，距離工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用仍然需要時間，因此煙酸羥基化酶高產(chǎn)菌株的篩選及其培養(yǎng)條件研究對實現(xiàn)6-HNA的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)具有重要意義。

煙酸羥基化酶產(chǎn)生菌的篩選往往需要廣泛采樣、大量篩選，具有較大的隨機性和盲目性，工作量大，篩選效率低，有必要提高目標菌株的篩選效率，建立快速、準確、便捷的篩選方法。通過調(diào)研，筆者發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)煙酸羥基化酶的菌多為假單胞菌屬菌種，而假單胞菌多見于腐敗魚尸上，故而產(chǎn)生了從腐敗魚尸采樣篩選菌種的思路。本研究借鑒并改進了楊瑤等[24]的微孔板高通量篩選方法以及羅暉等[22]的紫外顯影法，進一步提高篩選效率，從渤海灣腐敗魚尸上分離篩選煙酸羥基化酶產(chǎn)生菌，對分離得到的1 株高產(chǎn)煙酸羥基化酶的菌株進行了分類鑒定和產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

腐敗魚尸采自煙臺渤海灣沙灘。

1.1.2 試劑

煙酸、6-HNA 百靈威科技有限公司；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他所用試劑均為分析純，購自西亞試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基參考文獻[22]并改良。富集培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，煙酸10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。選擇培養(yǎng)基：煙酸10 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·H2O 0.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，pH 7.0。分離培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g/L，NaCl 10 g/L，煙酸15 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0。產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，煙酸10 g/L，K2HPO41 g/L，pH 7.0。斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，煙酸10 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0。種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，煙酸10 g/L，NaCl 10 g/L，K2HPO41 g/L，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源10 g/L，氮源10 g/L，煙酸10 g/L，K2HPO41 g/L，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；TDL-60B高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；QYC-211全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器 金壇盛藍儀器有限公司；LDZX-75KB高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；1100型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；MyCycler聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；BGZ-5自控發(fā)酵罐上海保興生物設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

用50 mL無菌水清洗腐敗魚尸體表，取10 mL洗液接入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，吸取菌液10 mL轉(zhuǎn)接至裝有100 mL選擇培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，將培養(yǎng)液梯度稀釋，取0.1 mL涂布于分離培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d。將分離培養(yǎng)基上長出的單菌落分別挑到含1 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的96 孔板中，用8 層紗布覆蓋，30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)20 h，分別取培養(yǎng)液2 μL點樣于濾紙上，用吹風(fēng)機吹干，在254 nm波長紫外燈下觀察，若菌液顯紫色熒光則可能含有6-HNA，推測該菌可能產(chǎn)生煙酸羥基化酶。取初篩菌株顯色的菌液200 μL轉(zhuǎn)接至含2 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的24 孔板中，用8層紗布覆蓋，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測發(fā)酵液酶活力，將酶活力較高的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，保藏備用。

保藏菌種轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基活化12 h后接入種子培養(yǎng)基中，50 mL裝液量/500 mL三角瓶，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，100 mL裝液量/500 mL三角瓶，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，測酶活力。

1.3.2 酶活力測定

取1 mL發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min后，將收集到的菌體用1 mL 20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌2 次，加入1 mL用20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）配制的1%煙酸溶液，30 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)120 min。反應(yīng)完成后，5 000 r/min離心10 min，取上清液適當(dāng)稀釋，用高效液相色譜法[17]測定酶催化反應(yīng)生成的6-HNA含量，并計算煙酸羥基化酶的活力[21]。將1 min催化煙酸生成1 μmol 6-HNA所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。

1.3.3 產(chǎn)物檢測

采用高效液相色譜儀，反相色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為V（10 mmol/L KH2PO4-H3PO4（pH 2.5））∶V（乙腈）=98∶2，流速為1 mL/min，檢測波長為260 nm，對供試樣液（根據(jù)具體情況決定稀釋倍數(shù)）中6-HNA的含量進行測定，用外標法定量，所有實驗均重復(fù)3 次，每次均設(shè)置3 個平行。同時對6-HNA的吸收峰進行紫外全波長掃描。

1.3.4 菌種鑒定

1.3.4.1 菌體形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征和生理生化特征的測定

用革蘭氏染色法，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)、大小，固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。

1.3.4.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將目的菌株接種在種子培養(yǎng)基30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以此為模板采用16S rDNA基因的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行PCR擴增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，93 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離純化并回收，交由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank利用BLAST程序進行相似性比對，利用MEGA5.0的Neighbor-Joining（NJ）方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.3.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.5.1 培養(yǎng)基組成單因素試驗設(shè)計

在其他培養(yǎng)條件不變的情況下，以10 g/L的比例分別用葡萄糖、糊精、蔗糖、甘油、檸檬酸鈉、乙醇、乙酸、酒石酸鉀鈉、可溶性淀粉、蘋果酸作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源；以10 g/L的比例分別用牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、硫酸銨、氯化銨、玉米漿、豆?jié)?、谷氨酸鈉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源；以最適碳、氮源為基礎(chǔ)，設(shè)置不同質(zhì)量濃度梯度的K2HPO4；在最優(yōu)碳、氮源和K2HPO4質(zhì)量濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度的煙酸，優(yōu)化誘導(dǎo)物煙酸用量。

1.3.5.2 培養(yǎng)基組成的正交試驗

選擇最適碳源（可溶性淀粉）用量、最適氮源（玉米漿）用量、煙酸用量和K2HPO4用量共4 個因素，設(shè)置3 個水平，以酶活力為指標，進行正交試驗，試驗設(shè)計如表1所示。

表 1 L9（34）正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in L9(34) orthogonal array design

1.3.5.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

在其他培養(yǎng)條件一致的情況下，將培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接種后30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，檢測煙酸羥基化酶活力，確定最適初始pH值；在其他培養(yǎng)條件一致的情況下，分別在20、25、28、30、33、35、37、40、42 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，檢測酶活力，確定最適培養(yǎng)溫度；在其他培養(yǎng)條件一致的情況下，分別按1%、3%、5%、7%、10%接種量進行接種，發(fā)酵結(jié)束后檢測酶活力，確定最適接種量；在其他培養(yǎng)條件一致的情況下，在500 mL三角瓶中分別裝50、100、200、300、400、500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)，檢測酶活力，確定最適裝液量。全部測定數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次取平均值。

1.3.5.4 靜息細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)6-HNA

取優(yōu)化培養(yǎng)條件下獲得的發(fā)酵液1 0 0 m L，5 000 r/min離心10 min收集菌體，用20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌2 次，加入100 mL用20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）配制的1%煙酸溶液，30 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)48 h，轉(zhuǎn)化過程中流加煙酸飽和溶液以維持反應(yīng)體系中10 g/L煙酸質(zhì)量濃度，反應(yīng)結(jié)束檢測6-HNA含量并計算產(chǎn)率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)以3個平行組數(shù)據(jù)的平均值表示，并計算標準偏差。用Origin 8.0作圖，SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用ANOVA進行Duncans差異分析，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選結(jié)果

利用煙酸羥基化產(chǎn)物6-HNA在紫外燈下熒光顯色特性，以煙酸為誘導(dǎo)物和底物，對樣本進行分離，分離到12 株紫色熒光明亮的菌株，分離純化后進行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)編號H9的菌株產(chǎn)煙酸羥基化酶活力較高，初始酶活力達到0.22 U/mL（表2），且產(chǎn)酶穩(wěn)定，以此菌為進一步實驗的菌株。

表 2 篩選菌株的酶活力Table 2 Screening of the isolated strains for nicotinic acid hydroxylase activity

圖 1 菌株H9發(fā)酵前后的高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms for 6-HNA standard, medium and fermented broth

2.2 產(chǎn)物鑒定結(jié)果對菌株H9發(fā)酵前后的醪液進行了高效液相色譜分析，如圖1所示，底物煙酸在發(fā)酵后其吸收峰消失，出現(xiàn)了1 個新的吸收峰，與6-HNA標準品的保留時間一致，表明菌株H9具有轉(zhuǎn)化煙酸生成6-HNA的能力。

2.3 菌種鑒定結(jié)果

2.3.1 菌體形態(tài)和培養(yǎng)特征

圖 2 菌株H9顯微照片F(xiàn)ig. 2 Micrograph of strain H9

菌株H9在LB平板上30 ℃培養(yǎng)24 h，菌落直徑2～4 mm，白色、圓形、扁平、光滑、濕潤、不透明、邊緣整齊、易挑??；顯微觀察（圖2），菌體呈桿狀，單個不成鏈、少數(shù)兩兩對生，無芽孢，具有運動性，革蘭氏陰性。在血瓊脂平板上生長時可以見到在菌落的周圍有溶血環(huán)，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)呈渾濁，有臭味。

2.3.2 生理生化特征

菌株H9氧化酶和接觸酶陽性，不能積累聚-β-羥丁酸（poly-β-hydroxybutyrate，PHB），不產(chǎn)生果聚糖，不水解吐溫80，不進行反硝化，專性好氧，4 ℃生長，41 ℃不生長，詳見表3。綜合菌體形態(tài)和生理生化特征，依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，將菌株H9初步鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

表 3 菌株H9的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain H9

2.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

圖 3 基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of selected strains

菌株H9經(jīng)DNA提取、PCR擴增和測序，獲得16S rDNA基因序列長度為1 440 bp，將此序列提交到GenBank，獲得登錄號KX369582，在GenBank中BLAST，顯示與假單胞菌屬有較高的同源性，選取與之同源性較高且有效命名的菌株的相關(guān)序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果表明，菌株H9與惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）聚在一個類群，同源性達到99%，結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性，將菌株H9菌株鑒定為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），該菌株已保藏在中國藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心，保藏號：CPCC 204164。

2.4 培養(yǎng)基配方優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 單因素試驗結(jié)果

惡臭假單胞菌的營養(yǎng)非常多樣化，能利用60～80 種不同的碳源[25]。從圖4A可以看出，菌株H9以可溶性淀粉、檸檬酸鈉、甘油或蘋果酸為碳源時其煙酸羥基化酶活力較高且無顯著差異，綜合考慮成本因素，選擇可溶性淀粉作為碳源。在以淀粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加11 種不同的氮源，分別檢測惡臭假單胞菌H9菌株的煙酸羥基化酶活力，結(jié)果（圖4B）表明，玉米漿作為氮源時酶活力最高，且顯著高于其他氮源，這和文獻報道的黏質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens IFO 12648[18]和Pseudomonas sp. BK-1[21]的最適氮源一致。在以淀粉為碳源、玉米漿為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同用量的K2HPO4作為磷酸鹽，如圖4C所示，在較低用量時酶活力隨K2HPO4用量升高而顯著升高，1.0 g/L時達到最高，繼續(xù)增加K2HPO4用量則酶活降低，由此確定發(fā)酵培養(yǎng)基中最適磷酸鹽用量為1.0 g/L。在培養(yǎng)體系中，煙酸既是底物也是誘導(dǎo)物，其用量對酶活力有顯著影響（圖4D），在用量10 g/L以下酶活力隨著煙酸用量增大而提高，繼續(xù)增加煙酸用量則酶活降低，因此最適煙酸用量為10 g/L，與文獻報道[17-18,20-21,23]一致。

圖 4 碳源（A）、氮源（B）、K2HPO4（C）和煙酸（D）用量對H9產(chǎn)酶的影響Fig. 4 Effects of carbon source (A), nitrogen source (B), K2HPO4(C) and nicotinic acid (D) on the production of nicotinic acid hydroxylase by H9

2.4.2 正交試驗結(jié)果

表 4 菌株H9產(chǎn)酶培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment design in terms of coded values with response variable

如表4所示，各因素影響大小順序為A＞D＞C＞B，最佳水平組合為A3B3C2D1。方差分析結(jié)果表明，因素A對菌株H9產(chǎn)酶的影響最顯著（表4）。因此，確定培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉15 g/L、玉米漿15 g/L、煙酸10 g/L和K2HPO41.0 g/L。2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

圖 5 初始pH值（A）、溫度（B）、接種量（C）、裝液量（D）對H9產(chǎn)酶的影響Fig. 5 Effects of initial pH (A), temperature (B), inoculum amount (C) and medium volume (D) on the production of nicotinic acid hydroxylase by H9

圖5 A表明在pH 6.5～7.0條件下酶活力最高，過酸或過堿都會造成酶活力降低，但在低于pH 6.5酸性條件下仍然保持了較高的酶活力，顯然不同于文獻報道pH 5.5～6.0的酸性環(huán)境中微生物幾乎不生長、酶活力極低的結(jié)果[20-21,23]，說明菌株H9具有較強的酸耐受性。從圖5B可見，25 ℃時酶活力最高，隨著溫度進一步升高酶活力呈現(xiàn)下降趨勢，超過40 ℃則不產(chǎn)酶。如圖5C所示，酶活力隨著接種量增加而提高，7%接種量時酶活力最高，繼續(xù)增加接種量酶活力變化不大。裝液量對菌株H9產(chǎn)酶的影響極大（圖5D），裝液量越少酶活力越高，這是因為菌株H9為惡臭假單胞菌，屬專性好氧菌，培養(yǎng)過程中要提供充足的溶氧才能保證菌體生長和產(chǎn)酶，這與文獻報道一致[17,20-21]。

2.6 驗證實驗結(jié)果

利用確定的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和優(yōu)化后的發(fā)酵條件，對菌株H9發(fā)酵，重復(fù)3 次，測定發(fā)酵液中煙酸羥基化酶活力。結(jié)果表明，優(yōu)化后惡臭假單胞菌H9所產(chǎn)煙酸羥基化酶活力達到0.37 U/mL，明顯高于優(yōu)化前利用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)生的酶活力0.22 U/mL，酶活力提高了68%，表明此優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件有利于煙酸羥基化酶活力的提高。采用靜息細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，6-HNA產(chǎn)率達到124.77 g/L。

3 結(jié) 論

據(jù)文獻報道，產(chǎn)煙酸羥基化酶的菌株多為假單胞菌屬，該屬菌株表現(xiàn)出酶活力高、易培養(yǎng)等優(yōu)良性狀，而假單胞菌常從腐敗魚尸中檢出[26-30]。結(jié)合上述信息，筆者從煙臺渤海灣采集腐敗魚尸，共分離46 個單菌落，初篩12 株紫外熒光顯影的菌株，搖瓶復(fù)篩選出4 株產(chǎn)煙酸羥基化酶的菌株，其中H9酶活最高，經(jīng)鑒定為惡臭假單胞菌，命名為Pseudomonas putida H9，保藏在中國藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心（保藏號：CPCC 204164）。

通過培養(yǎng)條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)菌株H9的培養(yǎng)特性與已報到的同類產(chǎn)酶菌株有較大差異，主要表現(xiàn)為：最適碳源有多種選擇，包括可溶性淀粉、檸檬酸鈉、甘油和蘋果酸，有利于降低生產(chǎn)成本；具有較寬的pH值耐受范圍，更容易控制發(fā)酵過程；最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，明顯區(qū)別于已報道相關(guān)菌株的最適培養(yǎng)溫度28 ℃和30 ℃。造成上述差異的原因可能是因為菌株H9分離自海洋死亡腐爛魚尸而非土樣。優(yōu)化后培養(yǎng)條件為：可溶性淀粉15 g/L、玉米漿15 g/L、煙酸10 g/L、K2HPO41.0 g/L、初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度25 ℃、接種量7%、500 mL三角瓶裝液量50 mL。在此條件下菌株H9的煙酸羥基化酶活力達到0.37 U/mL，采用流加煙酸，靜息細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)實驗，6-HNA產(chǎn)率達到124.77 g/L，此產(chǎn)率高于陸偉宏等[20]報道的惡臭假單胞菌Pseudomonas putida NA_1（108.39 g/L），但低于Nagasawa等[17]報道的熒光假單胞菌Psudomonasuorescens TN5（191 g/L）和Hurh等[18]報道的黏質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens IFO12648（301 g/L）。與上述菌株相比，菌株H9是首次報道的海洋來源的產(chǎn)煙酸羥基化酶的細菌，具有培養(yǎng)基組成簡單、原料廉價易得、耐酸性較強等優(yōu)點，具有工業(yè)化生產(chǎn)6-HNA的應(yīng)用前景。通過誘變育種及優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，仍有進一步提高菌株H9酶活和轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的可能，相關(guān)研究工作正在進行中。

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Isolation, Identification and Culture Optimization of Pseudomonas putida H9, a Marine Bacterium Producing Nicotinic Acid Hydroxylase

CHEN Guozhong, GUO Qiucui, TAN Qixiu, WU Shuojun, LIU Lianqiang, FENG Zhibin*
(School of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China)

A nicotinic acid hydroxylase- producing strain from spoiled fish from Bohai Bay in Yantai, designated H9, was rapidly and directionally screened using a 96-well microplate and ultraviolet imaging. Strain H9 was identified as Pseudomonas putida based on its morphological, physiological and biochemical characteristics, and 16S rDNA sequence. Our results showed that the highest activity of nicotinic acid hydroxylase of 0.37 U/mL was obtained by culturing strain H9 with 50 mL of a medium consisting of 15 g/L soluble starch, 15 g/L corn steep liquor, 10 g/L nicotinic acid and, 1.0 g/L K2HPO4at an initial pH of 7.0 in a 500-mL flask at 25 ℃ with an inoculum amount of 7%, which was increased by 68% as compared to that before optimization. The yield of 6-hydroxynicotinic acid (6-HNA) produced by resting cell biotransformation reached 124.77 g/L. Accordingly, strain H9 had a promising application potential in the industrial production of 6-hydroxynicotinic acid.

nicotinic acid; 6-hydroxynicotinic acid; Pseudomonas putida; nicotinic acid hydroxylase; optimization of culture conditions

10.7506/spkx1002-6630-201710022

Q93

A

1002-6630（2017）10-0130-07

陳國忠, 郭秋翠, 譚其秀, 等. 1 株產(chǎn)煙酸羥基化酶海洋細菌H9的分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 130-136. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710022. http://www.spkx.net.cn

CHEN Guozhong, GUO Qiucui, TAN Qixiu, et al. Isolation, identification and culture optimization of Pseudomonas putida H9, a marine bacterium producing nicotinic acid hydroxylase[J]. Food Science, 2017, 38(10): 130-136. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710022. http://www.spkx.net.cn

2016-06-27

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新項目（SDAIT-11-10）；城新創(chuàng)新基金項目（CXJ-06）；魯東大學(xué)科研基金項目（27710301）

陳國忠（1980—），男，講師，博士，研究方向為生物化工。E-mail：guozhongch@126.com

*通信作者：馮志彬（1977—），男，講師，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：zhibinfeng@126.com