方靜嫻，錢 虹，劉河娣，唐 翔

(1.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院/廣東省口腔醫(yī)院兒童牙科，廣州 510280；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦科，廣州 510260)

論著·基礎(chǔ)研究

DHODH缺失對線粒體功能和成骨細(xì)胞分化成熟影響的研究*

方靜嫻1，錢 虹1，劉河娣1，唐 翔2△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院/廣東省口腔醫(yī)院兒童牙科，廣州 510280；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦科，廣州 510260)

目的 探討二氧乳清酸脫氫酶(DHODH)缺失對線粒體功能和成骨細(xì)胞分化成熟的影響。方法 通過特異性小干擾RNA(siRNA)技術(shù)抑制小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞中DHODH表達(dá)后，觀察細(xì)胞增殖、三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)量及骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平。結(jié)果 特異性siRNAs降低DHODH表達(dá)后，細(xì)胞增殖受抑制、細(xì)胞周期停滯于G1/S期。全細(xì)胞ATP產(chǎn)量，特別是線粒體來源的ATP減少。與對照組相比，DHODH 抑制組中Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)及骨鈣素(Ocn)的mRNAs表達(dá)量降低。結(jié)論 抑制DHODH蛋白影響成骨細(xì)胞的分化與成熟。成骨細(xì)胞中線粒體功能異常可能是導(dǎo)致米勒綜合征骨發(fā)育異常的原因之一。

二氫乳清酸脫氫酶；線粒體；成骨細(xì)胞；米勒綜合征

米勒綜合征由二氫乳清酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)突變所致[1-3]。DHODH是嘧啶從頭合成途徑生物合成途徑中惟一在線粒體內(nèi)發(fā)生作用的限速酶[4-5]。線粒體產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)并調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡以及其他多重代謝途徑[5-6]。前期研究通過海拉(HeLa)細(xì)胞已證明，DHODH突變影響了線粒體功能進(jìn)而影響了米勒綜合征的病理發(fā)生[7-8]。然而，目前仍不清楚DHODH缺失如何最終導(dǎo)致米勒綜合征的發(fā)生。米勒綜合征的許多臨床癥狀與骨發(fā)育相關(guān)，本研究采用成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)，通過特殊小干擾RNAs(siRNAs)抑制DHODH，觀察抑制后成骨細(xì)胞內(nèi)和線粒體的變化，旨在探索成骨細(xì)胞中DHODH功能異常是否與米勒綜合征發(fā)生相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠頭顱成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，MC3T3E1細(xì)胞受贈于日本九州大學(xué)牙學(xué)院解剖教研室。MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于包含10%熱失活胎牛血清以及1%青霉素/鏈霉素的基本血清(ɑMEM)之中，置于5% CO2濃度的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞長滿續(xù)代時使用trypsin/EDTA(Gibco,Carlsbad,CA,美國)，并將1×104細(xì)胞再植于含ɑMEM/10%胎牛血清(FBS)的24孔板中。

1.2 抗體及試劑 DHODH抗體受贈于日本九州大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床檢查部分子生物學(xué)檢查室。β-actin抗體購于美國Sigma cyclineB1，p53抗體購于美國Santa Cruz。細(xì)胞周期依賴蛋白激酶Cdk1/Cdc2(CDC2)以及磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(phospho-RB)抗體購于美國Cell Signaling。

1.3 方法

1.3.1 siRNAs法抑制蛋白表達(dá) 兩組25 bp雙鏈DHODHsiRNA訂購于StealthSelectRNAi(Invitrogen，美國)。DHODH及對照組siRNA序列及轉(zhuǎn)染方法參見文獻(xiàn)[7]。

1.3.2 細(xì)胞增殖測定 為檢測抑制DHODH后細(xì)胞增殖受影響情況，MC3T3E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染DHODH siRNA或?qū)φ战MsiRNA后以1×104濃度轉(zhuǎn)入24孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)液含αMEM及透析10%FBS。每組重復(fù)3次。細(xì)胞培養(yǎng)至72 h，每日脫壁收集，用CoulterCounter(Beckman Coulter，美國)計數(shù)。

1.3.3 蛋白印記 MC3T3-E1細(xì)胞裂解于TNE裂解液[50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)/HCl,pH 7.5,1 mmol/L EDTA,150 mmol/L NaCl,0.5% Nonidet P-40]。每組上樣20 ug蛋白于SDS電泳膠中，并用相應(yīng)抗體進(jìn)行免疫阻斷。檢測、分析方法及工具參見文獻(xiàn)[7]。

1.3.4 ATP定量分析 細(xì)胞ATP產(chǎn)量通過ATP檢測試劑盒測量，依照生產(chǎn)廠商使用說明(Promega,Madison,WI,美國)。細(xì)胞裂解于被動裂解液中(Promega)并以相同反應(yīng)量加入反應(yīng)中。裂解液中的發(fā)光量依照每份裂解液中所含蛋白量均化后檢測計算。所得ATP值按線性標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。

1.3.5 RNA提取及RT-PCR分析 經(jīng)DHODH siRNA轉(zhuǎn)染72 h后，MC3T3E1細(xì)胞的RNA依照生產(chǎn)廠商使用說明通過Triziol試劑盒(Invitrogen)裂解收集。所有RNA均使用無核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶I(Promega)處理，并使用RNeasyKit(Qiagen,Mainz,德國)純化。用1 μg RNA經(jīng)ReverTraAce(Toyobo,Osaka,日本)合成cDNA后，用QuickTaq(Invitrogen)PCR擴(kuò)增出小鼠Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、骨鈣素(Ocn)以及3-磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh)，再將PCR產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠中電泳。電泳結(jié)果用溴化乙錠染色顯影，基因表達(dá)狀態(tài)用NIH image(http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)定量。相關(guān)小鼠序列引物及PCR反應(yīng)條件見表1。

2 結(jié) 果

2.1 干擾DHODH RNA后目標(biāo)蛋白表達(dá)受影響 分別使用兩種不同DHODH siRNA處理成骨細(xì)胞前體細(xì)胞72 h后，DHODH蛋白量在MC3T3E1細(xì)胞中生成量減少，而細(xì)胞內(nèi)β-actin表達(dá)量并未受影響(圖1A)。對照siRNA用以檢測DHODH siRNA作用的特異性，在該組中并未檢測到DHODH及β-actin表達(dá)量受到影響(圖1A)。

2.2 抑制DHODH蛋白表達(dá)后細(xì)胞增殖受影響 每組處理后MC3T3E1細(xì)胞數(shù)值使用Coulter Counter (Beckman Coulter)計數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHODH siRNA處理組中細(xì)胞增殖速度較對照組降低(圖1B)。

2.3 抑制DHODH后對細(xì)胞周期的影響 在抑制DHODH表達(dá)后，CDC2，cyclineB1以及phospho-RB在MC3T3E1中的表達(dá)量有少量減少，而p53蛋白量少量增加，提示經(jīng)DHODH siRNA處理后MC3T3E1細(xì)胞可能停滯于G1/S期(圖1C)。

2.4 抑制DHODH后細(xì)胞及線粒體ATP產(chǎn)量減少 細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理后，不同DHODH siRNA組均顯示較低的ATP產(chǎn)量，該現(xiàn)象在DHODH si#1組中尤為明顯(圖1D)。MC3T3E1細(xì)胞中DHODH si#1和si#2轉(zhuǎn)染組中，源于線粒體的ATP產(chǎn)量顯著較對照組低(圖1D)。此外，經(jīng)寡霉素(Oligomycin)，線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合體V抑制劑處理后，所有實(shí)驗組中ATP產(chǎn)量均大大減低(圖1D)。這些數(shù)據(jù)顯示DHODH缺失可導(dǎo)致成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中線粒體功能異常，而這也補(bǔ)充完善了基于HeLa細(xì)胞對米勒綜合征的研究[7]。

A：兩種不同DHODH蛋白siRNA(DHODH si#1和DHODH si#2)轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞后DHODH蛋白表達(dá)量；B：siRNA轉(zhuǎn)染后MC3T3-E1細(xì)胞增殖狀況；C：轉(zhuǎn)染DHODH siRNA 72 h后 MC3T3-E1細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；D：轉(zhuǎn)染DHODH siRNA后MC3T3-E1細(xì)胞ATP產(chǎn)量變化情況；*:P<0.05。

圖1 轉(zhuǎn)染抑制DHODH表達(dá)后所產(chǎn)生的影響

2.5 成骨基因的表達(dá) MC3T3E1細(xì)胞中DHODH表達(dá)受抑制后，Runx2及Ocn基因表達(dá)量均顯著降低(圖2)，從而說明DHODH減少后正常骨形成過程受干擾。

A：MC3T3E1細(xì)胞中DHODH表達(dá)受抑制后，Runx2及Ocn基因表達(dá)電泳結(jié)果；B：MC3T3E1細(xì)胞中DHODH表達(dá)受抑制后，Runx2及Ocn基因表達(dá)定量分析；*:P<0.05。

圖2 相關(guān)成骨基因表達(dá)量

3 討 論

DHODH是一種含鐵的黃素依賴的線粒體酶，是核酸中嘧啶合成的關(guān)鍵酶，其作用是催化嘧啶從頭生物合成途徑中的第四步反應(yīng)。DHODH是免疫相關(guān)疾病的重要靶點(diǎn)[9]。抑制DHODH，可以阻斷新生嘧啶合成，致使DNA合成障礙，抑制活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞的增殖，從而在免疫抑制和抗腫瘤中起重要作用。DHODH抑制劑來氟米特已經(jīng)成功應(yīng)用于自身免疫性疾病如紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腎病綜合征等的臨床治療。另一種DHODH抑制劑布喹那已經(jīng)分別完成了抗腫瘤和器官移植免疫抑制的Ⅱ期臨床試驗[10]。此外，嘧啶補(bǔ)救途徑的缺失使瘧原蟲完全依賴于DHODH參與的嘧啶從頭合成途徑，因此對 DHODH 抑制劑敏感。 而人類細(xì)胞卻可通過嘧啶補(bǔ)救途徑獲取維持細(xì)胞生長所需的嘧啶，故DHODH還是理想的抗瘧藥新靶點(diǎn)。

然而關(guān)于DHODH與骨發(fā)育的研究鮮有報道?；诿桌站C合征的多項癥狀涉及骨骼發(fā)育，而DHODH又是該病的致病基因，所以本研究將抑制DHODH后成骨細(xì)胞前體細(xì)胞相關(guān)變化作為研究內(nèi)容。米勒綜合征是常染色體隱性遺傳或伴發(fā)復(fù)合雜合型突變[3]。目前認(rèn)為DHODH突變是導(dǎo)致該疾病的致病原因[3]，并阻斷了米勒綜合征患者胚胎發(fā)育中第一和第二鰓弓的發(fā)育[1-2]。米勒綜合征由DHODH功能異常所致并與骨骼結(jié)構(gòu)異常相關(guān)。作者前期研究中觀察了源自宮頸癌的HeLa細(xì)胞中DHODH的功能[7-8]，并發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中DHODH缺失可導(dǎo)致線粒體功能異常和細(xì)胞周期停止，從而推論出DHODH功能缺失導(dǎo)致線粒體功能障礙，對米勒綜合征發(fā)生產(chǎn)生作用。盡管前期研究中，分析了DHODH在癌細(xì)胞中的功能，但其在涉及骨骼結(jié)構(gòu)的細(xì)胞中所發(fā)揮的分子機(jī)制并沒有被完全發(fā)現(xiàn)。

因此，在本研究中，通過使用成骨細(xì)胞前體細(xì)胞試圖闡明DHODH在這些細(xì)胞中的作用并尋找米勒綜合征的發(fā)病機(jī)制。合成ATP為細(xì)胞提供能量是線粒體的主要功能之一。DHODH是嘧啶合成途徑中惟一定植于線粒體中的限速酶。而當(dāng)尿苷磷酸合酶(UMPS)，DHODH后續(xù)限速酶編碼基因，突變時其所導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)型卻與米勒綜合征的臨床表現(xiàn)不同。在MC3T3E1細(xì)胞，小鼠頭顱成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中，DHODH抑制組較對照組，細(xì)胞繁殖減緩，細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量，特別是線粒體來源ATP產(chǎn)量降低。明確了線粒體功能異常很可能導(dǎo)致米勒綜合征中骨骼結(jié)構(gòu)發(fā)育異常。

Runx2是轉(zhuǎn)錄因子，也是間充質(zhì)干細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞的必須主基因。骨鈣素由成骨細(xì)胞分泌并參與促進(jìn)骨形成[11]。因此這些基因?qū)τ诔晒羌?xì)胞的分化與成熟發(fā)揮著重要作用。當(dāng)MC3T3E1細(xì)胞中DHODH受抑制時，骨鈣素基因的表達(dá)水平顯著降低(圖2)。本課題研究結(jié)果提示DHODH減少所引起的線粒體功能障礙可導(dǎo)致成骨細(xì)胞成熟過程停滯，而這有可能導(dǎo)致米勒綜合征異常骨骼發(fā)育。

綜上所述，本研究證明了DHODH缺失導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而影響成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖和成骨基因表達(dá)。這提示了DHODH很有可能參與了成骨細(xì)胞的分化與成熟。因此，DHODH蛋白減少或缺失所引起的成骨細(xì)胞功能障礙有可能與米勒綜合征的發(fā)生和臨床癥狀相關(guān)。

頜面部骨發(fā)育障礙僅是米勒綜合征發(fā)病機(jī)制的一個方面，若要進(jìn)一步闡明米勒綜合征發(fā)生分子機(jī)制，仍需從其他組織或細(xì)胞包括神經(jīng)嵴細(xì)胞領(lǐng)域深入研究。

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Study on effects of DHODH deficiency on mitochondrial function and differentiation and maturation in osteoblast cells*

FangJingxian1,QianHong1，LiuHedi1,TangXiang2△

(1.DepartmentofPediatricDentistry,StomatologicalHospital,SouthernMedicalUniversity/GuangdongProvincialStomatologicalHospital,Guangzhou,Guangdong510280,China;2.DepartmentofGynecology,SecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510260,China)

Objective To observe the changes of the skeletal development related cells after dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) deficiency.Methods The DHODH expression in MC3T3-E1 cells derived from mouse calvaria osteoblast precursor cells was inhibited by specific small interfering RNAs (siRNAs),and cell proliferation,ATP production and expression levels of bone-related genes were investigated in these cells.Results After reducing the DHODH expression by using specific siRNAs,cell proliferation was inhibited and cell cycle was arrested at G1/S stage.In addition,the ATP production was reduced in whole cells,especially in mitochondria.Furthermore,the expression levels of Runt-related transcription factor 2 (Runx2) and osteocalcin (Ocn) mRNAs in the DHODH inhibition group were decreased compared with the control group.Conclusion Inhibiting DHODH protein affects the differentiation and maturation of osteoblasts.The mitochondrial dysfunction in osteoblasts may be one of causes leading to the abnormal bone formation in Miller syndrome.

dihydroorotate dehydrogenase;mitochondria;osteoblast cells;Miller syndrome

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.005

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(2015A030310105)；廣州市衛(wèi)生局醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(20161A011070)；廣州醫(yī)科大學(xué)博士科研啟動項目(2014C34)。 作者簡介：方靜嫻(1983-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事口腔內(nèi)科學(xué)及口腔遺傳病學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究。△

，E-mail：21558034@qq.com。

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A

1671-8348(2017)10-1312-03

2016-11-11

2017-01-22)