丁洽烽，李玉光，潘紅星，譚學(xué)瑞，陳永松

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東汕頭515041）

β3腎上腺素能受體在大鼠缺血心肌中的表達(dá)△

丁洽烽，李玉光，潘紅星，譚學(xué)瑞，陳永松

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東汕頭515041）

目的探究β3腎上腺素能受體在大鼠缺血心肌中的表達(dá)。方法結(jié)扎大鼠冠狀動脈建立心肌慢性缺血模型，應(yīng)用免疫組化和Western blot檢測β3受體在缺血后心肌中的表達(dá)及分布。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組對比，手術(shù)組中慢性缺血心肌細(xì)胞有強(qiáng)β3受體蛋白表達(dá)信號，其分布不均一。Western blot提示，手術(shù)組大鼠心肌β3受體表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。心肌組織中的微血管內(nèi)皮細(xì)胞也有β3受體蛋白表達(dá)。結(jié)論大鼠慢性缺血心肌組織中的心肌細(xì)胞和心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞β3受體表達(dá)增多。

β3腎上腺素能受體；心肌缺血；大鼠

β3受體的基因在很早就被成功克?。?］，早期發(fā)現(xiàn)β3受體主要分布在白色和棕色脂肪組織，所以被認(rèn)為跟心臟的關(guān)系不大。然而，近來的研究發(fā)現(xiàn)，在β3受體激動劑BRL37344的作用下，心臟可產(chǎn)生負(fù)性的變力作用，提示β3受體在心血管系統(tǒng)中有著重要的作用。近年來，有研究認(rèn)為，β3受體對心臟有保護(hù)作用，但是有研究認(rèn)為其促進(jìn)心力衰竭的發(fā)展，這跟其在心臟中的表達(dá)分布是否有關(guān)尚不明確。有關(guān)慢性缺血心肌中β3受體蛋白表達(dá)分布的研究甚少，為此，我們在大鼠動物模型上對其表達(dá)及分布進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究其在心血管系統(tǒng)中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動 物

雌雄不限，健康Spreague-Dawley大鼠40只，體質(zhì)量為（220±20）g。由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 動物模型的建立

大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組和假手術(shù)組，應(yīng)用結(jié)扎冠狀動脈的方法建立慢性心肌缺血模型。主要過程如下：大鼠稱重，麻醉，阿托品皮下注射減少分泌物。麻醉藥起效后將大鼠固定于實驗臺。大鼠行氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)，同時連接BL-420E生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，對其進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)。手術(shù)部位剪毛、消毒、開胸，找到心臟后撕開心包膜，在左心耳和肺動脈圓錐之間結(jié)扎血管。假手術(shù)組只縫線、不結(jié)扎。手術(shù)完畢，用蘸有青霉素液的棉支涂擦創(chuàng)口，預(yù)防感染，鼓肺并迅速關(guān)胸。脫機(jī)后放回鼠籠飼養(yǎng)兩個月。兩個月后處死大鼠，取出心臟，一半用甲醛固定，一半存放于-80℃冰箱備用。

1.3 免疫組化方法

常規(guī)脫蠟，梯度酒精，3%的H2O2和抗原修復(fù)，封閉液封閉，用山羊抗大鼠一抗滴加后在4℃過夜。按S-P試劑盒的說明逐個加液，最后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，分化，脫水，封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對照，用脂肪組織做陽性對照。顯示棕黃色為陽性顆粒。結(jié)果用NIKON拍照系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.4 Western blot方法

裂解液裂解，提取心肌組織蛋白，Bradford比色法測定濃度。等量上樣，在12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠電泳。蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉過夜。加入羊抗鼠β3受體的一抗進(jìn)行雜交，再用辣根標(biāo)記的兔抗山羊IgG二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)。結(jié)果在圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行灰度峰值分析。

1.5 設(shè)備及試劑

BL-420E生物機(jī)能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），TKR-200C小動物呼吸機(jī)（江西特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司），NIKON拍照系統(tǒng)。β3抗體購自Santa Cruz公司，S-P試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 缺血心肌的大體標(biāo)本和鏡下結(jié)構(gòu)

本模型建立的是心肌慢性缺血病變，大體標(biāo)本外觀可以看到很明顯的瘢痕形成，慢性心肌缺血明確。蘇木素-伊紅（HE）染色后對缺血區(qū)、邊緣區(qū)和非缺血區(qū)分別進(jìn)行鏡下觀察：梗死灶中壞死的心肌纖維逐漸被溶解吸收，殘留部分肌膜，原心肌結(jié)構(gòu)改變明顯，主要為纖維組織代替而形成瘢痕。梗死灶周邊為部分心肌溶解，有較多的巨噬細(xì)胞。可見內(nèi)膜下部分免于壞死的心肌細(xì)胞仍存，仍可以看到變性后心肌細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)。在非缺血區(qū)，心肌細(xì)胞代償性肥大，橫徑增加，核增大，染色深，外形不規(guī)整。

2.2 β3受體在缺血心肌中的表達(dá)及分布

2.1.1 β3受體表達(dá)的免疫組化結(jié)果 在心肌細(xì)胞的胞膜上和胞漿里可見β3受體表達(dá)。心肌缺血后β3受體的表達(dá)明顯增多，尤其是那些免于壞死纖維化的細(xì)胞和代償性肥大的細(xì)胞表達(dá)增多更加明顯，見圖1。有趣的是，同在一個區(qū)域，有的細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)，有的表達(dá)很弱，分布不均勻，見圖2。

圖1 心肌組織中β3受體免疫組化結(jié)果［（a）為假手術(shù)組（×20）；（b）為手術(shù)組（×20）；（c）為手術(shù)組高倍鏡下所見（×100）。（d）（e）（f）為陰性對照］

圖2 心肌組織中β3受體分布情況（×100）［（a）為脂肪組織，作為陽性對照；（b）為缺血心肌在高倍鏡下所見，在同一個區(qū)域，有的細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)，有的細(xì)胞表達(dá)很弱］

2.1.2 β3受體表達(dá)的Western Blot結(jié)果 結(jié)果顯示，手術(shù)組可見明顯的β3受體蛋白陽性條帶，假手術(shù)組蛋白條帶較弱?；叶确治鲲@示，β3受體在缺血后心肌中的表達(dá)明顯上調(diào)，結(jié)果詳見表1。

表1 β3受體表達(dá)Western blot結(jié)果

2.1.3 β3受體在缺血心肌微血管中的表達(dá) 在心肌組織的免疫組化檢測結(jié)果中，我們觀察到缺血的心肌微小血管上也有β3受體表達(dá)，主要是表達(dá)在內(nèi)皮，詳見圖3。

圖3 心肌組織微小血管內(nèi)皮β3受體的表達(dá)（×100）［（a）手術(shù)組；（b）假手術(shù)組；（c）（d）為空白對照］

3 討 論

心肌缺血模型的建立方法有多種，不同方法建立的模型適用于不同的研究。開胸結(jié)扎冠狀動脈復(fù)制心肌缺血模型的方法比較成熟、可靠。結(jié)扎后可見明顯的缺血梗死區(qū)，鏡下可見心肌變性壞死、纖維化和瘢痕代替。在非缺血梗死區(qū)肌纖維排列紊亂，不均勻肥大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，胞核增多，心肌間質(zhì)增生。我們的實驗結(jié)果顯示，技術(shù)成熟后成功結(jié)扎大鼠冠狀動脈所造的動物模型可用于心肌缺血的研究。

β3受體最開始是在嚙齒動物的脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的，后來在其他部位也有發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為其跟脂肪代謝，胃腸道和血管平滑肌的舒張調(diào)節(jié)等有關(guān)［2-4］。心臟存在β腎上腺素能受體家族，隨著對腎上腺素能受體與心臟功能關(guān)系研究的深入，本來被認(rèn)為跟心臟的關(guān)系不大的β3受體越來越為學(xué)者所重視。相關(guān)研究指出，心臟在選擇性β3受體激動劑BRL37344作用下表現(xiàn)為負(fù)性的變力作用，這種負(fù)性心力作用在心力衰竭中可能有著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，β3受體在心肌內(nèi)膜、中膜、外膜上的分布沒有差別［5］。在人的標(biāo)本中，可以看到右心室心肌細(xì)胞上有β3受體表達(dá)在細(xì)胞膜上［6］。Gauthier等［7］報道正常心臟的心室就已經(jīng)存在著功能性的β3受體。在大鼠心肌缺血后，我們采用免疫組化和Western blot方法從蛋白水平對β3受體進(jìn)行定位定性研究。結(jié)果觀察到β3受體表達(dá)在大鼠心肌細(xì)胞的胞膜上和胞漿里，這與文獻(xiàn)報道只在胞漿表達(dá)的結(jié)果有所不同。這可能是由于動物模型、缺血的范圍和程度等不同因素造成的。在缺血心肌組織的非梗死區(qū)，那些免于壞死纖維化的心室肌細(xì)胞上有大量的β3受體表達(dá)。有趣的是在同一個高倍鏡下，能同時觀察到強(qiáng)表達(dá)β3受體的心肌細(xì)胞旁邊也有弱表達(dá)β3受體的心肌細(xì)胞，原因不明。假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞上的β3受體表達(dá)甚弱。近年來有研究認(rèn)為β3受體對心臟有保護(hù)作用［8］，但是也有研究認(rèn)為其促進(jìn)心力衰竭的發(fā)展［9］，也許這跟β3受體在心臟中的表達(dá)分布不均勻有一定的關(guān)系。

另外，我們也觀察到心臟組織內(nèi)的微小血管上有β3受體表達(dá)，主要集中表達(dá)在缺血心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞上。微血管內(nèi)皮有重要的作用，β3受體在缺血心肌微血管內(nèi)皮表達(dá)增高的意義有待進(jìn)一步的研究。

本實驗建立慢性心肌缺血動物模型，檢測結(jié)果表明，缺血心肌中β3受體表達(dá)上調(diào)、分布不均，這為進(jìn)一步研究β3受體在心血管系統(tǒng)中的作用提供基礎(chǔ)。

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Expression of beta 3 adrenergic receptors in rats with myocardial ischemia

DING Qia-feng，LI Yu-guang，PAN Hong-xing，TAN Xue-rui，CHEN Yong-song
（The First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College，Shantou，Guangdong 515041，China）

ObjectivesTo study the expression of β3adrenergic receptors in rats with myocardial ischemia.MethodsThe chronic myocardial ischemia model in rat was established by left coronary artery ligation.The expression and distribution of β3adrenergic receptors were detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsStrong staining of β3adrenergic receptor in myocardium cell was showed in operated group and the distribution was not uniform when compared with sham-operated group.The result of Western blot showed that the expression of β3adrenergic re?ceptor in operated group was significantly higher than that in Sham-operated group（P<0.001）.The β3adrenergic receptors could be also identified by immunohistochemistry in cardiac microvascular endothelial cells.ConclusionsExpression of β3adrenergic receptors increases in myocardial cells and cardiac microvascular endothelial cells in chronic myocardial ischemia.

β3adrenergic receptor；myocardial ischemia；rat

R542.2+2

：A

：1007-9688（2017）01-0089-04

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.01.23

2016-06-06）

廣東省科技計劃項目（項目編號：2003C30613）

丁洽烽（1979-），男，在讀博士研究生，研究方向為重癥醫(yī)學(xué)。