趙杰，陳秀娟，劉芳，杜琛

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 生殖中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

臨床報(bào)道

IVF中未見原核卵裂胚胎囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的CNV檢測(cè)價(jià)值研究*

趙杰，陳秀娟，劉芳，杜琛

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 生殖中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

目的對(duì)常規(guī)體外受精（IVF）中未見原核卵裂胚胎囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞>10 MB拷貝數(shù)變異進(jìn)行分析。方法對(duì)IVF受精的未見原核卵裂胚胎囊胚培養(yǎng)，利用全基因組測(cè)序的方法對(duì)D5評(píng)級(jí)>3BC囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行>10MB的拷貝數(shù)變異檢測(cè)，判斷未見原核卵裂胚胎囊胚非整倍體變異程度。結(jié)果共選擇未見原核卵裂胚胎69例，形成囊胚51例（73.91%）；囊胚評(píng)級(jí)>3BC者共33例，對(duì)其進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢并進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測(cè)，檢測(cè)成功23例（70%），其中正常核型（46，XN）17例（73.9%），異常6例（26.1%）。結(jié)論未見原核卵裂胚胎經(jīng)囊胚培養(yǎng)可以獲得較高比例染色體正常胚胎，結(jié)合胚胎植入前遺傳學(xué)診斷及產(chǎn)前診斷技術(shù)，未見原核卵裂囊胚具有利用價(jià)值。

未見原核卵裂胚胎；囊胚；拷貝數(shù)變異

在實(shí)施體外受精（in vitro fertilization，IVF）操作過(guò)程中，有一部分卵子在受精后17～19 h不能看到原核（primary nucleus，PN），但是卻能夠卵裂，這些胚胎一般情況下被認(rèn)為是異常胚胎，不用做胚胎移植，本研究將未見原核卵裂胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，并利用測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)育到囊胚階段的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行基因拷貝數(shù)變異（copy number variation detection，CNV）檢測(cè)，分析其>10 MB的拷貝數(shù)是否存在異常，探討未見原核卵裂胚胎經(jīng)囊胚培養(yǎng)篩選判斷其是否具有利用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 患者選擇、促排卵及獲卵

選取2016年1月-2016年3月在本院生殖中心行常規(guī)IVF助孕治療的患者，共35個(gè)周期，患者年齡24～40歲，不孕年限1～10年，原發(fā)不孕20例，繼發(fā)不孕15例。所有患者夫妻雙方染色體檢測(cè)為正常，不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩?；患者均采用常?guī)長(zhǎng)方案促排卵，促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑降調(diào)節(jié)后適時(shí)啟動(dòng)Gn，當(dāng)1個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm或2個(gè)主導(dǎo)卵泡≥17 mm時(shí)肌注人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）（上海麗珠制藥有限公司）4000～10 000 u，HCG注射后36～38 h取卵。

1.2 受精及胚胎選擇

精液經(jīng)優(yōu)化處理后，在HCG 39～40h進(jìn)行受精，授精濃度為1.0～1.5萬(wàn)條活動(dòng)精子/個(gè)卵子。受精后4.5～5.0 h拆卵。加精17～19 h觀察原核情況，未見原核、見極體者作為研究對(duì)象，轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基微滴中培養(yǎng)。培養(yǎng)到第3天，對(duì)其進(jìn)行激光打孔，打孔直徑10～20 μm，繼續(xù)體外培養(yǎng)至第5和6天，對(duì)發(fā)育到>3BC并有滋養(yǎng)層細(xì)胞滲出的囊胚活檢3～10個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞，送北京貝瑞和康公司進(jìn)行CNV檢測(cè)。

2 結(jié)果

35個(gè)周期的患者，年齡24～40歲，平均（30.66± 3.87）歲；不孕年限1～10年，平均（3.99±2.45）年；共獲得卵子587例，平均（16.77±7.27）例；受精474例（80.75%）；正常受精304例（51.79%）；異常受精170例（28.96%），其中未見原核卵裂胚胎69例，對(duì)其進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，形成囊胚51例（73.91%）；囊胚評(píng)級(jí)> 3BC者33例，活檢取滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測(cè)，檢測(cè)成功并得到結(jié)果23例，成功率為70%；23例中正常核型（46，XN）17例（73.9%）；異常6例（26.1%）。其中1例為21三體（47，XN，+21），1例為復(fù)合型異常，1例 21號(hào)染色體缺失 33.8 MB（-21q11.2q22.3，33.8MB），1例在5號(hào)染色體重復(fù)（Chr5：90820000-175420000-2.3），1例在 6號(hào)、21號(hào)染色體上重復(fù)（Chr6：4260000-156860000-2.5；Chr21：15740000-42500000-2.5），1例16三體（47，XN，+16）。見附圖。

附圖 CNV檢測(cè)結(jié)果

3 討論

未見原核卵裂胚胎的出現(xiàn)可能是由于卵子發(fā)生孤雌激活、原核形成機(jī)制或染色體分裂異常，以及卵子受到刺激使原核出現(xiàn)過(guò)早或過(guò)晚錯(cuò)過(guò)觀察時(shí)間，倘若2個(gè)原核出現(xiàn)過(guò)早或晚，那么該胚胎仍可能具有正常的核型。NOYES等[1]在對(duì)未見原核卵裂胚胎卵裂球核型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)<3%的胚胎具有2倍體核型，所以認(rèn)為，未見原核卵裂胚胎常存在染色體異常，胚胎質(zhì)量及發(fā)育潛能差，無(wú)移植價(jià)值[2]。正常受精胚胎在發(fā)育到8細(xì)胞之前其發(fā)育主要由卵細(xì)胞決定，在胚胎發(fā)生融合之后，胚胎的基因組被激活，并決定胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，所以認(rèn)為能發(fā)育到囊胚階段的胚胎的染色體異常比例較低[3]。如果通過(guò)延長(zhǎng)未見原核卵裂胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間，篩選出囊胚，該胚胎有可能是正常，再通過(guò)遺傳學(xué)檢測(cè)加以證明，無(wú)疑會(huì)增加胚胎使用率[4]。本研究對(duì)D5發(fā)育到>3BC級(jí)的23例未見原核卵裂囊胚行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢，并進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在有檢出的胚胎中，17例胚胎的染色體核型是正常的（73.9%），而該比例與2原核受精胚胎接近。

綜上所述，本研究對(duì)于未見原核卵裂胚胎經(jīng)囊胚培養(yǎng)，并進(jìn)行染色體核型及>10 MB拷貝數(shù)變異檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其正常核型的比例較高，但是否將該方法作為一種常規(guī)方式，還需要大樣本的研究，但如果結(jié)合胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)，從囊胚中篩選出正常核型的胚胎，進(jìn)行移植，在妊娠后，利用產(chǎn)前篩查技術(shù)及早判斷妊娠胎兒是否異常，避免出生缺陷，是一種切實(shí)可行的方法[5]。

[1]NOYES N,FINO ME,KREY L,et al.Embryo biopsyl:the fate of abnormal pronuclear embryos[J].Reprod Biomed Online,2008, 17(6):782-788.

[2]REICHMAN D E,JACKSON K V,RACOWSKY C.Incidence and development of zygotes exhibiting abnormal pronuclear disposition afteridentification oftwopronucleiatthefertilization check[J].Fertil Steril,2010,94(3):965-970.

[3]GARDER D K,BALABAN B.Choosing between day 3 and day 5 transfers[J].Clin Obstet Gynecol,2006,49(1):85-92.

[4]馬水英,李梅,李城,等.體外受精周期中不同原核數(shù)發(fā)育囊胚使用價(jià)值的探討[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2014,23(6):452-454.

[5]戴善軍.體外受精-胚胎移植周期中胚胎染色體非整倍體分析及移植價(jià)值探討[D].鄭州:鄭州大學(xué),2007:26.

（李科 編輯）

R711.6

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.031

1005-8982（2017）09-0141-02

2016-09-29

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（No：2015BS0802）；內(nèi)蒙古教育廳基金（No：NJZY16118）；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)科技百萬(wàn)工程（No：YKD2014KJ BW007、YKD2015KJBW023）

陳秀娟，E-mail：90098687@sina.com