吳曉冬，薄立華，王小昆，朱 輝

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學(xué)研究中心，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130021)

大鼠MK-shRNA腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

吳曉冬1，薄立華1，王小昆1，朱 輝2*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學(xué)研究中心，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130021)

Midkine(MK)基因是在1988年日本學(xué)者Kadomatsu[1]等發(fā)現(xiàn)的一種cDNA 克隆。其表達(dá)產(chǎn)物在胚胎發(fā)育早期至中期時(shí)在多種組織中表達(dá)，但隨著胚胎的發(fā)育而逐漸減少，在成體鼠只有腎臟和子宮兩個(gè)臟器有表達(dá)。因?yàn)槟芘c肝素結(jié)合并相互作用，又被稱為肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子。MK在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育生長(zhǎng)中有諸多功能[2]，本課題組也已經(jīng)證明在腦缺血的急性期其表達(dá)增高[3]，近年也相繼報(bào)道MK在多種腫瘤組織中有高表達(dá)[4]。

RNA干擾(RNA interference RNAi)[5]技術(shù)可高效、特異地阻斷靶基因的表達(dá)。另外腺病毒載體導(dǎo)入效率高，靶細(xì)胞種類多，突變的可能性低，安全性相對(duì)較好。目前還未見(jiàn)有關(guān)在大鼠腦缺血中RNA干擾MK表達(dá)的研究，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)大鼠MK基因mRNA序列選取兩條靶序列，合成MK-shRNA，并且構(gòu)建了腺病毒載體pAd-MK-shRNA，為進(jìn)一步建立下調(diào)MK基因表達(dá)的動(dòng)物模型及其MK功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

MK基因寡核苷酸序列由genepharma公司合成;腺病毒載體ADV1購(gòu)于genepharma;T4 DNA連接酶、EcoRI 和BamHI內(nèi)切酶、瓊脂糖回收試劑盒等分生試劑均購(gòu)自Promega公司。

1.2 方法1.2.1 針對(duì)靶序列，設(shè)計(jì)合成寡核苷酸對(duì) 從Genebank大鼠MK基因mRNA序列中挑選出兩條符合要求的靶序列(位置分別在242和312處)，MK1-Rat-242:GCAAATACAAGTTTGAGAGCT、MK2-Rat-312:GAAGAAGGCTCGGTACAATGC、同時(shí)設(shè)定對(duì)照ADV1-NC：TTCTCCGAACGTGTCACGT。分別對(duì)每條靶序列設(shè)計(jì)出莖環(huán)結(jié)構(gòu)樣的正義鏈與反義鏈:MK-shRNA-242的正義鏈:5′-AATTCGCAAATACAAGTTTGAGAGCTTTCAAGAGAAGCTCT-AAACTTGTATTTGCTTTTTTG-3′;反義鏈-5′-GATCCAAAAAAGCAAATACAAGTTTGAGA-GCTTCTCTTGAAAGCTCTCAAACTTGTATT-TGCG-3′；MK-shRNA-312正義鏈：5′- AATTCGAAGAAGGCTCGGTACAATGCTTCAAGAG-AGCATTGTACCGAGCCTTCTTCTTTTTTG-3′和反義鏈 5′- GATCCAAAAAAGAAGAAGGCTCGGTACAATGCTCTCTTGAAGCATTGT-ACCGAGCCTTCTTCG-3′。其中在正義鏈的5’端添加EcoRI 酶切位點(diǎn)AATTC；在反義鏈的 5’端添加內(nèi)切酶 BamHI 酶切位點(diǎn)GATCC。最終MK-shRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)為正義鏈: 5′-AATTC-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(N18C)-TTTTTTG- 3′；反義鏈: 3′-G(CN18)-(AAGTTCTCT)-(N18G)-AAAAAACCTAG-5′。

分別將合成的兩對(duì)MK-shRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的正義鏈和反義鏈用 TE(pH8.0)溶解，濃度為 100 μM。形成雙鏈反應(yīng)體系：10×緩沖液 5 μl；MK-shRNA正義鏈(100 μM) 5 μl；MK-shRNA反義鏈(100 μM) 5 μl；ddH2O 35 μl 共50 μl反應(yīng)體系。設(shè)定溫度95℃ 5 min; 85℃ 5 min; 75℃ 5 min; 70℃ 5 min;最后4℃。將所得到的MK-shRNA-242和MK-shRNA-312的雙鏈模板溶液稀釋至終濃度為200 nM，用于與線性載體連接。

1.2.2 載體的酶切、純化回收 取 10 μg ADV1 載體，用EcoRI 和BamHI進(jìn)行37℃ 酶切過(guò)夜，1%瓊脂糖電泳，回收純化線性載體ADV1，稀釋濃度至 50 ng/μl。

1.2.3 pAd-MK-shRNA 載體的構(gòu)建 雙鏈MK-shRNA-242和 MK-shRNA-312分別與ADV1載體連接，構(gòu)建載體pAd-MK-shRNA242和pAd-MK-shRNA312：10×T4連接緩沖液 2 μl；酶切回收的線性載體ADV1(50 ng/μl) 1 μl；雙鏈MK-shRNA 模板( 100 nM) 1 μl；T4 DNA連接酶( 5 U/μl) 1 μl；ddH2O 15 μl，共20 ul體系。22℃ 1 h，分別轉(zhuǎn)化制備的Top10感受態(tài)細(xì)胞。37℃培養(yǎng)16 h。

1.2.4 大鼠pAd-MK-shRNA表達(dá)載體篩選和鑒定 從每塊平板上挑取5個(gè)菌落，接種到含 50 μg/ml Ampicillin 的LB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng) 16 h。用質(zhì)粒抽提試劑盒取一部分質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 載體ADV1酶切 用內(nèi)切酶EcoRI 和BamHI對(duì)載體ADV1進(jìn)行酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳，得到線性化的載體片段，見(jiàn)圖1。

2.2 DNA測(cè)序

對(duì)構(gòu)建的兩個(gè)大鼠MK-shRNA表達(dá)載體pAd-MK-shRNA242和 pAd-MK-shRNA312，分別進(jìn)行測(cè)序，序列與所設(shè)計(jì)的序列完全一致，證實(shí)MK正確插入ADV1載體中，見(jiàn)圖2。

圖1 EcoRI 和BamHI 雙酶切ADV1載體

pAd-MK-shRNA242：

pAd-MK-shRNA312

圖2 載體pAd-MK-shRNA的DNA測(cè)序結(jié)果

3 討論

Midkine(MK)和Pleiotrophin(PTN)是一類肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族僅有的兩個(gè)成員。它們?cè)谂咛グl(fā)育和腫瘤發(fā)生中具有重要作用。MK是分泌型蛋白，富含堿性氨基酸殘基，含有10個(gè)半胱氨酸，組成5對(duì)二硫鍵。MK在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育生長(zhǎng)中有諸多功能，如：促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)存活、促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，能顯著提高中腦的多巴胺性的神經(jīng)元生存能力等。MK還是與多種細(xì)胞分化、增殖、修復(fù)及血管生成有關(guān)的生長(zhǎng)因子[2]。另外MK現(xiàn)已研究證實(shí)其在許多腫瘤中也都有表達(dá)的改變[4]，諸如結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌等等。

RNA干擾(RNA interference，RNAi )[5]是一種新興的高效特異的基因阻斷技術(shù)，其機(jī)制是雙鏈RNA介導(dǎo)的同源信使RNA(mRNA)序列高效特異性降解的現(xiàn)象，從而特異地抑制靶基因的表達(dá)，同時(shí)不影響其他基因功能。Elbashir等[6]證實(shí)導(dǎo)入長(zhǎng)度為21-25nt 的雙鏈小分子RNA恰好能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)特異地抑制靶基因表達(dá)，故而利用短發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)，成為人工誘導(dǎo)RNAi基因沉默的一種常用方法。shRNA是由單個(gè)轉(zhuǎn)錄單位產(chǎn)生，通常不激活動(dòng)物細(xì)胞的干擾素應(yīng)答毒性，shRNA結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，使用更有優(yōu)勢(shì)。人工合成shRNA治療一直被認(rèn)為是一種很有前途的方法，所以該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于探索基因功能和惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。

腺病毒載體除了有轉(zhuǎn)染效率高、副作用少等優(yōu)點(diǎn)外，其缺點(diǎn)主要是在體內(nèi)可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)剛好是一個(gè)免疫獲免區(qū)，且腺病毒表達(dá)持續(xù)時(shí)間較短，屬于瞬間表達(dá)，故其在腦缺血急性期的基因治療中將會(huì)更有發(fā)展?jié)摿?。而且，分析缺血半暗帶腦血流后發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)染后腦血流閾值可達(dá)到靜息狀態(tài)下的40%，提示對(duì)缺血半暗帶進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染治療腦梗塞可行。將腺病毒載體注射到側(cè)腦室，側(cè)腦室壁細(xì)胞可以長(zhǎng)期表達(dá)轉(zhuǎn)染基因。如在側(cè)腦室進(jìn)行白介素1受體拮抗劑基因轉(zhuǎn)染，可減小腦梗塞面積[7]。因此，可以通過(guò)抗炎細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的基因轉(zhuǎn)染來(lái)治療腦缺血。Ronit[8]在大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAo)造成局灶性缺血90 min后，皮質(zhì)注射攜帶對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用的膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)的腺病毒載體，證明了可以減少大腦皮質(zhì)的梗死體積。

我們對(duì)Midkine已經(jīng)進(jìn)行了多年的研究，構(gòu)建了Midkine的原核表達(dá)載體[9]，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到了純化的Midkine蛋白質(zhì)，并且進(jìn)行了Midkine在局灶性腦缺血中的表達(dá)研究，結(jié)果在正常大鼠腦組織中沒(méi)有Midkine的表達(dá)，只是在胎鼠腦組織中有強(qiáng)表達(dá)，在局灶性腦缺血后1天即有Midkine的表達(dá)，14天無(wú)Midkine表達(dá)[3]，我們的研究結(jié)果表明Midkine是一種即時(shí)表達(dá)因子，參與腦缺血急性期的修復(fù)。由此考慮Midkine是一種可用于腦缺血治療的因子。本次我們?cè)O(shè)計(jì)了兩條干擾序列，合成構(gòu)建了兩條大鼠MK-shRNA腺病毒表達(dá)載體：pAd-MK-shRNA242和pAd-MK-shRNA312，通過(guò)測(cè)序證明構(gòu)建成功，腺病毒載體中加載了GFP和Amp基因，更有利于篩選驗(yàn)證，為后續(xù)應(yīng)用到大鼠MCAO模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，為深入研究MK基因的功能和作用機(jī)制打下了良好的基礎(chǔ)。

[1]Kadomatsu K,Tomomura M， Muramatsu T，et al.cDNA Cloning and sequencing of a new gene intensely expressed in early differentiation stages of embryonal carcinoma cells and in mid-gestation period of mouse embryogenesis[J].Biochem Biophys Res Commun,1988，151:1312.

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吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20120704)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0904-03

2016-10-17)