魏 巍，韓嘉鈺，余夢瑤，許曉燕，江 南，賀黎銘，李 芳，羅 霞

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院菌類藥材研究所，四川 成都 610041）

靈芝藥效成分形成的規(guī)律研究*

魏 巍，韓嘉鈺，余夢瑤，許曉燕，江 南，賀黎銘，李 芳，羅 霞**

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院菌類藥材研究所，四川 成都 610041）

研究袋料栽培靈芝主要的藥用成分靈芝多糖和三萜在不同生長時間和子實(shí)體部位的分布規(guī)律。將靈芝整個出芝過程分為5個時期，將子實(shí)體分為3個部分，采用硫酸－蒽酮法測定多糖含量，采用香草醛－高氯酸法測定三萜和甾醇含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈芝多糖含量隨子實(shí)體發(fā)育逐漸降低，在空間上無分布規(guī)律；靈芝三萜和甾醇含量隨子實(shí)體發(fā)育逐漸增加，并在邊緣含量分布最高。靈芝多糖和三萜含量隨子實(shí)體發(fā)育有規(guī)律變化，靈芝三萜在子實(shí)體不同部位分布規(guī)律。

靈芝；多糖；三萜；形成規(guī)律

靈芝（Ganoderma lucidum）是我國傳統(tǒng)中藥材，2010年收錄于《中華人民共和國藥典》。靈芝隸屬于真菌界，因此又有學(xué)者將這類中藥稱為“菌物藥”[1]或“菌類藥材”。它們的生理和代謝與植物藥和動物藥差異較大，但是對于這方面的研究較少，特別是藥效成分的形成規(guī)律方面尚無研究報道。

我國靈芝的成功栽培[2]最早始于20世紀(jì)50年代，近20年人工栽培才逐漸發(fā)展起來，對于栽培方面的研究起步較晚，目前大部分研究集中在栽培方式和栽培技術(shù)，對其采收過程的質(zhì)量控制報道較少。在各地實(shí)際生產(chǎn)過程中靈芝采收和加工也有不同的方式和標(biāo)準(zhǔn)[3－5]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對靈芝藥效成分形成規(guī)律的研究，為靈芝的采收和加工標(biāo)準(zhǔn)的制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，這將有利于靈芝栽培過程控制，提升藥材品質(zhì)，最終為市場提供優(yōu)質(zhì)的原料。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

靈芝ZL13（Ganoderma lucidum），由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院菌類藥材研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

木屑、棉籽殼、玉米芯、麥麩、石灰和石膏購自農(nóng)資市場；葡萄糖、蒽酮、濃硫酸、香草醛、齊墩果酸、無水乙醇、NaHCO3、冰醋酸和氯仿，均為分析純。

1.3 供試培養(yǎng)基

1.3.1 母種培養(yǎng)基配制

土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.3.2 栽培種培養(yǎng)基

麥粒99%、石膏1%，pH自然，含水量60%。

1.3.3 栽培培養(yǎng)基

木屑15%、棉籽殼60%、玉米芯15%、麥麩8%、石灰1%、石膏1%，pH5～6，含水量60%左右。將木屑、麥麩、棉籽殼、石灰和石膏混合均勻，摻入預(yù)濕24 h的玉米芯中拌勻。選用17 cm×33 cm× 0.05 cm的聚丙烯袋，每袋裝濕料1 kg，121℃高壓滅菌2.5 h，冷卻至室溫后每袋接入10 g左右小麥粒原種。

1.4 培養(yǎng)條件和栽培方法

菌絲生長階段的培養(yǎng)條件為25℃，避光，濕度50%～60%；出芝階段培養(yǎng)條件為光照300 lx，濕度85%～90%，日間溫度25℃，夜間溫度22℃。所有催蕾及出芝均在人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行。

1.5 采樣方法

時間分布規(guī)律的采樣方法：將靈芝整個出芝期分為5個時期（表1），每個時期5個重復(fù)。

空間分布規(guī)律的采樣方法：將開片期、成熟期、衰老期靈芝子實(shí)體從邊緣向內(nèi)分為3個部分，分別命名為部位1、部位2和部位3，見圖1。

表1 靈芝分期標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Growing periods of Ganoderma lucidum

圖1 靈芝部位劃分Fig.1 Parts division of Ganoderma lucidum

1.6 成分測定方法

1.6.1 多糖含量測定

以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，采用硫酸-蒽酮法測定[6]。

1.6.2 三萜及甾醇含量測定

以齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)，采用香草醛-高氯酸法測定[6]。

2 結(jié)果

圖2 靈芝多糖的時間變化規(guī)律Fig.2 Time distribution regularity of Ganoderma lucidum polysaccharide

2.1 靈芝多糖的時間分布規(guī)律

靈芝多糖的時間分布規(guī)律見圖2。

靈芝多糖含量整體隨靈芝子實(shí)體發(fā)育逐漸降低。靈芝原基期多糖含量最高，達(dá)到1.9%，靈芝開片期和成熟期多糖含量趨于穩(wěn)定，含量在1.1%～1.16%，但是靈芝衰老期多糖含量較之前明顯降低，僅為0.72%。

2.2 靈芝多糖的空間分布規(guī)律

靈芝多糖的空間分布規(guī)律見圖3。

圖3 靈芝多糖的空間分布規(guī)律Fig.3 Space distribution rule of Ganoderma lucidum polysaccharide

靈芝多糖含量在不同部位的子實(shí)體中沒有顯著差異，空間分布沒有明顯的規(guī)律。

2.3 三萜和甾醇的時間分布規(guī)律

靈芝三萜和甾醇的時間分布規(guī)律見圖4。

圖4 靈芝三萜及甾醇的時間變化規(guī)律Fig.4 Time distribution rule of Ganoderma lucidum triterpenes and sterol

靈芝三萜和甾醇含量整體隨靈芝子實(shí)體發(fā)育逐漸增加。靈芝原基期三萜和甾醇含量最低為1.16%，衰老期含量達(dá)到最高1.68%。三萜和甾醇含量到成熟期后增加趨勢減緩。

2.4 三萜及甾醇的時間分布規(guī)律

靈芝三萜和甾醇的空間分布規(guī)律見圖5。

靈芝三萜和甾醇含量在開片期和成熟期的靈芝子實(shí)體中有著明顯的分布規(guī)律。這兩個時期三萜和甾醇含量在子實(shí)體邊緣含量最高，子實(shí)體內(nèi)部含量最低。但是到了衰老期這種分布規(guī)律消失，各部位三萜和甾醇含量趨于一致。

圖5 靈芝三萜和甾醇的空間分布規(guī)律Fig.5 Space distribution rule of Ganoderma lucidum triterpenes and sterol

3 討論

靈芝多糖的合成代謝途徑目前尚不清楚，但前體合成途徑基本相同，均以葡萄糖作為底物[7]。靈芝隨其子實(shí)體發(fā)育和生殖將會消耗大量的能量，將通過分解糖類物質(zhì)獲得能量，因此觀察到多糖含量隨子實(shí)體發(fā)育而降低，特別是在靈芝孢子粉彈射后多糖含量呈現(xiàn)明顯的降低。但是多糖在子實(shí)體空間分布上沒有找到明顯的分布規(guī)律，可能原因是多糖這類物質(zhì)水溶性好因此在細(xì)胞間的流動性較高。

從時間分布來看，靈芝三萜含量隨子實(shí)體發(fā)育而增加，其變化規(guī)律與付立忠等[8]和寶萍萍等[9]的研究結(jié)果相似，但在衰老期未發(fā)現(xiàn)三萜和甾醇含量明顯降低，這可能與該靈芝品種和栽培條件有關(guān)，在本研究的條件下靈芝未大量彈射孢子，因此此類成分的流失較少。從空間分布來看，靈芝三萜在生長旺盛的子實(shí)體邊緣中含量最高，生長停止的部位三萜和甾醇含量較低，推測靈芝三萜和甾醇的主要形成部位是在生長過程中細(xì)胞分裂旺盛的部位。

本研究也存在一定不足。靈芝三萜單體化合物，是經(jīng)過甲羥戊酸途徑（MVA）合成其基本前體物，再通過不同的氧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)等修飾作用形成最終不同種類的靈芝三萜。在該過程中，會形成半萜、二萜、羊毛甾醇、固醇類的中間體。實(shí)驗(yàn)所采用的香草醛－高氯酸比色法顯色廣譜性較高，三萜合成的中間體也能被顯色。若要真實(shí)反映三萜類活性成分的形成規(guī)律，還需要采用HPLC或生物活性評價等方法進(jìn)行深入研究。

[1]莊毅.菌物藥的躍起與冠名 [C]//中國菌物學(xué)會第四屆會員代表大會暨全國第七屆菌物學(xué)學(xué)術(shù)討論會論文集.中國菌物學(xué)會、湖北省科學(xué)技術(shù)廳、湖北省科學(xué)技術(shù)協(xié)會，2008：9.

[2]金鑫，劉宗敏，黃羽佳，等.我國靈芝栽培現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].食藥用菌，2016（1）：33-37.

[3]梁晉誼，成傳榮，許克勇，等.靈芝的工廠化栽培技術(shù)[J].食用菌，2015（3）：30-31.

[4]胡美靜，王兆富，林惠昆，等.溫室栽培段木靈芝、采收與干制關(guān)鍵技術(shù)[J].中國食用菌，2012（3）：58-59.

[5]張彩峽，白瑪次吉，索朗央宗，等.拉薩地區(qū)靈芝高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2015（1）：117-118.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版第一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：189.

[7]劉高強(qiáng)，趙艷，王曉玲，等.靈芝多糖的生物合成和發(fā)酵調(diào)控[J].菌物學(xué)報，2011（2）：198-205.

[8]付立忠，吳學(xué)謙，李明礙，等.靈芝不同生長發(fā)育期粗多糖和三萜含量變化規(guī)律[J].食用菌學(xué)報，2008，15（3）：47-50.

[9]寶萍萍，圖力古爾，包海鷹.栽培靈芝不同生長階段多糖和三萜類化合物的含量測定[J].菌物研究，2011（2）：110-113.

[10]陳慧，楊海龍，劉高強(qiáng).靈芝三萜的生物合成和發(fā)酵調(diào)控[J].菌物學(xué)報，2015，34（1）：1-9.

Effective Components Form Regularity of Ganoderma lucidum

WEI Wei,HAN Jia-yu,YU Meng-yao,XU Xiao-yan,JIANG Nan,HE Li-ming,LI Fang,LUO Xia
(Sichuan Academy of Chinese Medicine Science,Fungal Medicine Institute,Chengdu 610041,China)

The polysaccharides and triterpenes content of Ganoderma lucidum in different growth period and different parts of fruiting body were studied.The growth period of G.lucidum was divided into 5 stages,and the fruiting body carved into 3 parts.Polysaccharides was measured by sulfuric anthrone reaction,triterpenes and sterol were measured by vanillin－HClO4color reaction.The results showed that the polysaccharides decreased gradually during the development of growth period,no spatial distribution regularity.Triterpenes and sterol were increased gradually during the development of growth period,and highest content was in the marginal region of fruiting body.The polysaccharides and triterpenes content of G.lucidum in different growth period exhibited regular changes,and triterpenes distribution in different parts of fruiting body exhibited regularity.

Ganoderma lucidum;polysaccharides;triterpenes;form regularity

S646.9

A

1003-8310（2017）03-0057-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2017.03.014

四川省公益性科研院所基本業(yè)務(wù)專項（2016ysky0072）；四川省農(nóng)業(yè)微生物資源共享平臺建設(shè)（2017TJP0001）；四川省中管局項目（2016Q005）；四川省科技廳菌類藥材整合式全產(chǎn)業(yè)鏈創(chuàng)新研發(fā)服務(wù)示范（2016GFW0186）；四川食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊項目（川農(nóng)業(yè)[2009]156號）；中央本級重大增減支項目（2060302）；四川省十三五中藥材育種攻關(guān)項目（2016NY20036）。

魏?。?982－），男，博士，副研究員，主要從事菌類藥材研究與開發(fā)研究。E－mail:20188546＠qq.com

**通信作者：羅霞（1974－），女，博士，研究員，主要從事菌類藥材研究與開發(fā)研究。E－mail:lx1443_cn＠sina.com

2017－03－15