魏海龍，胡傳久，程俊文，賀 亮，錢 華，李海波，王衍彬，鄒景泉，蔣云鶴

（浙江省林業(yè)科學(xué)研究院浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023）

牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中安卓奎諾爾的超聲提取工藝*

魏海龍，胡傳久**，程俊文，賀 亮，錢 華，李海波，王衍彬，鄒景泉，蔣云鶴

（浙江省林業(yè)科學(xué)研究院浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023）

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box－Benhnken組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化牛樟芝（Antrodia camphorata）固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的發(fā)酵工藝條件。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，牛樟芝中安卓奎諾爾最佳提取條件為：提取溫度26.48℃，料液比1∶25.3，超聲時(shí)間27.95 min。此條件下的驗(yàn)證試驗(yàn)表明，安卓奎諾爾的產(chǎn)量為283.24 mg·kg－1，與理論值基本吻合。

牛樟芝；安卓奎諾爾；提取工藝

牛樟芝（Antrodia camphorate） 為中國(guó)臺(tái)灣道地藥材，又名樟芝、樟菇、牛樟菇、紅樟芝、血靈芝，屬于真菌界（Fungi） 擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）同擔(dān)子菌綱（Homobasidiomycetes）無(wú)褶菌目（Aphyllophorales）多孔菌科（Polyporaceae） 薄孔菌屬（Antrodia）[1]。牛樟芝生長(zhǎng)于我國(guó)臺(tái)灣省深山特有的“國(guó)寶”級(jí)樹種（百年以上）牛樟樹上，且生長(zhǎng)極為緩慢，形成子實(shí)體的時(shí)間相當(dāng)長(zhǎng)[2]。牛樟芝在民間應(yīng)用歷史已有200年，臺(tái)灣原住民認(rèn)為牛樟芝具有解酒、解食物中毒、止腹瀉和止吐作用，可以治療肝臟病變以及緩解體力透支癥狀[3]。由于牛樟芝功效顯著、產(chǎn)量小且價(jià)格昂貴，被譽(yù)為“森林中的紅寶石”?，F(xiàn)代藥理研究表明，牛樟芝子實(shí)體含有較多的生理活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降膽固醇、抑制血小板凝集等生理活性，自1990年開始逐漸成為臺(tái)灣研究最熱門的抗癌藥物和保健品之一。

2007年，Lee等[4]采用正己烷萃取樟芝產(chǎn)物，得到1個(gè)新化合物安卓奎諾爾 (antroquinonol），屬于泛醌類化合物。2012年，Lin等[5]研究發(fā)現(xiàn)Antrodin C能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。2009年，Phuong等[6]的研究表明活性物質(zhì) Antrodin A～E具有良好的保肝活性。

響應(yīng)曲面法 （response surface methodology，RSM）是1種優(yōu)化生物過程的統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用該法可建立連續(xù)變量曲面模型，對(duì)影響生物過程的因子及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定最佳水平范圍，而且所需要的試驗(yàn)組數(shù)相對(duì)較少，可節(jié)省人力物力，因此該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于各種的生物過程優(yōu)化中[7-9]。本實(shí)驗(yàn)以安卓奎諾爾為目標(biāo)產(chǎn)物，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，為以后的提取放大實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)

1 材料和方法

1.1 供試菌株

牛樟芝（Antrodia camphorate），由浙江省林業(yè)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面菌種PDA培養(yǎng)基

用于活化菌種。

1.2.2 液體搖瓶培養(yǎng)基

KH2PO41 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、馬鈴薯100 g·L-1、葡萄糖15 g·L-1、酵母粉5 g·L-1。

1.2.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基

KH2PO41 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、葡萄糖15 g·L-1、玉米粒100 g·L-1、麩皮300 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上，從母種試管中取出蠶豆大小的菌絲塊接種于斜面培養(yǎng)基的中部，在26℃培養(yǎng)5 d。

1.3.2 液體搖瓶種子培養(yǎng)

將已經(jīng)活化的菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種于液體搖瓶培養(yǎng)基中，500 mL三角瓶裝培養(yǎng)基150 mL，于26℃，120 r·min-1培養(yǎng)6 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、料液比、超聲時(shí)間3個(gè)因素所確定的水平范圍，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，利用Design Expert 8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。自變量的試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子和水平表Tab.1 Factors and levels of RSM analysis

1.5 分析方法

1.5.1 生物量的測(cè)定

將培養(yǎng)好的菌絲體真空冷凍干燥至恒重，電子天平稱重。

1.5.2 安卓奎諾爾的分析檢測(cè)方法

采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定牛樟芝產(chǎn)品中安卓奎諾爾產(chǎn)量。取樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末5 g，加入無(wú)水乙醇90 mL，在30℃的DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽內(nèi)振蕩提取45 min，靜置后0.22 μm微膜過濾，進(jìn)行HPLC分析，具體分析條件參照文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面分析方案和結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)試驗(yàn)用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。以安卓奎諾爾產(chǎn)量為響應(yīng)值，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型建立和方差分析

利用Design Expert 8.05軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[11]，獲得安卓奎諾爾產(chǎn)量對(duì)提取溫度、料液比和超聲時(shí)間的多元二次回歸方程：安卓奎諾爾含量(mg·kg-1)=283.12-25.38X1+4.71+13.94X2-17.81X3+ 14.21X1X2-6.81X1X3+6.10X2X3-13.82X1X1-9.54X2X2-28.96X3X3?；貧w模型方差分析見表3。

由表3方差分析可知，以安卓奎諾爾產(chǎn)量為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程的回歸效果達(dá)到極顯著水平，P值均＜0.0001；模型的決定系數(shù)R2=0.9490，說明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好；校正決定系數(shù)AdjR2=0.9038，說明該模型能解釋90.38%響應(yīng)值的變化；模型的失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率，表3中模型失擬項(xiàng)的P值為0.1875，大于0.05，表明模型的失擬項(xiàng)不顯著；根據(jù)表3的顯著性分析結(jié)果，各因素的一次項(xiàng)、X1X1、X3X3以及X1X2的交互項(xiàng)對(duì)安卓奎諾爾的提取均具有顯著影響（P＜0.05）；綜合以上表明這個(gè)模型建立的回歸方程能運(yùn)用于牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾條件優(yōu)化的理論預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experiment design and results of RSM

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis variance on regression model

2.2.3 響應(yīng)面圖形分析

分別將模型中的提取溫度、料液比和超聲時(shí)間的其中1個(gè)因素固定在0水平，得到另外2個(gè)因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖1～圖3。各個(gè)因素及其相互間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果通過圖1～圖3可以直觀地反映出來。極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處。

由圖1～圖3可以看出，影響牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾最顯著的因素為超提取溫度（X1），表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大。其次為超聲時(shí)間（X3）和料液比（X2）。此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖1～圖3可以看出，X1與X2交互作用顯著。

圖1 提取溫度和料液比交互影響安卓奎諾爾產(chǎn)量的曲面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour for antroquinonol as a function of extraction temperature and solid-liquid ratio

圖2 提取溫度和超聲時(shí)間交互影響安卓奎諾爾產(chǎn)量的曲面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour for antroquinonol as a function of extraction temperature and ultrasonic time

圖3 料液比和超聲時(shí)間交互影響安卓奎諾爾產(chǎn)量的曲面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour for antroquinonol as a function of solid-liquid ratio and ultrasonic time

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過SAS軟件對(duì)上述方程進(jìn)行求解，得到最佳提取條件為：提取溫度26.48℃，料液比1∶25.3，超聲時(shí)間27.95 min，安卓奎諾爾提取產(chǎn)量理論值可達(dá)295.97 mg·kg-1。

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)值與實(shí)際實(shí)驗(yàn)值之間的相關(guān)性，即檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，對(duì)牛樟芝在預(yù)測(cè)的最優(yōu)發(fā)酵條件下安卓奎諾爾產(chǎn)量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)中提取溫度、料液比和超聲時(shí)間的優(yōu)化值分別為 26.48℃、1:25.3、27.95 min，3組平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得安卓奎諾爾產(chǎn)量分別為289.86 mg·kg-1、280.53 mg·kg-1、279.34 mg·kg-1，實(shí)際安卓奎諾爾產(chǎn)量平均值為283.24 mg·kg-1，達(dá)到了回歸模型預(yù)測(cè)理論值的95.7%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)牛樟芝安卓奎諾爾產(chǎn)量。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中產(chǎn)安卓奎諾爾的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，選擇提取溫度、料液比、超聲時(shí)間為3個(gè)主要參數(shù)，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和三因素三水平的響應(yīng)面分析，通過二次多項(xiàng)回歸模型進(jìn)行方差分析和回歸擬合，預(yù)測(cè)了牛樟芝中安卓奎諾爾最佳提取條件為：提取溫度26.48℃，料液比1:25.3，超聲時(shí)間27.95 min，安卓奎諾爾產(chǎn)量理論值可達(dá)295.97 mg·kg-1。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中安卓奎諾爾產(chǎn)量283.24 mg·kg-1，與預(yù)測(cè)值十分接近，證明了該實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性。

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Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction Process of Antroquinonol from Antrodia camphorata Solid-state Fermentation Products

WEI Hai-long,HU Chuan-jiu,CHENG Jun-wen,HE Liang,QIAN Hua, LI Hai-bo,WANG Yan-bin,ZOU Jing-quan,JIANG Yun-he
(Zhejiang Forestry Academy,Zhejiang Province Key Laboratory of Forest Food,Hangzhou 310023,China)

Based on the results of single factor analysis method,a Box－Behnken factorial design of three level was employed combining with response surface methodology(RSM)to optimize the extraction process conditions of Antrodia camphorate for producing antroquinonol.The optimal extraction conditions were determined as follows:extraction temperature 26.48℃,solid liquid ratio 1:25.3,ultrasonic time 27.95 min.Verification test demonstrated that the average yield of antroquinonol was 283.24 mg·kg－1,similar to theoretical value of 295.97 mg·kg－1.

Antrodia camphorate;antroquinonol;extraction process

S646.9

A

1003-8310（2017）03-0060-05

10.13629/j.cnki.53－1054.2017.03.015

浙江省科技廳公益技術(shù)研究項(xiàng)目（2013C32095）；浙江省食用菌新品種選育項(xiàng)目（2016C02057－8）。

魏海龍（1974－），男，碩士，副研究員，主要從事食用藥用菌栽培方面研究。E－mail:whlwlp＠163.com

**通信作者：胡傳久（1982－），男，碩士，副研究員，主要從事食用藥用菌培育與加工方面研究。E－mail:huchuanjiu＠163.com

2017－03－15