摘要 [目的]探究歐李引種成都后其生長(zhǎng)期多酚含量的變化，為歐李多酚類物質(zhì)的研究提供參考。 [方法]采用酒石酸鐵比色法測(cè)定歐李引種成都后的多酚含量。 [結(jié)果]用95%甲醇提取歐李多酚效果最好，歐李體內(nèi)的多酚含量并不會(huì)在植物體內(nèi)大量積累，多酚含量在12∶00左右溫度較高和傍晚時(shí)出現(xiàn)較大值，在14∶00溫度最高時(shí)較低，在19 ℃左右時(shí)也較低，當(dāng)有蟲(chóng)害脅迫時(shí)歐李體內(nèi)多酚含量增加。 [結(jié)論]多酚對(duì)于植物的次生代謝有重要影響，在鮮葉中的含量可以反映植物次生代謝的強(qiáng)度，并反映植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性以及對(duì)各種環(huán)境脅迫的抵抗力。

關(guān)鍵詞歐李；多酚；酒石酸鐵比色法；次級(jí)代謝

中圖分類號(hào)S662.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）11-0011-04

Abstract[Objective] To explore changes of polyphenol content of Prunus humilis Bunge introduced in Chengdu during growing period and provide theoretical basis for researching polyphenol content of Prunus humilis Bunge. [Method] We determined the polyphenol content of Prunus humilis Bunge introduced in Chengdu during growing period by tartaric acid iron assay. [Result] The polyphenol of Prunus humilis Bunge extracted by using 95% methanol was the best， and the content of polyphenol of Prunus humilis Bunge would not accumulate internally in plants. The content of polyphenol reached higher in around 12∶00 and when the temperature was higher in the evening， it would be the minimum at 14∶00 when the temperature was the lowest， and the content was also very low in about 19 ℃；the content of polyphenol would increase under herbivore stress. [Conclusion] Polyphenol has important effect on metabolism of plant. The content of its fresh leaves of plants can reflect the intensity of secondary metabolism， the reaction of plant adaptation to the environment， and resistance to various environmental stresses.

Key wordsPrunus humilis Bunge；Polyphenol；Tartaric acid iron assay；Secondary metabolism

多酚是泛指一類性質(zhì)不同的多羥基酚（以鄰位和連位為主），包括兒茶素類、黃酮及黃酮類化合物、花色素類、酚酸、縮酚酸類多酚化合物的復(fù)合體。多酚具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，廣泛存在于各種植物體內(nèi)[1-2]。多酚中的C3部分具有高度的還原特性，所以具有很強(qiáng)的抗氧化能力，多酚具有抗氧化、清除自由基、降血壓、降血脂、預(yù)防心血管病、抗突變、抗輻射、抑菌、抗癌等功能，并且毒副作用小[3-7]。因此，多酚應(yīng)用前景非常廣闊，能用于食品、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域。

歐李引種到成都后[8]，各種性狀特性可能發(fā)生變化。次級(jí)代謝產(chǎn)物區(qū)別于初生代謝產(chǎn)物有很大不同，初生代謝產(chǎn)物是通過(guò)代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的自身生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)，如多糖、脂類、氨基酸、核苷酸、維生素等[9]。生物通過(guò)初級(jí)代謝，能使各種營(yíng)養(yǎng)物轉(zhuǎn)化為自身的結(jié)構(gòu)物質(zhì)、具有生理活性物質(zhì)或者為生長(zhǎng)提供所需能量，所以初生代謝產(chǎn)物通常都是機(jī)體生存必不可少的物質(zhì)，這些物質(zhì)的合成過(guò)程中某個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，輕則可能引起生物生長(zhǎng)停止，重則可能導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生突變或者死亡，是一種基本代謝類型。而植物次生代謝產(chǎn)物是植物對(duì)環(huán)境的一種適應(yīng)產(chǎn)物，在進(jìn)化過(guò)程中植物與生物和非生物因素長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果。植物次生代謝產(chǎn)物在對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)、植物間相互競(jìng)爭(zhēng)、植物抵抗病蟲(chóng)危害中起到重要作用[10]。多酚作為植物重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，歐李引種成都后，環(huán)境的改變可能會(huì)改變歐李的生理過(guò)程，能反映歐李對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)性，對(duì)于歐李引種研究有重要意義。同時(shí)多酚物質(zhì)本身具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值，通過(guò)研究歐李體內(nèi)多酚的含量，研究其是否具有潛在開(kāi)發(fā)提取價(jià)值也有重要意義。筆者研究了歐李引種成都后，其生長(zhǎng)期多酚含量的變化，以期為歐李引種研究和多酚的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。供試植物材料為2008年秋季山西引種到成都的歐李，試驗(yàn)前1年的3月移栽至花盆中，正常管理。

1.1.2主要試劑與儀器。磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、酒石酸鈉鉀、甲醇、乙醇、丙酮、焦性沒(méi)食子酸等均由四川成都科龍化工試劑廠提供，均為分析純。電子天平為上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；7200可見(jiàn)光分光光度計(jì)為尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋為常州澳華儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1試劑的配制。

1.2.1.1磷酸緩沖液的配制。 用電子天平稱取71.628 g磷酸氫二鈉溶于500 mL燒杯中，用玻璃杯攪拌溶解，然后倒入1 L容量瓶中定容，配制成0.2 mol/L磷酸氫二鈉母液，再用電子天平稱量31.202 g磷酸二氫鈉溶于500 mL燒杯中，用玻璃杯攪拌溶解，倒入1 L容量瓶中定容，配制成0.2 mol/L磷酸二氫鈉母液。分別配制pH 6.8和7.5的緩沖液。pH 68的緩沖液每100 mL加入0.2 mol/L磷酸氫二鈉母液49 mL和0.2 mol/磷酸二氫鈉母液51 mL。pH 7.5的緩沖液每100 mL加入0.2 mol/L磷酸氫二鈉母液84 mL和0.2 mol/L磷酸二氫鈉母液16 mL[11]。上述溶液均存儲(chǔ)于棕色瓶中。

1.2.1.2酒石酸鐵溶液的配制。用電子天平稱量1 g硫酸亞鐵和5 g酒石酸鈉鉀分別溶解于蒸餾水中，混合后定容至1 L，并儲(chǔ)存于棕色瓶中，可穩(wěn)定10 d[12-13]。

1.2.2提取液的選擇。取歐李植株新鮮葉片，在電子天平上準(zhǔn)確稱重，用自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水沖洗干凈，用不銹鋼剪刀快速剪成碎片，置于帶塞三角瓶中，分別加入95%甲醇、95%乙醇、無(wú)水丙酮試劑5 mL，于微沸水中浸提30 min，冷卻至室溫，取1 mL樣品上清液，加入1 mL蒸餾水、2 mL酒石酸鐵溶液和6 mL磷酸緩沖液，混合，以試劑作為空白對(duì)照，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度。

1.2.3緩沖液的選擇。不同pH對(duì)多酚含量的測(cè)定有一定的影響，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3-6，12-15]，有選擇pH 6.8的磷酸緩沖液，也有選擇pH 7.5的磷酸緩沖液。為了確定哪一種緩沖液更合適，加樣方法如“1.2.2”，提取試劑為甲醇，分別對(duì)pH 6.8和pH 7.5的磷酸緩沖液測(cè)定光密度。

1.2.4歐李樣品多酚含量的測(cè)定。采用酒石酸鐵法[12]。取新鮮歐李葉片，用電子天平稱重，用自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水沖洗干凈，吸去表面水分后用不銹鋼剪刀剪成碎片，置于帶塞三角瓶中，加入5 mL 95%甲醇，置于恒溫水浴鍋中在68 ℃微沸狀態(tài)中提取33 min，冷卻至室溫。用移液槍吸取上清液1 mL加入試管中，再分別加入1 mL蒸餾水、2 mL酒石酸鐵和6 mL pH 7.5的磷酸緩沖液，在分光光度計(jì)上測(cè)定光密度。

1.2.5線性關(guān)系的考察。標(biāo)準(zhǔn)品用焦性沒(méi)食子酸代替多酚標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得多酚含量以沒(méi)食子酸計(jì)。稱量焦性沒(méi)食子酸1 g溶于50 mL蒸餾水中，配制成母液，依次取5、10、15、20、25、30 μL分別加入試管中，向試管中分別加入1 995、1 990、1 885、1 880、1 875、1 870 μL蒸餾水，再依次加入2 mL酒石酸鐵和6 mL pH 7.5的磷酸緩沖液，然后立即在7200型可見(jiàn)光分光光度計(jì)上測(cè)定光密度。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以焦性沒(méi)食子酸為多酚標(biāo)準(zhǔn)品，求得多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.508 9x+0.023 7，回歸系數(shù)為R2=0.996 7，線性關(guān)系良好（圖1）。

2.2提取液的選擇取歐李植株中部的新鮮完整葉片，分別用95%甲醇、95%乙醇和無(wú)水丙酮提取歐李葉片中的多酚，用焦性沒(méi)食子酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.508 9x+0.023 7，將測(cè)得的光密度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得多酚含量。因?yàn)闃悠诽崛∫簽? mL，而測(cè)定時(shí)取樣體積為1 mL，所以樣品中的總多酚含量為X=5（Y-0.023 7）/1.508 9，多酚含量占?xì)W李取葉重的百分比為η=X/Z。式中， X為樣品多酚含量；Y為吸光度；Z為取樣總重。

結(jié)果表明，用95%甲醇提取歐李葉片中的多酚效果最好，多酚含量為0.802 5%，明顯高于95%乙醇和無(wú)水丙酮提?。ū?）。因此，選擇95%甲醇作為提取液。

2.3緩沖液的選擇分別取A、B、C、D 4株歐李植株中部的新鮮完整葉片，緩沖液選擇方法同“1.2.2”，用求得的總多酚除以4株植株的總質(zhì)量Z，求歐李葉片多酚含量百分比。

由表2可知，pH 7.5的磷酸緩沖液對(duì)歐李多酚含量的測(cè)定效果更好，顯色反應(yīng)更加明顯，所以選擇pH 7.5的磷酸緩沖液作為歐李葉片多酚提取的緩沖液。

2.4歐李葉片樣品多酚含量

2.4.1歐李葉片總多酚含量（以沒(méi)食子酸計(jì)）的測(cè)定。 歐李葉片多酚的提取和測(cè)定方法同“1.2.2”和“1.2.4”。歐李總多酚在歐李葉片中的百分比為η1=X1/Z1，其中X1為測(cè)得的多酚含量總和；Z1為取樣葉片總重。由該公式求得歐李植株中新鮮葉片多酚含量（以沒(méi)食子酸計(jì)）為0.770 16%。

2.4.24株歐李植株中多酚含量的測(cè)定。分別將A、B、C、D 4株歐李新鮮葉片的多酚含量相加，除以從A、B、C、D 4株歐李所取葉片總重，測(cè)多酚在A、B、C、D 4株植株中的百分比。計(jì)算公式為：η=（X/Z）×100%。式中，η為多酚含量百分比；X為多酚總重；Z分別為A、B、C、D 4株植株葉片的重量和。經(jīng)計(jì)算，A、B、C、D 4株歐李植株中多酚含量（以沒(méi)食子酸計(jì)）分別為0.794 61%、0.768 75%、0.805 65%和0655 41%?？梢?jiàn)，各植株的多酚含量各不相同，但相差不大。

45卷11期王智君引種成都后歐李生長(zhǎng)期多酚含量的變化2.4.3歐李多酚含量的日變化。以A、B、C、D 4株歐李植株多酚含量總重占鮮葉的百分比（測(cè)定方法同“1.2.2”和“1.2.4”）隨時(shí)間變化，觀察1 d內(nèi)歐李植物體內(nèi)多酚含量的變化情況。

由圖2可知，歐李葉片中的多酚含量會(huì)在一天（白晝）之中隨著時(shí)間的變化而發(fā)生變化。多酚含量從上午開(kāi)始隨著時(shí)間的變化而開(kāi)始增加，到12∶00左右達(dá)到較大值，然后隨著時(shí)間的推移而逐漸呈下降趨勢(shì)，14∶00左右達(dá)到最小值，隨后又逐漸增加。

2.4.4歐李生長(zhǎng)期葉片多酚含量的變化。取歐李植株中部的新鮮完整葉片，每天每次試驗(yàn)共有A、B、C、D 4個(gè)平行植株，每天第1次取材在09∶30左右，取每天第1次取材時(shí)A、B、C、D 4株歐李植株多酚的平均含量（方法同“1.2.2”和“1.2.4”）。觀察多酚在歐李生長(zhǎng)期體內(nèi)的變化情況。

由圖3可知，多酚作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，并不會(huì)隨著歐李生長(zhǎng)期的進(jìn)行在體內(nèi)積累，但其含量會(huì)發(fā)生變化，歐李新鮮葉片中的多酚含量在0.77%左右。

2.4.5氣溫對(duì)歐李多酚含量的影響。統(tǒng)計(jì)得出每次取樣時(shí)A、B、C、D 4株歐李的平均多酚含量隨氣溫的變化情況（方法同“1.2.2”和“1.2.4”），相同溫度求所有植株平均值（以溫度升序排列）。

由圖4可知，多酚含量會(huì)隨著氣溫的變化而發(fā)生變化。在低溫或者高溫狀態(tài)下歐李植物體內(nèi)多酚含量低，在19 ℃左右時(shí)多酚含量也很低，而在13和24 ℃左右多酚含量較高。

3結(jié)論與討論

3.1提取液的確定用酒石酸鐵比色法提取多酚時(shí)，磷酸緩沖液的選擇有不同配比，大部分研究選擇pH 7.5的磷酸緩沖液，也有選擇pH 6.8的磷酸緩沖液。該研究發(fā)現(xiàn)，用pH 7.5的緩沖液對(duì)歐李葉片多酚測(cè)定效果較好。選擇提取試劑時(shí)，有選擇50%丙酮的，也有選擇80%乙醇溶液的，還有選擇60%乙醇溶液的，但大多數(shù)多酚研究都是對(duì)茶葉多酚的研究。該研究發(fā)現(xiàn)，用95%甲醇提取歐李葉片多酚效果更好。因此，采用酒石酸鐵比色法測(cè)定歐李中多酚含量，用95%甲醇提取，并用pH 7.5的磷酸緩沖液效果最好。

3.2多酚測(cè)定過(guò)程中的注意事項(xiàng)在試驗(yàn)過(guò)程中偶然發(fā)現(xiàn)4月16日和4月21日2個(gè)異常點(diǎn)。在測(cè)光密度時(shí)發(fā)現(xiàn)測(cè)出的光密度很大，求得的多酚含量很高，明顯大于平均值0.770 16%（圖5）。觀察樣品液發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生了大量淡綠色絮狀沉淀。

4月16日產(chǎn)生大量的淡綠色絮狀沉淀，后經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證分析，產(chǎn)生的絮狀沉淀為高溫狀態(tài)下生成。驗(yàn)證方法是加入1 mL甲醇、2 mL酒石酸鐵和6 mL磷酸緩沖液，置于高溫狀態(tài)下觀察發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生極少量白色絮狀物，為了確定沉淀是由甲醇還是提取液產(chǎn)生的，將歐李葉片多酚提取液由甲醇換為丙酮提取，將丙酮樣品提取液取樣1 mL，加入2 mL酒石酸鐵，6 mL磷酸緩沖液，置于高溫狀態(tài)下馬上產(chǎn)生大量淡綠色絮狀沉淀，所以確定引起大量沉淀物質(zhì)應(yīng)該為從歐李葉片提取液中的1種物質(zhì)。4月21日發(fā)現(xiàn)光密度增加明顯，逐漸產(chǎn)生淡綠色絮狀沉淀。后經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，是由于長(zhǎng)時(shí)間放置產(chǎn)生的。因此，在提取后測(cè)光密度時(shí)要特別注意對(duì)提取液降溫至常溫，然后加入酒石酸鐵和磷酸緩沖液后馬上測(cè)光密度，否則將會(huì)產(chǎn)生淡綠色絮狀沉淀，使光密度增加，導(dǎo)致測(cè)得多酚含量增加。但是對(duì)于引起產(chǎn)生淡綠色絮狀沉淀的物質(zhì)尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

3.3關(guān)于多酚次生代謝的環(huán)境因素初生代謝與次生代謝一樣是植物體內(nèi)重要的生理代謝，而次生代謝物質(zhì)在協(xié)調(diào)與環(huán)境的關(guān)系中有重要作用。對(duì)多數(shù)植物而言，次生代謝產(chǎn)物的合成與積累往往根據(jù)環(huán)境的變化而發(fā)生變化。根據(jù)環(huán)境變化來(lái)決定合成次生代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量，在特定的環(huán)境下合成特定的次生代謝產(chǎn)物，或者顯著增加特定的次生代謝產(chǎn)物。而幾種環(huán)境因子可能影響1種次生代謝產(chǎn)物，1種環(huán)境因子也可影響幾種次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，相同環(huán)境因子對(duì)不同植物的同一次生代謝產(chǎn)物影響效果也不一定相同[16-17]。目前，人們環(huán)境條件對(duì)植株體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物形成和積累誘導(dǎo)作用的生理機(jī)制存在不同的認(rèn)識(shí)，提出了不同的誘導(dǎo)機(jī)制假說(shuō)來(lái)解釋不同環(huán)境條件下植物次生代謝的變化，主要的誘導(dǎo)機(jī)制假說(shuō)有碳素/營(yíng)養(yǎng)平衡（CNB）假說(shuō)、生長(zhǎng)/分化平衡（GDB）假說(shuō)、最佳防御（OD）假說(shuō)和資源獲得（RA）假說(shuō)等。這些假說(shuō)揭示或解釋了不同環(huán)境條件下植株體內(nèi)合成和積累規(guī)律，但都認(rèn)為環(huán)境脅迫時(shí)，次生代謝產(chǎn)物數(shù)量增加[16-17]。蘇文華等[10]研究認(rèn)為在環(huán)境脅迫的條件下，植株生長(zhǎng)下降，次生代謝產(chǎn)物數(shù)量增加，而在良好環(huán)境條件下，植株生長(zhǎng)快，次生代謝產(chǎn)物數(shù)量少，但當(dāng)環(huán)境嚴(yán)重脅迫時(shí)，植株生長(zhǎng)和次生代謝又都受阻礙。光照、溫度、水分、礦物質(zhì)、CO2、蟲(chóng)害等環(huán)境因素是影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要原因。黃璐琦等[9]研究認(rèn)為植物在受蟲(chóng)害損傷后，在次生代謝方面最明顯的變化是酚類化合物含量的增加，在遮陰條件下，光合作用降低，體內(nèi)C/N比降低，酚類、萜烯類物質(zhì)減少。

該研究發(fā)現(xiàn)，歐李引種到成都后，歐李植物體內(nèi)的多酚含量并不會(huì)發(fā)生明顯變化，但可能會(huì)隨季節(jié)發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)歐李葉片中的多酚會(huì)在一天（白晝）之中隨著時(shí)間的變化而發(fā)生變化，從上午開(kāi)始隨著時(shí)間的變化而開(kāi)始增加，到12∶00左右達(dá)到較大值，然后隨時(shí)間的推移而呈下降趨勢(shì)，14∶00左右達(dá)到最小值，隨后又開(kāi)始增加。通過(guò)氣溫對(duì)歐李體內(nèi)多酚的影響的研究發(fā)現(xiàn)，歐李體內(nèi)多酚隨溫度也會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)綜合溫度和日變化情況發(fā)現(xiàn)，歐李葉片中的多酚含量變化可能和溫度有很大關(guān)系。分析溫度和日變化情況，歐李的次級(jí)代謝產(chǎn)物多酚可能在高溫和低溫情況下都很低，在19 ℃左右時(shí)較低，而在13 ℃和較高溫度時(shí)多酚含量較高，這與黃璐琦等[9]的研究結(jié)果相符合，植物在良好環(huán)境條件（19 ℃左右）下體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物多酚含量少，在環(huán)境脅迫下（13 ℃和較高溫度）植物體內(nèi)多酚含量較多，環(huán)境嚴(yán)重脅迫時(shí)（清晨和14∶00左右地表溫度很高）次生代謝產(chǎn)物多酚含量很低。歐李植株通過(guò)體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的變化以加強(qiáng)對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)，所以提取多酚的最佳時(shí)間應(yīng)該在12∶00左右和傍晚環(huán)境脅迫時(shí)，此時(shí)多酚在歐李體內(nèi)積累較多。另外，在觀察4株歐李形態(tài)后發(fā)現(xiàn)，C植株有蟲(chóng)害情況，且其多酚含量也較高，這恰好與蟲(chóng)害脅迫次級(jí)代謝產(chǎn)物增加相符合。

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