郭文玉 彭長(zhǎng)農(nóng) 柯曉 鄒春霞 王小慶

【摘要】目的探討大鼠心肌梗死后合并冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙出現(xiàn)心室重構(gòu)與心功能變化的關(guān)系及可能的機(jī)制。方法使用月桂酸鈉構(gòu)建冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙模型，行前降支血管結(jié)扎建立心肌梗死模型，40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，分別為假手術(shù)組（Sham組）、心肌梗死組（MI組）、微循環(huán)障礙組（CMD組）、心肌梗死+微循環(huán)障礙組（MI+CMD組），4周后行UCG測(cè)量左室收縮末徑（LVESD）及舒張末徑（LVEDD）、LVEF，取心肌組織行組織病理學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)染色（免疫組化），并采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與Sham組大鼠比較，其余3組的LVEDD和LVESD均升高，LVEF下降（P均<0.05），MI+CMD組改變最為明顯。病理組織學(xué)及免疫組化均提示與MI組或CMD組比較，MI+CMD組心肌纖維化程度及膠原表達(dá)水平最高；在蛋白表達(dá)方面，與Sham組相比，其余3組大鼠心肌Bax蛋白表達(dá)水平增加，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），其中MI+CMD組Bax蛋白表達(dá)水平最高，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平最低。結(jié)論微循環(huán)障礙可影響心肌梗死后左心室重構(gòu)，其加重左心室重構(gòu)可能的機(jī)制包括誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡、加重心肌膠原沉積以及促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙；細(xì)胞凋亡；心室重構(gòu)；Bax；Bcl-2

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship and potential mechanism between ventricular remodeling and cardiac function variation after myocardial infarction complicated with coronary microcirculation dysfunction in rat models. MethodsThe rat models with coronary microcirculation dysfunction were established by sodium laurate. The myocardial infarction models were established by the ligation of descending anterior branch vessels. Forty SD rats were randomly divided into four groups including the sham surgery group （Sham）， myocardial infarction group （MI）， coronary microcirculation dysfunction group （CMD） and myocardial infarction+coronary microcirculation dysfunction group （MI+CMD）. At postoperative 4 weeks， the left ventricular end-systolic diameter （LVESD）， the left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD） and the left ventricular ejection fraction （LVEF） were quantitatively measured by echocardiogram. The myocardial tissues were subject to histopathological examination， immunohistological staining and detection of Bax and Bcl-2 proteins by western blot. ResultsCompared with the Sham group， the LVEDD and LVESD in the other three groups were significantly elevated， whereas the LVEF tended to decrease， especially the MI+CMD group （all P<0.05）. Histopathological and immunohistochemical staining prompted that compared with the MI or CMD group， the severity of myocardial fibrosis and the expression level of collagen in the MI+CMD group were the most significantly up-regulated. Compared with the Sham group， the expression levels of the Bax protein were significantly up-regulated， whereas the expression levels of Bcl-2 protein were dramatically down-regulated in the other three groups （all P<0.05）. The highest expression of Bax protein and the lowest expression of Bcl-2 protein were detected in the MI+CMD group. ConclusionsCoronary microcirculation dysfunction exerts a regulatory effect on the left ventricular remodeling after myocardial infarction. The underlying mechanisms probably include induction of myocardial cell apoptosis， aggravating collagen deposition and promoting the progression of myocardial fibrosis.

【Key words】Coronary microcirculation dysfunction； Apoptosis； Ventricular remodeling； Bax； Bcl-2

心肌梗死是威脅人類(lèi)健康的重大疾病之一，心肌梗死后的心力衰竭和心臟破裂是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┲滤馈⒅職埖闹匾騕1]。目前，AMI的再灌注治療已使冠心病患者預(yù)后獲得了極大的改善[2]。然而臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，即使心外膜冠狀動(dòng)脈再通，仍有相當(dāng)一部分患者出現(xiàn)心臟進(jìn)行性擴(kuò)大、心功能惡化，這與心肌微血管損傷和微循環(huán)灌注障礙密切相關(guān)，提示冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙（CMD）可能參與心室重構(gòu)，影響心功能。本研究中使用月桂酸鈉構(gòu)建CMD模型，探討大鼠心肌梗死后合并CMD與心室重構(gòu)及心功能變化的關(guān)系，以及可能的相關(guān)分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量220～260 g，由中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物中心提供。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置全程依照中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理學(xué)要求，在SPF級(jí)動(dòng)物房完成。

二、 試劑及儀器

月桂酸鈉購(gòu)自廣州艾斯金科技有限公司，3%戊巴比妥鈉、安定注射液、生理鹽水購(gòu)自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，兔抗大鼠Bax、Bcl-2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，兔抗大鼠CD31、Collagen I多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；小動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自美國(guó)Harvard Aparatus公司，小動(dòng)物手術(shù)器械購(gòu)自上海器械集團(tuán)有限公司。

三、 實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物分組

將40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：假手術(shù)組（Sham組）、心肌梗死組（MI組）、微循環(huán)障礙組（CMD組）、心肌梗死+微循環(huán)障礙組（MI+CMD組）。Sham組僅行假手術(shù)，不建立模型；MI組僅行前降支血管結(jié)扎建立心肌梗死模型；CMD組僅通過(guò)月桂酸鈉誘導(dǎo)大鼠冠狀動(dòng)脈微血栓形成模型；MI+CMD組先建立心肌梗死模型后，再誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈微血栓形成模型。

2.模型制備

4組大鼠均予腹腔麻醉后行氣管插管，插管成功后實(shí)施開(kāi)胸手術(shù)：①M(fèi)I組在顯微鏡直視下以5-0手術(shù)縫線(xiàn)行前降支近段結(jié)扎的方法建立大鼠AMI模型，觀察到左心室前壁運(yùn)動(dòng)減弱及顏色變白，判斷為建模成功；②Sham組手術(shù)絲線(xiàn)僅穿過(guò)左冠前降支主干而不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，其余操作同MI組；③CMD組通過(guò)主動(dòng)脈根部注射月桂酸鈉制作微循環(huán)障礙模型，開(kāi)胸后分離大鼠主動(dòng)脈，并用血管夾夾閉主動(dòng)脈后，迅速以微量注射器從主動(dòng)脈根部直接注入0.3 ml（1 g/L）月桂酸鈉，之后松開(kāi)血管夾恢復(fù)供血；④MI+CMD組先予主動(dòng)脈根部注射月桂酸鈉，再行前降支近段結(jié)扎。4組術(shù)畢均予胸腔內(nèi)注入少量甲硝唑預(yù)防感染及減輕胸腔內(nèi)粘連。術(shù)后4組大鼠均予室內(nèi)飼養(yǎng)、規(guī)律照明、自由進(jìn)食及飲水，繼續(xù)飼養(yǎng)4周。造模過(guò)程中如出現(xiàn)死亡大鼠以前述方法補(bǔ)充。

3.UCG檢測(cè)

飼養(yǎng)4周后，再次使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，通過(guò)UCG行心臟超聲檢查，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括：①左心室舒張末期容積（LVEDD）與左心室收縮末期容積（LVESD）；②運(yùn)用單平面Simpson法，超聲診斷儀自動(dòng)得出LVEF與短軸縮短率（LVFS）。

4.組織病理學(xué)檢查

超聲檢查后，予戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉處死各組大鼠，取出心臟，用4%多聚甲醛浸泡固定、石蠟包埋、切片。行蘇木素-伊紅染色、Masson染色，顯微鏡下觀察心肌纖維病理形態(tài)學(xué)變化，統(tǒng)計(jì)正常形態(tài)心肌細(xì)胞面積比、膠原纖維染色陽(yáng)性面積比。

5.免疫組化

取4組大鼠左心室心肌組織，常規(guī)4%多聚甲醛固定后，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸抗原修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷，順序加入一抗、二抗，二氨聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。采用Leica顯微鏡采集圖像，鏡下200倍觀察，采集10個(gè)視野，并使用NIS-Element 3.0軟件進(jìn)行圖像分析，統(tǒng)計(jì)各組的毛細(xì)血管密度（CD31陽(yáng)性面積）及膠原表達(dá)量（CollagenⅠ陽(yáng)性面積）。

6.Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

取各組新鮮大鼠左心室心肌組織，提取蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）比色法進(jìn)行蛋白定量；配置10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，蛋白樣品100℃煮沸，等量蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上，予Bax 、Bcl-2一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗孵育，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光后掃描，用Image J圖像分析軟件對(duì)曝光后的蛋白條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的灰度值作為對(duì)照，計(jì)算Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果

一、 4組大鼠的UCG指標(biāo)比較

與Sham組大鼠比較，MI組大鼠的LVEDD和LVESD均升高，而LVEF下降（P均<0.05），提示心力衰竭模型構(gòu)建成功。與Sham組相比，CMD組的LVEDD與LVESD也有所升高，EF值下降（P均<0.05），而MI+CMD組較MI組或CMD組，LVEDD與LVESD均進(jìn)一步升高，EF及FS呈進(jìn)行性下降（P均<0.05），見(jiàn)表1。

二、 4組大鼠的心肌組織病理學(xué)形態(tài)比較

1. 蘇木素-伊紅染色結(jié)果

光鏡下，Sham組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞外間質(zhì)較少，顯示正常的心肌細(xì)胞形態(tài)。MI組及CMD組與Sham組相比，心肌纖維排列明顯紊亂，心肌細(xì)胞間隙增寬，間質(zhì)可見(jiàn)纖維化；而MI+CMD組與MI組比較，心肌纖維更加紊亂，間質(zhì)纖維化程度更加嚴(yán)重。定量分析顯示，MI組、CMD、MI+CMD組正常形態(tài)心肌細(xì)胞面積比均低于Sham組，其中MI+CMD組的正常形態(tài)心肌細(xì)胞面積比最低（P均<0.05），見(jiàn)圖1。

2.Masson染色結(jié)果

Masson 染色正常的心肌組織被染成紅色，膠原纖維被染成藍(lán)色。Sham組膠原纖維較少，而MI組、CMD、MI+CMD組心肌藍(lán)染的膠原纖維較Sham組表達(dá)量明顯增多，其中MI+CMD組膠原纖維程度最高（P均<0.05），見(jiàn)圖2。

三、4組大鼠心肌組織CD31和Collagen I免疫組化表達(dá)結(jié)果比較

與Sham組相比，MI組、CMD組、MI+CMD組心肌組織中Collagen I陽(yáng)性面積比升高（P均<0.05），而MI+CMD組中Collagen I陽(yáng)性面積比最高，見(jiàn)圖3。與Collagen I陽(yáng)性面積比相反，與Sham組相比，其余3組的CD31陽(yáng)性面積比明顯降低，而MI+CMD組的CD31陽(yáng)性面積比最低（P均<0.05），見(jiàn)圖4。

5討論

現(xiàn)有研究顯示，部分MI患者即使經(jīng)過(guò)完全血運(yùn)重建治療，仍然有反復(fù)心絞痛發(fā)生，最主要的原因可能是冠狀動(dòng)脈微循環(huán)發(fā)生障礙，導(dǎo)致心肌細(xì)胞水平的灌注不充分，繼而出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，影響預(yù)后[3]。這揭示探討CMD與心肌梗死后不良心室重構(gòu)之間的病理生理機(jī)制，對(duì)制定冠心病的治療策略有重要意義。

冠狀動(dòng)脈微循環(huán)系統(tǒng)不僅是心肌組織細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)交換的部位，同時(shí)也負(fù)責(zé)心肌細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)及代謝產(chǎn)物清除。近年研究發(fā)現(xiàn)，CMD可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的缺血、壞死及梗死面積增加、心功能下降[4]。隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到導(dǎo)致心功能下降的基本機(jī)制就是心室重構(gòu)。研究表明，心肌梗死后心室重構(gòu)的程度依賴(lài)于心肌缺血程度或心肌梗死面積和修復(fù)治療[5-7]。前者提示冠狀動(dòng)脈微循環(huán)損傷程度越重或心肌梗死面積越大對(duì)心臟結(jié)構(gòu)、功能的損害越明顯，后者提示心肌梗死后多種機(jī)制或因素參與了心室重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展[8]。心室重構(gòu)包括心肌實(shí)質(zhì)重構(gòu)和心肌間質(zhì)重構(gòu)，后者主要指的是破壞了心肌間質(zhì)纖維膠原的合成以及降解之間的動(dòng)態(tài)平衡[9]。心室重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要機(jī)制包括細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白的異常增多和過(guò)度沉積、心肌細(xì)胞的凋亡、相關(guān)基因表達(dá)異常等。本研究中，與Sham組相比，其余3組發(fā)生了LVEDD擴(kuò)大，LVEF下降的變化；而MI+CMD組與MI組或CMD組相比，表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的左心室重構(gòu)及LVEF的下降，提示微循環(huán)障礙對(duì)于左心室重構(gòu)起促進(jìn)作用。研究表明，越多的心肌細(xì)胞凋亡，必將導(dǎo)致越多的膠原沉積以填充缺失的心肌細(xì)胞[10]。Bcl-2基因?yàn)檎{(diào)亡抑制基因，Bax基因?yàn)榇俚蛲龌颉１狙芯匡@示，MI+CMD組顯示出更高的Bax蛋白表達(dá)水平，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平最低，提示合并微循環(huán)障礙可比單純前降支結(jié)扎導(dǎo)致更多的心肌細(xì)胞凋亡。

另有研究顯示，心肌梗死發(fā)生后大量的心肌細(xì)胞由于缺血、缺氧而發(fā)生壞死、凋亡，心肌細(xì)胞的增殖能力弱，從而激活增殖成纖維細(xì)胞，分泌大量膠原等細(xì)胞外基質(zhì)填充缺失的心肌細(xì)胞[11]。CD31是最常用的評(píng)估組織血管新生的標(biāo)志物。多項(xiàng)研究顯示，AMI后新生血管的增多可以減少及防止對(duì)心臟的二次損害，給即將缺氧的單核細(xì)胞提供更充分的血供，并縮短促炎反應(yīng)以及減輕不良的重構(gòu)[12-13]。本研究的免疫組化結(jié)果顯示，與Sham組比較，其余3組梗死心肌區(qū)域均出現(xiàn)CD31陽(yáng)性面積比減少，Collagen I陽(yáng)性面積比增多，而MI+CMD組的CD31陽(yáng)性面積比減少更加明顯，蘇木素-伊紅染色和Masson染色也同樣提示MI+CMD組心肌纖維化程度尤為嚴(yán)重，說(shuō)明在心肌梗死過(guò)程中，微循環(huán)障礙加重了心肌纖維化的進(jìn)程，從而導(dǎo)致了心室重構(gòu)的演變以及心功能的惡化。

綜上所述，本研究明確了微循環(huán)障礙對(duì)心肌梗死后左心室重構(gòu)的調(diào)控作用，其加重左心室重構(gòu)可能的機(jī)制包括誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡，加重心肌膠原沉積，促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)展。對(duì)于心肌梗死患者，如何保護(hù)其微循環(huán)障礙可能與單純開(kāi)通心外膜血管同樣重要。

參考文獻(xiàn)

[1]Windecker S， Bax JJ， Myat A， Stone GW， Marber MS. Future treatment strategies in ST-segment elevation myocardial infarction. Lancet， 2013，82（9892）：6144-6157.

[2]Heusch G， Libby P， Gersh B， Yellon D， Bhm M， Lopaschuk G， Opie L. Cardiovascular remodelling in coronary artery disease and heart failure.Lancet，2014，383（9932）：1933-1943.

[3]Sun D， Huang J， Zhang Z， Gao H， Li J， Shen M， Cao F， Wang H.Luteolin limits infarct size and improves cardiac function after myocardium ischemia/reperfusion injury in diabetic rats.PLoS One，2012，7（3）：e33491.

[4]Hamirani YS， Wong A， Kramer CM， Salerno M.Effect of microvascular obstruction and intramyocardial hemorrhage by CMR on LV remodeling and outcomes after myocardial infarction： a systematic review and meta-analysis.JACC Cardiovasc Imaging，2014，7（9）：940-952.

[5]Shinde AV， Frangogiannis NG.Fibroblasts in myocardial infarction： a role in inflammation and repair.J Mol Cell Cardiol，2014，70：74-82.

[6]Pereira FE， Cronin C， Ghosh M， Zhou SY， Agosto M， Subramani J， Wang R， Shen JB， Schacke W， Liang B， Yang TH， McAulliffe B， Liang BT， Shapiro LH.CD13 is essential for inflammatory trafficking and infarct healing following permanent coronary artery occlusion in mice.Cardiovasc Res，2013，100（1）：74-83.

[7]Chen W， Frangogiannis NG.Fibroblasts in post-infarction inflammation and cardiac repair.Biochim Biophys Acta，2013，1833（4）：945-953.

[8]Frangogiannis NG.The inflammatory response in myocardial injury， repair， and remodelling.Nat Rev Cardiol，2014，11（5）：255-265.

[9]肖月瓊，周萬(wàn)興. 金屬蛋白酶組織抑制因子-1對(duì)心室重構(gòu)影響的研究進(jìn)展. 新醫(yī)學(xué)，2012， 43（7）：515-518.

[10]Zhang J， Li XX， Bian HJ， Liu XB， Ji XP， Zhang Y.Inhibition of the activity of Rho-kinase reduces cardiomyocyte apoptosis in heartischemia/reperfusion via suppressing JNK-mediated AIF translocation.Clin Chim Acta，2009，401（1-2）：76-80.

[11]Frangogiannis NG.The immune system and the remodeling infarcted heart： cell biological insights and therapeuticopportunities.J Cardiovasc Pharmacol，2014，63（3）：185-195.

[12]Seropian IM， Toldo S， Van Tassell BW， Abbate A.Anti-inflammatory strategies for ventricular remodeling following ST-segment elevation acutemyocardial infarction.J Am Coll Cardiol，2014，63（16）：1593-1603.

[13]Frangogiannis NG.Regulation of the inflammatory response in cardiac repair.Circ Res，2012，110（1）：159-173.

（收稿日期：2017-07-28）

（本文編輯：林燕薇）