李曉華 張英才 鄧宜南 楊曉星 張琪 楊揚 周奇

【摘要】目的探討非受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶9（PTPN9）在肝癌中的表達及臨床意義。方法利用蛋白免疫印跡法和實時熒光定量PCR 的方法檢測8例原發(fā)性肝癌組織及癌旁組織中PTPN9的表達情況，另外收集129例肝癌手術(shù)標本的臨床病理資料，利用免疫組織化學(xué)檢測PTPN9在組織中的表達并進行統(tǒng)計分析。結(jié)果肝癌中PTPN9的蛋白及mRNA表達量低于癌旁組織（t=4.833，P<0.01）。臨床資料分析顯示肝臟組織中PTPN9的表達量是肝癌預(yù)后的影響因素，PTPN9的表達越低，患者預(yù)后越差。結(jié)論PTPN9基因在肝癌組織中表達明顯下調(diào)，PTPN9的表達越低，患者預(yù)后越差。

【關(guān)鍵詞】肝癌； 非受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶9

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression level and clinical significance of protein tyrosine phosphatase non-receptor type 9 （PTPN9） in liver cancer. MethodsWestern blot and RT-PCR were adopted to quantitatively measure the expression levels of PTPN9 in the primary liver cancerous and para-cancerous tissues from 8 cases. Clinicopathological data of 129 surgical specimens were collected. Immunohistochemical staining was performed to quantitatively detect and statistically compare the expression levels of PTPN9 between the liver cancerous and para-cancerous tissues. ResultsIn the liver cancerous tissues， the expression levels of PTPN9 protein and mRNA were significantly down-regulated compared with those in the para-cancerous tissues （t=4.833， P<0.01）. Analysis of clinical data revealed that the expression level of PTPN9 in the liver tissues was an independent factor of the clinical prognosis of liver cancer patients. The lower the expression level of PTPN9 was， the worse clinical prognosis was. ConclusionsThe expression level of PTPN9 gene is significantly down-regulated in liver cancerous tissues. The lower the expression of PTPN9 is， the worse the clinical prognosis is.

【Key words】Liver cancer； Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 9

肝細胞癌是原發(fā)性肝癌的主要類型， 是最常見的惡性腫瘤之一， 在全球消化系統(tǒng)腫瘤中，病死率占第三位[1-2]。在我國其病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中排第二位，其發(fā)病率呈上升趨勢，目前，腫瘤切除及肝臟移植是最有效的治療手段，射頻消融及化學(xué)治療等可改善癌癥患者的預(yù)后，盡管這些治療手段可減少患者的病死率，但肝癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)及化學(xué)治療的耐藥仍然是需要迫切解決的問題[3]。研究認為，肝癌的發(fā)生和發(fā)展與信號通路的紊亂有著緊密的聯(lián)系，PTPN9作為蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶（PTP）非受體家族中的重要成員，負向調(diào)控多種生物信號通路， 參與了多種病理生理過程，但其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機制尚待闡明[4-5]。本研究通過免疫組織化學(xué)（組化）檢測PTPN9在組織中的表達，探討其與肝癌預(yù)后的關(guān)系，以期為早期診斷及治療提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

收集南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮原發(fā)性肝癌標本，包括肝癌及其距肝癌1 cm的癌旁肝組織標本，本研究中石蠟病理標本129例肝癌標本臨床資料從中山大學(xué)腫瘤防治中心病理科獲得。隨訪終點為死亡、 失訪或生存至截止日期， 隨訪期間的失訪者算作刪失值。自確診至患者死亡之間的時間定義為總生存時間（OS）。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

二、方法

1.蛋白免疫印跡法

收集蛋白樣品后，在10%～12%的凝膠中制備并分離蛋白質(zhì)樣品。轉(zhuǎn)移到PVDF膜（Millipore， Boston， USA），然后被牛血清白蛋白阻斷。在4℃下，抗體PTPN9（Santa Cruz， USA）和β-actin（Santa Cruz， USA）孵育過夜。用TBST對膜進行清洗，在室溫下用山羊抗兔二次抗體孵育。最后，對膜進行了曝光。

2.實時熒光定量PCR（RT-PCR）

提取肝臟組織RNA，按說明書（南京凱基公司）成份準備RT反應(yīng)液（所有液體配制均應(yīng)在冰上進行），合成cDNA，將得到的cDNA溶液作為模板加入到說明書的PCR反應(yīng)體系中，預(yù)變性：95℃ 30 s。PCR反應(yīng)：（95℃ 5s；60℃ 20 s）×45個循環(huán)。

3.免疫組化及評分

石蠟切片脫蠟置水，3%H2O2，室溫孵育消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，5% 正常山羊血清封閉，室溫孵育 10 min，滴加一抗 4 ℃ 過夜。滴加生物素標記二抗工作液，顯色劑顯色3 min，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。PTPN9蛋白水平檢測采用H-score法。陽性細胞的百分率為“0”（0%）、“1”（1%～25%）、“2”（26%～50%）、“3”（51%～75%）、“4”（76%～100%）。強度評分為“0”（陰性染色）、“1”（弱染色）、“2”（中度染色）和“3”（強染色）。兩名病理學(xué)醫(yī)師在不了解患者的臨床和病理變量的情況下，以雙盲方式獨立地評價了所有的切片。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。配對設(shè)計的定量資料組間比較采用配對t檢驗，組間構(gòu)成比的比較采用Fisher確切概率法。Kaplan-meier法繪制生存曲線并做對比（Log-rank test）。采用Cox比例風(fēng)險回歸模型來確定預(yù)后影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

四、肝癌預(yù)后的多因素分析

PTPN9高表達與PTPN9低表達患者的kaplan meier累積生存曲線顯示，PTPN9表達越低，生存時間越短，見圖4，影響肝癌患者預(yù)后的多因素分析顯示，PTPN9被認為是肝癌患者總體生存率的保護因素（HR= 0.453，95% CI 0.275～0.744，P=0.002），見表2。

討論

近年來，人們越來越多地致力于揭示肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的機制，旨在探索肝癌臨床治療的新策略。

在人類基因組中，PTP家族含有107個成員，PTP在細胞多種功能方面都起著關(guān)鍵的作用，也被認為是新一代的藥物靶點[6-11]。PTP主要通過逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的作用并一起調(diào)控蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化過程，調(diào)控細胞的生長、分化、遷移、存活、凋亡， 許多研究表明，PTP功能的失調(diào)及基因的修飾可導(dǎo)致癌癥及自身免疫性疾病的發(fā)生[12-16]。研究證實，PTPN12的低表達與肝癌的復(fù)發(fā)及預(yù)后成正相關(guān)，降低肝癌細胞中的PTPN11會增加肝癌細胞對順鉑及氟尿嘧啶的耐藥性，而PTPN9作為PTP非受體家族中的一員，位于染色體15q24.2，含有N末端結(jié)構(gòu)域，可特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸調(diào)節(jié)凋亡細胞的吞噬過程，與底物VEGFR2結(jié)合，可負向調(diào)控內(nèi)皮細胞的VEGFR2信號通路[17-20]。在乳腺癌中研究發(fā)現(xiàn)，PTPN9直接作用于底物STAT3和EGFR而抑制其磷酸化，在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中起著重要作用[21-22]。

研究證實STAT3轉(zhuǎn)錄因子參與肝癌的發(fā)展，在肝癌組織中STAT3可持續(xù)性激活，STAT3的缺失可緩解肝癌的生長，其主要作用機制是調(diào)控細胞周期因子的轉(zhuǎn)錄，如細胞周期蛋白D1等[23-24]。而PTPN9作為調(diào)控STAT3的重要基因，其在肝癌中的作用仍然不清楚，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PTPN9在肝癌表達中明顯下調(diào)，有研究證實，多個miRNA 可調(diào)控PTPN9的表達，但其在肝癌中下調(diào)的機制有待于進一步研究[25]。我們進一步通過免疫組化技術(shù)對肝癌組織芯片中129例組織PTPN9的表達情況進行分析，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析顯示肝臟組織中PTPN9的表達量是肝癌的預(yù)后的影響因素，PTPN9的表達越低，患者預(yù)后越差。這可能表明PTPN9在肝癌發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。因此，繼續(xù)深入研究PTPN9在肝癌中的作用機制，探討其作用底物是下一步研究的關(guān)鍵。

由于本研究為回顧性研究，在患者選擇上可能有選擇性偏倚，需要多中心大量標本的長期臨床研究。

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（收稿日期：2017-06-06）

（本文編輯：楊江瑜）