邊子星 顏彩燕 姚肖健 楊福孫

摘 要 華石斛（Dendrobium sinense）為瀕危附生蘭，具有重要的觀賞和藥用價(jià)值。因其種子細(xì)小，僅具未分化的原胚，造成種子難以保存，活力喪失較快。因此，篩選出快速、準(zhǔn)確的種子活力檢測(cè)方法，是蘭科種子有效保存方法探討的重要前提。本試驗(yàn)通過(guò)文獻(xiàn)查詢(xún)篩選后，采用四氮石坐法（TTC）和紫外分光光度計(jì)法（UVS）進(jìn)行研究，通過(guò)測(cè)定染色率以及吸光值來(lái)反映種子活力，比較其檢測(cè)方法的可靠性、準(zhǔn)確性及操作難易度。結(jié)果表明：TTC法測(cè)定保存1～30 d的種子活力比實(shí)際萌發(fā)率高0.60%，變化幅度小，最高僅為0.4%，可信度大，但實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣；UVS法測(cè)定的種子活力比實(shí)際萌發(fā)率高0.04%，但變動(dòng)幅度相對(duì)較大，高達(dá)3.09%，精確度相對(duì)TTC法較低，但實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單。

關(guān)鍵詞 華石斛；種子活力；四氮唑法（TTC）；紫外分光光度計(jì)法（UVS）；吸光度

中圖分類(lèi)號(hào) R282.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Dendrobium sinense is an endangered orchid species， which has an important ornamental and medicinal value. The seed is tiny and with an undifferentiated embryo， which making it difficult to store and loss its vitality rapidly. Therefore screening of a fast， accurate methods for detecting seed viability is an important prerequisite to explore the effective preservation method of orchid seeds. An experiment using 2， 3， 5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）and ultraviolet spectrophotometer（UVS）was studied through determined the staining rate and absorbance. The results show that： In the preservation of 1 d to 30 d， the seed viability determined using TTC had an average germination rate of 0.6% higher than the control， with a change range less than 0.4%， but the operation is complicated. However， the seed viability using UVS had an average germination rate of 0.04% higher than the control， with a large change range as high as 3.09%， but the experimental operation is simple. Conclusion： The method of TTC could accurately measure the seed viability of D. sinense， but time-consuming， and the method of UVS is simple and rapid， while the accuracy was slightly lower than that of TTC.

Key words Dendrobium sinense； seed viability； triphenyltetrazolium chloride（TTC）； ultraviolet spectrophotometer（UVS）； absorbance

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.003

種子質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到種群的發(fā)展，而種子活力又是檢測(cè)種子質(zhì)量的最可靠指標(biāo)之一[1]。自1953年國(guó)際種子協(xié)會(huì)（ISTA）設(shè)立種子活力委員會(huì)以來(lái)，世界各國(guó)都以測(cè)定種子活力來(lái)作為檢測(cè)種子質(zhì)量的主要指標(biāo)之一。中國(guó)鄭光華把種子活力定義為種子的健壯度，包括迅速萌發(fā)的發(fā)芽潛力、生長(zhǎng)潛力及生產(chǎn)潛力[2]，且已被我國(guó)研究者所認(rèn)可。目前種子活力主要采用四氮石坐法（TTC）、紫色分光光度計(jì)法、熒光染色法（FDA）、酸性品紅（Ac）染色法、電導(dǎo)率法（EC）測(cè)定，而蘭科植物種子以四石坐法[3-4]為主。電導(dǎo)率法以測(cè)定種子浸出液中可溶物濃度大小來(lái)反映種子活力強(qiáng)弱，該方法簡(jiǎn)便快捷[5-6]，但水溫、種子質(zhì)量、水質(zhì)等因素的影響較大，且準(zhǔn)確性受到標(biāo)準(zhǔn)參照物的限制，因而誤差較大[7]。酸性品紅測(cè)定種子活力是根據(jù)種子胚細(xì)胞的原生質(zhì)膜是否具有活性而判定種子活力，不易于體積小的種子[8]。熒光染色法利用熒光粉，因其能透過(guò)種皮，測(cè)定出染色種子程度，但以吸水種子且種子保存在62 ℃的條件下效果明顯[9]。Gale和Yamazaki[10]研究臺(tái)灣芋蘭種子發(fā)現(xiàn)，熒光染色法測(cè)定種子活力準(zhǔn)確度比四石坐法更好，而B(niǎo)atty[11]和田偉莉[8]研究澳大利亞地生蘭以及臘梅植物種子得出四石坐法測(cè)定種子活力方法比熒光染色法效果更佳。在實(shí)際生產(chǎn)試驗(yàn)中，因種子種類(lèi)不同，熒光特點(diǎn)就不同，尤其在生活力微弱與生活力喪失的兩類(lèi)種子之間通常由于熒光物質(zhì)在量的差異上不夠明顯，容易造成錯(cuò)誤的判斷。四氮石坐法是國(guó)際種子協(xié)會(huì)公認(rèn)的測(cè)定種子活力的標(biāo)準(zhǔn)方法[12]，紫外分光光度計(jì)法（UVS）是在電導(dǎo)率測(cè)定法的基礎(chǔ)上改進(jìn)的方法，既避免了電導(dǎo)率測(cè)定法的不足且操作簡(jiǎn)便，鄧娜娜[13]和魯黎明[14]研究黑麥種子和煙草種子分別得出，UVS法測(cè)定種子活力方法簡(jiǎn)便快捷，且準(zhǔn)確度較高，基本上不受參照物的限制，能夠在很大程度上反映種子活力。

華石斛（Dendrobium sinense）是海南特有的蘭科植物，具有很高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值，同時(shí)也是我國(guó)最重要的保護(hù)植物[15]。其種子細(xì)小，種子只具有未分化的原胚，種子保存困難，不當(dāng)保存，其種子活力下降較快，因此均不適合采用熒光染色、電導(dǎo)率以及酸性品紅方法測(cè)定其種子活力。本研究通過(guò)采用TTC法和UVS法2種方法測(cè)定華石斛種子活力，以種子組織培養(yǎng)的發(fā)芽率為參照，比較兩種方法測(cè)定結(jié)果，為準(zhǔn)確、迅速地測(cè)定華石斛種子活力提供依據(jù)，促進(jìn)蘭科種子有效保存，為蘭科種子保育及生產(chǎn)服務(wù)，也有助于華石斛后續(xù)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

華石斛種子，于5～7月份采自五指山，海拔1 200～1 400 m，轉(zhuǎn)黃將裂的成熟果莢，于室內(nèi)將成熟果莢置于裝有硅膠的廣口瓶中于4 ℃冰箱中脫水5 d。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 取用5～6顆脫水后的華石斛果莢，取出種子混勻，分裝于4個(gè)5 mL的離心管中，離心管上口塞入脫脂棉，置于4個(gè)裝有50 g硅膠的廣口瓶中，并將廣口瓶分別在4 ℃冰箱中保存1、10、20、30 d。

1.2.2 發(fā)芽率測(cè)定 分別稱(chēng)取約2 mg保存的種子放入5%次氯酸鈉溶液內(nèi)進(jìn)行滅菌30 min，無(wú)菌水清洗3遍后配成種子懸浮液，吸取0.5 mL種子懸浮液播種。播種培養(yǎng)基為MS+10%椰子汁+0.5 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂，置于光照為2 000～3 000 lx，周期為14/10 h/d，溫度為（25±1）℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[16]。每個(gè)處理3次重復(fù)，于播種20 d后每10 d時(shí)鏡檢，以播種50 d計(jì)算種子發(fā)芽率。

1.2.3 TTC法染色率測(cè)定 分別稱(chēng)取約2 mg保存的種子于5%次氯酸鈣浸泡120 min，無(wú)菌水洗3次，蒸餾水浸泡24 h。去掉蒸餾水，換上1% TTC溶液黑暗浸泡24～48 h，無(wú)菌水清洗3次，最后1次留1 mL水制成懸浮液。吸0.1 mL種子懸浮液于載玻片上，在顯微鏡下隨意觀察3個(gè)視野，記錄每個(gè)視野的種子總數(shù)以及胚染成紅色的種子數(shù)，胚染成紅色的為具有活力的種子，計(jì)算染色率[17]，重復(fù)3次。

1.2.4 UVS法吸光值測(cè)定 分別稱(chēng)取約2 mg保存的種子，用超純水清洗3次，然后用超純水浸泡4、8、12、24 h，分別取其浸提液在260 nm的紫外線下進(jìn)行吸光值測(cè)量，每個(gè)處理重復(fù)3次。最后，將吸光值通過(guò)回歸模擬轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的萌發(fā)率[14]。紫外吸光值測(cè)定所用儀器為北京產(chǎn)T600型紫外分光光度計(jì)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Excel軟件及Spss軟件對(duì)種子發(fā)芽率，染色率，吸光值作方差分析以及回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽率

通過(guò)室內(nèi)組織培養(yǎng)萌發(fā)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，保存1～30 d的種子平均萌發(fā)率差異顯著，且隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，其發(fā)芽率逐漸降低。此外，保存1 d和10 d的華石斛種子在萌發(fā)初期就表現(xiàn)出很高的發(fā)芽勢(shì)，且在萌發(fā)40 d左右趨于穩(wěn)定，而保存20 d和30 d的種子萌發(fā)初期的萌發(fā)率較小，在30 d到40 d萌發(fā)較快，與前期相比，發(fā)芽率分別增加了108.2%和129.5%，且萌發(fā)40 d后趨于穩(wěn)定（圖1）。同時(shí)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)3次試驗(yàn)萌發(fā)50 d時(shí)的萌發(fā)率發(fā)現(xiàn)，采用室內(nèi)組織培養(yǎng)萌發(fā)試驗(yàn)測(cè)得的種子活力較穩(wěn)定，3次測(cè)得的種子活力變化幅度較小，且隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而活力降低，表現(xiàn)較強(qiáng)的規(guī)律性（表1）。

2.2 染色率

TTC法測(cè)華石斛種子活力，活力越大，種子染色越深，保存時(shí)間越短的華石斛種子染色越深，表現(xiàn)出較強(qiáng)的活力（圖2）。通過(guò)方差分析得出，保存1～30 d的華石斛種子染色率差異顯著，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，染色率逐漸降低。保存1～10 d的種子染色率較高，顯著高于保存20～30 d的染色率（表2）。且TTC法測(cè)定種子染色率較為穩(wěn)定，染色率變化幅度小，誤差僅在2%以?xún)?nèi)，結(jié)果可靠。通過(guò)與萌發(fā)率對(duì)比發(fā)現(xiàn)，染色率值與萌發(fā)率值接近，活力基本上在同一范圍。

2.3 吸光值

UVS法測(cè)定不同浸泡時(shí)間的華石斛種子活力發(fā)現(xiàn)，在同一保存時(shí)間內(nèi)，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，種子吸光值逐漸增大；同時(shí)在同一浸泡時(shí)間內(nèi)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，種子吸光值也逐漸增大，且不同保存時(shí)間種子吸光值差異顯著（圖3）。從紫外吸光值及變化趨勢(shì)可知，UVS法測(cè)得的吸光值符合不同保存時(shí)間華石斛種子發(fā)芽率的變化規(guī)律，即華石斛種子保存時(shí)間越長(zhǎng)，紫外吸光值越大，發(fā)芽率越低。由此通過(guò)對(duì)吸光值與萌發(fā)率進(jìn)行回歸模擬，將吸光值轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的活力指標(biāo)萌發(fā)率值，得出一個(gè)最佳模擬方程為浸泡4 h的回歸方程：Y=-5.808X+1.160（Y為萌發(fā)率，X為吸光值，R=0.992），即浸泡4 h的華石斛種子紫外吸光值與萌發(fā)率之間具有較高的擬合系數(shù)，為0.992，即通過(guò)此方程將吸光值求算得出的萌發(fā)率值具有很高的可信度。將浸泡4 h的吸光值全部轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的萌發(fā)率值后，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)浸泡4 h的華石斛種子的紫外吸光值轉(zhuǎn)換后的萌發(fā)率值比較穩(wěn)定，變化幅度較小，且保存1～30 d下吸光值相應(yīng)的萌發(fā)率與染色率和發(fā)芽率基本上都在同一活力范圍，也隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，種子活力逐漸降低（表3）。

2.4 TTC法和UVS法測(cè)定種子活力的比較

為了進(jìn)一步分析TTC法和UVS法在活力測(cè)定方面的優(yōu)劣，通過(guò)對(duì)比各試驗(yàn)相應(yīng)的活力指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TTC法測(cè)定保存1～30 d種子活力分別比發(fā)芽率試驗(yàn)高0.67%、0.37%、0.60%和0.77%，平均高0.60%，基本在0.6%左右，波動(dòng)幅度小，誤差小，結(jié)果較為可靠。而UVS法測(cè)定的種子活力比發(fā)芽率試驗(yàn)分別高1.00%、-2.70%、1.35%和0.39%，平均高0.04%，但波動(dòng)幅度較大，誤差達(dá)3.09%，即在測(cè)定不同保存時(shí)間華石斛種子活力中，UVS法比TTC法精確度低。然而，在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間上，TTC法測(cè)定種子活力耗時(shí)52 h以上，步驟繁瑣，UVS法測(cè)定種子活力耗時(shí)只需4.5 h，操作簡(jiǎn)單，在活力要求不嚴(yán)格的情況下，采用UVS法更理想（表4）。

3 討論

大量研究證明，萌發(fā)率及活力指數(shù)等生理指標(biāo)是反映種子萌發(fā)速度、幼苗發(fā)育潛力和植株品質(zhì)，能夠成為判定種子活力高低的可信指標(biāo)[18-19]，萌發(fā)率多作為其他活力測(cè)定方法的參照標(biāo)準(zhǔn)。一般情況下，華石斛種子培養(yǎng)30 d左右才開(kāi)始萌發(fā)，45 d左右時(shí)基本上萌發(fā)完全，在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同保存時(shí)間種子在萌發(fā)40～50 d后其萌發(fā)率基本上保持不變，故取萌發(fā)50 d后的種子萌發(fā)率作為種子活力指標(biāo)，且3次試驗(yàn)萌發(fā)率誤差在4.4%以?xún)?nèi)，具有較高的準(zhǔn)確性。利用發(fā)芽率測(cè)定種子活力準(zhǔn)確性高，但測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)。此外，在本試驗(yàn)中不同保存時(shí)間種子萌發(fā)率差異較大，種子活力喪失較快，說(shuō)明本試驗(yàn)所取種子的保存方法需要進(jìn)一步改進(jìn)，以便能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持其較高活力。

TTC法測(cè)定種子活力的原理是有活性的種胚細(xì)胞具有較高活性的脫氫酶，在呼吸作用過(guò)程中產(chǎn)生還原態(tài)的氫，TTC跨膜進(jìn)入細(xì)胞，接收還原態(tài)的氫并與之反應(yīng)生成穩(wěn)定、紅色的1，3，5-三苯甲酯，種胚變成紅色，紅色越深，種子活力越高，根據(jù)染色的位置和深淺可以確定種子活力水平[4]。所以，TTC法只會(huì)將胚染成紅色，并不會(huì)將胚乳染色，因此更易于觀察胚是否著色。華石斛種子體積小，無(wú)胚乳，只具有胚，采用TTC法較為合適。在本試驗(yàn)中，TTC法測(cè)定的不同保存時(shí)間的華石斛種子活力比實(shí)驗(yàn)室條件下的發(fā)芽率高0.60%，變化幅度較小，誤差小，具有較高的可靠性，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，次氯酸鈣溶度以及處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)種子活力測(cè)定會(huì)產(chǎn)生影響，造成染色率與發(fā)芽率產(chǎn)生誤差，從何明高[17]測(cè)得的五唇蘭結(jié)果也得到印證。通過(guò)鏡檢試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，華石斛種子保存時(shí)間越短，染色越深。本試驗(yàn)染色率統(tǒng)計(jì)按照何明高[17]對(duì)蘭科種子染色計(jì)數(shù)方法，此方法受蘭科種子大小及觀測(cè)視野等影響，統(tǒng)計(jì)的染色率與實(shí)際種子發(fā)芽率間存在誤差。

UVS法測(cè)定種子活力的原理為通過(guò)測(cè)定種子浸提液的紫外吸收值，判定浸提液中氨基酸等有機(jī)物的含量，從而間接地推斷出種子的活力。此方法是最近幾年才用于測(cè)定植物種子活力的，目前在這方面的研究還很少，研究表明，煙草種子[14]浸泡4 h，黑麥種子[13]和杜鵑花屬種子[20]浸泡8 h時(shí)吸光值與發(fā)芽率有較高的相關(guān)性，具準(zhǔn)確性高，結(jié)果穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便快捷。在本試驗(yàn)中，UVS法測(cè)得的種子活力比發(fā)芽率高0.04%，變化幅度高達(dá)3.09%。華石斛種子種皮致密，難以確定其吸脹所需時(shí)間，種子達(dá)到飽和，浸出可溶物，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)浸泡4 h的華石斛種子吸光值與發(fā)芽率相關(guān)性最高，而8～24 h相關(guān)性較低，說(shuō)明華石斛種子浸泡4 h左右時(shí)吸脹達(dá)到飽和，8～24 h后為過(guò)飽和，種子無(wú)氧呼吸對(duì)其產(chǎn)生毒害，使得浸出液吸光值與發(fā)芽率產(chǎn)生誤差。因此，在對(duì)活力精度要求不嚴(yán)格的情況下，采用UVS法測(cè)定種子活力比TTC法更快捷，且具有一定的可靠性。但目前為止還未見(jiàn)到將UVS法用于蘭科植物種子活力測(cè)定的研究，關(guān)于吸收值與華石斛種子活力相關(guān)性仍需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

TTC法測(cè)定華石斛種子活力具有更高的準(zhǔn)確度、可信度，可作為精確測(cè)定種子活力的優(yōu)選方法，但實(shí)驗(yàn)操作比UVS法繁雜，同時(shí)，為縮小其活力測(cè)定誤差，篩選出合適的次氯酸鈣溶度以及處理時(shí)間的研究亟待解決。UVS法測(cè)定華石斛活力誤差相對(duì)TTC法較高，但方法簡(jiǎn)便，操作易行，在精度要求不嚴(yán)格的情況下，可作為快速測(cè)定種子活力的優(yōu)選方法，同時(shí)，合適的浸泡時(shí)間對(duì)降低活力測(cè)定誤差的相關(guān)研究也很有必要。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄭光華， 顧增輝， 徐本美. 測(cè)定種子活力方法之探討（Ⅱ）發(fā)芽的生理測(cè)定法[J]. 種子， 1982， 18（3）： 11-17.

[2] 鄭光華. 我國(guó)種子生理研究的概況[J]. 植物學(xué)通報(bào)， 1983， 01： 14-19.

[3] Hirano T， Godo T， Miyoshi K， et al. Cryopreservation and low-temperature storage of seeds of Phaius tankervilleae[J]. Plant Biotechnology Reports， 2009， 3（1）： 103-109.

[4] Yamazaki J， Miyoshi K. In vitro asymbiotic germination of immature seed and formation of protocorm by Cephalanthera falcata （Orchidaceae）[J]. Annals of Botany， 2006， 98（6）： 1 197-1 206.

[5] Silva S S， Vieira R D， Grzybowski C R S， et al. Electrical conductivity of different common bean seeds genotypes[J]. Journal of Seed Science， 2013， 35（2）： 216-224.

[6] Moncaleano-Escandon J， Silva B C F， Silva S R S， et al. Germination responses of Jatropha curcas L. seeds to storage and aging[J]. Industrial Crops and Products， 2013， 44： 684-690.

[7] 石亞萍， 蔡靜平. 種子發(fā)芽率快速測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)種業(yè)， 2008， 02： 13-14.

[8] 田偉莉， 吳家森， 金水虎， 等. 3種蠟梅屬植物種子活力測(cè)定方法的比較[J]. 種子， 2008， 27（4）： 21-23.

[9] Pritchard H W. Determination of orchid seed viability using fluorescein diacetate[J]. PlantCell & Environment， 1985， 8（9）： 727-730.

[10] Gale S W， Yamazaki J， Hutchings M J， et al. Constraints on establishment in an endangered terrestrial orchid： a comparative study of in vitro and in situ seed germinability and seedling development in Nervilia nipponica[J]. Botanical Journal of the Linnean Society， 2010， 163（2）： 166-180.

[11] Batty A L， Dixon K W， Brundrett M， et al. Long-term storage of mycorrhizal fungi and seed as a tool for the conservation of endangered Western Australian terrestrial orchids[J]. Australian Journal of Botany， 2001， 49（5）： 619-628.

[12] Vujanovic V， St-Arnaud M， Barabé D， et al. Viability testing of orchid seed and the promotion of colouration and germination[J]. Annals of Botany， 2000， 86（1）： 79-86.

[13] 鄧娜娜， 杜康兮， 周志鵬， 等. 3種方法測(cè)定黑麥種子活力的比較研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 25： 12 410-12 411， 12 433.

[14]魯黎明， 葉科媛， 安 影， 等. 一種快速測(cè)定煙草種子活力的方法——紫外吸收分光光度法[J]. 種子， 2009， 08： 115-117.

[15] 羅毅波， 賈建生， 王春玲. 中國(guó)蘭科植物保育的現(xiàn)狀和展望[J]. 生物多樣性， 2003， 11（1）： 70-77.

[16] 姜昊穎. 海南特有蘭科植物華石斛共生萌發(fā)技術(shù)研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2011.

[17] 何明高. 海南蘭科植物種子生物學(xué)初步研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2010.

[18] Sharma A D， Rathore S V S， Srinivasan K， et al. Comparison of various seed priming methods for seed germination， seedling vigour and fruit yield in okra （Abelmoschus esculentus L. Moench）[J]. Scientia Horticulturae， 2014， 165： 75-81.

[19] Wang W Q， Liu S J， Song S Q， et al. Proteomics of seed development， desiccation tolerance， germination and vigor[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2015， 86： 1-15.

[20] 岳 媛. 杜鵑花屬植物種子育苗技術(shù)及耐熱性研究[D]. 南京： 南京林業(yè)大學(xué)， 2013.