宋潔　郭華春　李婉琳　姚超

摘要：【目的】分析國際馬鈴薯中心（CIP）引進的馬鈴薯品系與國內(nèi)資源的遺傳差異，為馬鈴薯遺傳資源的保存及育種利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā坷?4對SSR引物對從CIP引進的32份馬鈴薯品系與35份國內(nèi)資源進行聚類分析和主坐標分析。【結(jié)果】選取的14對引物目標條帶清楚，多態(tài)性高，多態(tài)信息量（PIC）變幅為83.70%～96.03%，平均為92.62%。所有供試材料的遺傳相似系數(shù)范圍為0.3167～0.8333，平均為0.5763；國內(nèi)材料的遺傳相似系數(shù)范圍為0.4833～0.7667，平均為0.5867。聚類分析結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)0.6000處可將試驗材料分為六大類，第一類和第二類均包括18份材料，主要為從CIP引進的馬鈴薯品系；第三類包括5份材料，包括CIP引進馬鈴薯品系1份（D172）和國內(nèi)馬鈴薯品種（系）4份（昆-3、云201、克疫85和紫云2號）；第四、五、六類分別包括7、10和8份材料，均為國內(nèi)馬鈴薯品種（系）。主坐標分析可將所有材料分為兩大類，第一類包括25份國內(nèi)馬鈴薯品種（系），第二類包括10份國內(nèi)馬鈴薯品種（系）和31份從CIP引進的馬鈴薯品系，其結(jié)果與相似性系數(shù)在0.5360處的聚類分析結(jié)果相符，可直觀反映馬鈴薯資源類群?！窘Y(jié)論】從CIP引進的馬鈴薯新品種（系）與國內(nèi)現(xiàn)有品種（系）遺傳距離較遠，可豐富國內(nèi)馬鈴薯種質(zhì)資源，有較高的應用潛力。

關鍵詞： 馬鈴薯；SSR分子標記；遺傳差異；聚類分析；主坐標分析

中圖分類號： S532 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）04-0567-07

Abstract：【Objective】In this study， genetic differences between potato strains introduced from International Potato Center（CIP） and domestic potato resources were analyzed， in order to provide reference for preservation and breeding of potato genetic resources. 【Method】Cluster analysis and principal coordinate analysis for 32 CIP potato strains and 35 domestic potato resources were conducted based on 14 SSR primer pairs. 【Result】The 14 primer pairs contained clear target bands and high polymorphism. Polymorphism information content（PIC） ranged from 83.70% to 96.03% and was 92.62% in average. Genetic similarity coefficient of all materials was 0.5763 in average， ranging from 0.3167 to 0.8333. Genetic similarity coefficient of domestic resources varied from 0.4833 to 0.7667， and averaged 0.5867. Cluster analysis indicated that the materials could be clustered into six groups by the similarity coefficient of 0.6000. Group Ⅰand Ⅱ contained 18 materials which were mainly potatoes introduced from CIP. Group Ⅲ was consistent of five materials， one CIP potato strain（D172） and four domestic varieties（strains）（Kun-3， Yun 201， Keyi 85 and Ziyun 2）. Group Ⅳ，Ⅴ and Ⅵ contained seven， ten and eight materials respectively and they were all domestic potato varieties（strains）. Principal coordinate analysis divided them into two groups， one contained twenty-five domestic potato varieties（strains） and the other contained ten domestic varieties（strains） and thirty-one PIC potato varieties（strains）. This result was in accordance with that when similarity coefficient was 0.5360， and could reflect the potato resource groups intuitively. 【Conclusion】The genetic distance between potato varieties（strains） introduced from CIP and domestic varieties（strains） is far. Therefore CIP potato varieties（strains） can enrich domestic potato resources and contain promising application potential.

Key words： potato； SSR molecular marker； genetic difference； cluster analysis； principal coordinate analysis

0 引言

【研究意義】云南省是我國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，但目前云南省馬鈴薯品種單一，缺乏優(yōu)質(zhì)新品種，引種是豐富種質(zhì)資源的有效途徑（梁武和張德亮，2015）。從馬鈴薯生長特性來看，短日低溫可促進結(jié)薯，若從北方長日照地區(qū)引種到南方短日照地區(qū)，對地下塊莖的生長會有一定影響（常志敏，2007）。國際馬鈴薯中心（CIP）作為世界馬鈴薯基因庫，保存有豐富的抗病基因資源，特別是抗晚疫病和抗青枯病系列，是云南馬鈴薯育種中急需得到的基因資源。CIP所在地秘魯與云南省的生態(tài)條件相似，因此從CIP引進馬鈴薯品系對云南的氣候環(huán)境有較好的適應性（楊萬林和隋啟君，2003），但在塊莖性狀、生育期、休眠期等性狀上存在明顯的缺點，難以直接廣泛應用于生產(chǎn)。通過品種改良和選育可讓CIP材料在云南馬鈴薯育種中發(fā)揮更高的價值，使云南馬鈴薯資源不斷豐富、品種選育的能力不斷提高（楊萬林和隋啟君，2005）。因此，研究從CIP引進馬鈴薯品系與國內(nèi)資源的遺傳差異，對馬鈴薯育種中的親本選配具有重要意義。【前人研究進展】近年來，分子標記已廣泛應用于各類作物遺傳差異分析。與其他分子標記相比，SSR分子標記具有高多態(tài)性、特異性強、分布廣和成本低等優(yōu)點，已成為遺傳作圖、種質(zhì)鑒定、基因定位、分子標記輔助選擇育種和遺傳差異分析常用的手段（Lan et al.，2012；Carputo et al.，2013；倪先林等，2015；陰云伙等，2015）。白建明等（2010）采用SSR分子標記對經(jīng)過超低溫保存后的馬鈴薯再生植株進行遺傳穩(wěn)定性檢測，結(jié)果表明再生植株的遺傳穩(wěn)定性未發(fā)生改變。李先平等（2012）利用3l對SSR引物區(qū)分了30份彩色馬鈴薯品種。石景等（2012）利用5對SSR核心引物構(gòu)建了50份彩色馬鈴薯品種的指紋圖譜。黃先群等（2014）利用9對SSR引物對12個引進品種、12個費烏瑞它自然和輻射變異材料進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，品種間的多態(tài)性和遺傳距離大于變異材料。Song等（2016）利用SSR分析192個馬鈴薯栽培品種的遺傳差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬鈴薯栽培品種遺傳基礎較狹窄，可利用引種等手段豐富馬鈴薯栽培種。【本研究切入點】雖然目前國內(nèi)外已有學者利用SSR分子標記對馬鈴薯遺傳差異進行較多研究，但將國內(nèi)馬鈴薯品種（系）與CIP品系結(jié)合起來共同分析遺傳差異的研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】以CIP引進的32份馬鈴薯新品系和35份國內(nèi)馬鈴薯品種（系）為材料，利用SSR分子標記分析其遺傳差異及親緣關系，以期為馬鈴薯遺傳資源的保存及育種利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料包括從CIP引進的32份馬鈴薯新品系和云南農(nóng)業(yè)大學薯類研究所提供的35份國內(nèi)馬鈴薯品種（系）（表1）。于2015年1月采集供試材料的組培苗，置于-80 ℃冰箱貯藏，以備提取基因組DNA。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 稱取約0.1 g組培苗，參照Moisan-Thiery等（2005）的方法提取基因組DNA，略有改進。將裝有組培苗的離心管加液氮后迅速研磨成粉末，立即加入65 ℃預熱的2% CTAB，提取緩沖液[1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.2% β-ME]1 mL，緩慢顛倒混勻后65 ℃水浴1 h；12000 r/min離心10 min后取上清液抽提，后續(xù)步驟繼續(xù)參照Moisan-Thiery等（2005）的方法。提取的DNA以2 μL 50 ng/μL λDNA為對照，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用1×TE稀釋至終濃度為50 ng/μL備用。

1. 2. 2 SSR分析 SSR反應體系和程序參照Ghislain等（2004）的方法。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，退火溫度退火45 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。擴增反應在Biometra PCR儀上進行，產(chǎn)物用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色。PCR引物來自公開發(fā)表的文獻（Ghislain et al.，2004；Feingold et al.，2005），從58對引物中選取14對多態(tài)性好的引物（表2），由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 3 統(tǒng)計分析

用數(shù)碼相機進行拍照，根據(jù)圖譜中條帶的有無，在相同遷移率位置上有帶的記為1，無帶的記為0，組成一個原始數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc 2.10e的SM系數(shù)法計算得到14對引物檢測的供試材料遺傳相似性系數(shù)。利用SAHN程序，采用UPGMA方法對SSR數(shù)據(jù)進行聚類分析，并通過Tree plot生成聚類分析圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SSR引物多態(tài)性分析結(jié)果

采用14對SSR引物對供試樣品進行擴增，其中引物sti024擴增結(jié)果見圖1。由表3可知，14對引物擴增產(chǎn)物的片段大小在78～250 bp，共擴增出60條多態(tài)性條帶，每對引物擴增的條帶數(shù)為3～6條不等，平均每對引物約擴增出4條。其中，引物sti053和sti033擴增出的條帶數(shù)最多，各有6條；引物stm13擴增出的條帶數(shù)最少，僅為3條。所有引物的多態(tài)性比率變幅為33.33%～100.00%，平均為66.38%；所有引物的多態(tài)信息量（PIC）變幅為83.70%～96.03%，平均為92.62%。

2. 2 聚類分析結(jié)果

通過NTSYS-pc 2.10e生成能顯示各品種（系）間遺傳關系的樹狀圖（圖2），結(jié)果表明，在0.6000處可將材料大致分為六大類：第一類共18份材料，包括14份從CIP引進的馬鈴薯品系和4份國內(nèi)馬鈴薯品種（系）（麗薯6號、青薯9號、尤金和宣薯2號）；第二類共18份材料，包括16份從CIP引進的馬鈴薯品系和2份國內(nèi)馬鈴薯品種（系）（大西洋、合作88）；第三類共5份材料，包括1份從CIP引進的馬鈴薯品系（D172）和4份國內(nèi)馬鈴薯品種（系）（昆-3、云201、克疫85和紫云2號）；第四、五、六類分別包括7、10和8份材料，全部為國內(nèi)馬鈴薯品種（系）。所有供試材料的遺傳相似系數(shù)范圍在0.3167～0.8333，平均為0.5763；國內(nèi)材料的遺傳相似系數(shù)范圍為0.4833～0.7667，平均為0.5867。由此可見，引進的新品系擴寬了國內(nèi)的遺傳相似性系數(shù)，豐富了國內(nèi)的種質(zhì)資源。

2. 3 主坐標分析結(jié)果

主坐標分析以品種間的相似性系數(shù)矩陣為依據(jù)，建立坐標系，不同品種（系）在主坐標圖中的位置可反映出品種（系）間的親緣關系，品種（系）間距離越近表明其遺傳相似性越大，親緣關系也越近，反之，則表明遺傳差異越大，親緣關系越遠（高山等，2007）。利用NTSYS-pc 2.10e，基于聚類分析計算出的遺傳相似系數(shù)，經(jīng)主坐標分析三維圖（圖3），可將供試材料分為兩大類，第一類是Dim-1坐標-0.44～-0.04范圍內(nèi)的25份國內(nèi)馬鈴薯品種（系），第二類是Dim-1坐標-0.04～0.35范圍內(nèi)的41份材料，包括10份國內(nèi)馬鈴薯品種（系）和31份從CIP引進的馬鈴薯品系。這一結(jié)果與相似性系數(shù)在0.5360處的聚類分析結(jié)果相符。說明主坐標分析可直觀反映馬鈴薯資源類群，但在雜交育種上還需依靠聚類分析結(jié)果和育種家的經(jīng)驗進行親本選配。

3 討論

本研究選用14對SSR分子標記對67份國內(nèi)外馬鈴薯品種（系）進行遺傳差異分析，在試驗中剔除了PCR擴增目標條帶不穩(wěn)定、多態(tài)性不高的引物后，最終選用的SSR引物目標條帶清晰、多態(tài)性好且PIC大于50.00%。Botstein等（1980）研究表明，引物為高度多態(tài)性的條件是PIC大于50.00%，且PIC接近于100.00%的位點是試驗所需。本研究中PIC最小值為83.70%，滿足上述條件，說明選取的引物均為高度多態(tài)性引物，具有代表性，能更好地反映供試品系的遺傳差異水平。其中sti004位點的PIC為96.03%，與劉文林等（2016）研究發(fā)現(xiàn)sti004位點上表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，可用于俄羅斯馬鈴薯品種遺傳多樣性檢測的結(jié)論一致。

目前，我國四川、貴州、青海、甘肅、內(nèi)蒙古等地的馬鈴薯種質(zhì)資源均缺乏，種質(zhì)的遺傳多樣性均不高（滕長才等，2009；李飛等，2010；唐銘霞等，2010；顏謙等，2016）。本研究引進的32份CIP馬鈴薯品系可擴寬國內(nèi)遺傳相似性系數(shù)范圍，解決長期以來國內(nèi)馬鈴薯資源遺傳基礎狹窄的問題，與劉文林等（2016）的研究結(jié)果基本一致；且從聚類分析圖上看，在0.5360處，31份CIP材料聚為一類，另外10份雖為國內(nèi)馬鈴薯品種，但探究其親緣關系不難發(fā)現(xiàn)，其父母本之一也是CIP品系（如合作88的親本之一是CIP品系），該現(xiàn)象進一步證實了聚類分析結(jié)果的可靠性。在引進的32份材料中有一份材料較特殊，為D164，該材料單獨聚在一個分支，出現(xiàn)這一現(xiàn)象還需進一步研究。32份從CIP引進的馬鈴薯品系與國內(nèi)部分品種（系）遺傳距離較遠，親緣關系也較遠，從育種上看，引進的品系可與國內(nèi)品種（系）作親本進行雜交，選育優(yōu)良后代，且在今后的研究中可選擇從CIP引進的32份馬鈴薯新品系和35份國內(nèi)馬鈴薯品種（系）作為親本進行雜交，以進一步驗證材料的遺傳穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

從CIP引進的馬鈴薯新品系與國內(nèi)現(xiàn)有馬鈴薯品系遺傳距離較遠，可豐富國內(nèi)馬鈴薯種質(zhì)資源，有較高的應用潛力。

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（責任編輯 羅 麗）